本發(fā)明屬于多肽，具體涉及一種從青稞蛋白中鑒定肽的方法。

背景技術(shù)：

1、高血壓被定義為持續(xù)性升高的血管壓力(≥140/90mmhg)，升高的血壓主要由腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(raas)調(diào)控[1]，其中，血管緊張素i轉(zhuǎn)化酶(ace)通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的平衡發(fā)揮作用。ace是一種特定的金屬肽酶，催化血管緊張素i轉(zhuǎn)化為血管緊張素ii[2]。血管緊張素ii的生成促進(jìn)醛固酮的合成和釋放，進(jìn)一步引起血管收縮并增加血壓[3]。因此，有效抑制ace的物質(zhì)可能有助于緩解高血壓。盡管已經(jīng)開發(fā)出多種ace抑制劑，如卡托普利、賴諾普利、拉米普利和依那普利，但這些合成藥物可能對人類健康產(chǎn)生不良影響，包括頭痛、哮喘和可逆性腎功能障礙。因此，探索天然、安全、健康和經(jīng)濟(jì)的降壓藥物的潛力顯得尤為重要。先前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多食品來源的物質(zhì)含有降壓活性成分，包括肽、多酚和多糖。降壓肽的高產(chǎn)率、多樣性以及無副作用使其成為日益受到關(guān)注的研究重點。

2、高原大麥(hb，hordeum?vulgare?l.var.nudum?hook.f.)，亦稱青稞，是中國的一種獨特谷物，廣泛種植于中國西部的青藏高原地區(qū)。與傳統(tǒng)谷物如高粱、小麥和大米相比，hb以其高蛋白、β-葡聚糖、黃酮、維生素、微量元素(鋅和硒)和膳食纖維的含量而著稱。研究顯示，hb酒液中的活性肽具有ace抑制活性[4]。然而，關(guān)于hb水解肽的ace抑制作用的研究仍然有限，需進(jìn)一步探討。此外，谷物相關(guān)的肽研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，包括缺乏高通量篩選技術(shù)以精確識別降壓肽、傳統(tǒng)分離和純化方法的局限性導(dǎo)致有效降壓肽的遺漏、對已識別的降壓肽與ace之間結(jié)合相互作用的探索不足，以及對其降壓特性背后多靶點機制的模糊理解。機器學(xué)習(xí)能夠分析大量數(shù)據(jù)并選擇最合適的算法以進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。這一優(yōu)勢使得對肽的降壓特性進(jìn)行高通量評估成為可能，從而縮小實驗驗證的范圍。

3、參考文獻(xiàn)

4、[1]te?riet?l,van?esch?jhm,roks?ajm,van?den?meiracker?ah,danserahj.hypertension.circulation?research?2015；116:960–75.https://doi.org/10.1161/circresaha.116.303587.

5、[2]lee?jh,kim?t-k,yong?hi,cha?jy,song?k-m,lee?hg,et?al.peptidesinhibiting?angiotensin-i-converting?enzyme:isolation?from?flavourzymehydrolysate?of?protaetia?brevitarsis?larva?protein?and?identification.foodchemistry?2023；399:133897.https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133897.

6、[3]rosendorff?c.the?renin-angiotensin?system?and?vascularhypertrophy.journal?of?the?american?college?of?cardiology?1996；28:803–12.https://doi.org/10.1016/s0735-1097(96)00251-3.

7、[4]yin?z,yan?r,jiang?y,feng?s,sun?h,sun?j,et?al.identification?ofpeptides?in?qingke?baijiu?and?evaluation?of?its?angiotensin?converting?enzyme(ace)inhibitory?activity?and?stability.food?chemistry?2022；395:133551.https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133551.

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明提出一種青稞蛋白來源的降壓肽。

2、本發(fā)明的第二個目的是提出一種從青稞中提取并鑒定降壓肽的方法，通過酶解獲得青稞蛋白，通過機器學(xué)習(xí)從青稞蛋白中篩選并鑒定降壓肽，結(jié)合肽組學(xué)與機器學(xué)習(xí)技術(shù)，以從hb蛋白中識別降壓肽。

3、實現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案為：

4、一種青稞蛋白來源的降壓肽，所述青稞蛋白來源的降壓肽的氨基酸序列為如下序列中的一種或多種：

5、fprpf，pesff，apffs，fprpfl，pllfp，epflpf，rapff，effpig，apffsl，lpfpq，

6、所述降壓肽提取自青稞。

7、一種從青稞中提取并鑒定降壓肽的方法，包括以下步驟：

8、s1構(gòu)建數(shù)據(jù)庫：使用公共肽數(shù)據(jù)庫，收集非重復(fù)的經(jīng)實驗驗證的抗高血壓肽；

9、s2機器學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練：采用機器學(xué)習(xí)模型，對蛋白質(zhì)-肽活性進(jìn)行預(yù)測；所述機器學(xué)習(xí)模型為gbdt(梯度提升決策樹)，用s1中收集得到的特定數(shù)據(jù)集對所述及其學(xué)習(xí)模型進(jìn)行訓(xùn)練；機器學(xué)習(xí)模型特征表示中采用的特征包括pseaac(偽氨基酸組成)，pseaac采用“類型2”；

10、s3模型評估：在評估階段采用五折交叉驗證方法對模型進(jìn)行訓(xùn)練，使用五個關(guān)鍵性能指標(biāo)來定量評估模型的預(yù)測能力，所述關(guān)鍵性能指標(biāo)為準(zhǔn)確率(accuracy)，召回率(recall)，精確率(prec)，f1分?jǐn)?shù)(f1)和roc曲線。

11、s4青稞脫脂粉和青稞蛋白(hbp)的制備：青稞研磨后，與有機溶劑混合，經(jīng)過干燥即得青稞脫脂粉；所述有機溶劑為正己烷、丁烷、乙二醇、石油醚、乙酸乙酯中的一種或多種；

12、青稞脫脂粉與水混合，調(diào)節(jié)ph為10～12，在50～70℃下加熱后離心，收集上清液；上清液調(diào)節(jié)ph為4～5，離心并丟棄上清液；將所得粗提物透析，透析液離心，沉淀出純化的hbp；

13、s5?hbp水解物的制備：使用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種或多種對hbp進(jìn)行水解，水解的ph為2.0～8.0，溫度為35～65℃，水解時間5～8小時；

14、s6血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的測定：測定步驟s5所得產(chǎn)物的ace抑制活性，并選出具有較高的ace抑制活性的肽段的分子量范圍；

15、s7通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-ms/ms)鑒定肽序列；

16、s8肽序列的計算機預(yù)測和候選肽ic50值的測定：步驟s7的肽的測序結(jié)果被應(yīng)用于gbdt模型以預(yù)測ace抑制活性。對生物活性肽進(jìn)行計算虛擬篩選是一種快速有效的方法，可以驗證每個肽的生物活性。

17、可選地，步驟s2中，描述中氨基酸相關(guān)性的權(quán)重因子設(shè)置為0.05。

18、λ值設(shè)置為1。

19、在本研究中，由于“類型2”描述能夠突出連續(xù)氨基酸的互操作性，因此被采用。λ值設(shè)置為1，以考慮氨基酸的相鄰性。此外，還可使用25℃下α-羧基和氨基組的pka值和等電點來評估氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)。

20、步驟s3中，準(zhǔn)確率(accuracy)是衡量模型正確預(yù)測所有樣本的能力的直接指標(biāo)。召回率(recall)是模型正確識別為陽性的實際陽性樣本的比例。精確率(prec)定義為模型預(yù)測為陽性的樣本中實際陽性病例的百分比。f1分?jǐn)?shù)(f1)是精確率和召回率的調(diào)和平均數(shù)，作為模型整體性能的單個指標(biāo)。roc曲線顯示了模型在不同閾值下真正例率和假正例率之間的權(quán)衡。auc(roc曲線下的面積)提供了一個可量化的度量，表示模型將隨機選擇的正例排名高于負(fù)例的可能性。通過整合這些指標(biāo)，我們可以全面評估和比較模型的性能。

21、優(yōu)選地，步驟s3中，步驟s1收集的數(shù)據(jù)被分為五個子集，其中四個子集用于訓(xùn)練，剩下的一個子集用于測試。這個過程重復(fù)五次，每次迭代選擇一個不同的測試集，以確保每個數(shù)據(jù)點都被測試。模型使用批量梯度下降法進(jìn)行訓(xùn)練，最優(yōu)設(shè)置通過網(wǎng)格搜索優(yōu)化方式確定。

22、其中，步驟s4中，將青稞脫脂粉與水按1:20～30的質(zhì)量比例混合，并將溶液的ph值調(diào)整至11，隨后，將混合物在55～65℃下加熱25～35分鐘，然后以5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10～15分鐘，收集上清液；將液體的ph值調(diào)整至4.5，再次以5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心15～30分鐘，丟棄上清液，沉淀為粗提物；重復(fù)此過程2～4次，以確保蛋白質(zhì)完全純化。

23、其中，步驟s4中，然后，將粗提物與蒸餾水混合制成懸浮液，進(jìn)行20～30小時的透析；最后，將透析液以5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10～30分鐘，沉淀出純化的hbp。透析袋孔徑可以為5～10kda。

24、更優(yōu)選地，步驟s5中，使用木瓜蛋白酶對hbp進(jìn)行水解，水解的ph為6～7，溫度為58～62℃，水解時間5～7小時。；和/或

25、將水解產(chǎn)物進(jìn)一步分離：水解所得產(chǎn)物用超濾離心管離心，把水解產(chǎn)物先通過10kda的濾膜過濾，再將過10kda濾膜所得溶液經(jīng)過3kda的超濾膜過濾，得到三種不同分子量范圍的分離物。即，三個不同分子量范圍的分離物：<3kda、3～10kda和>10kda。

26、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案之一為，步驟s7中，選擇<3kda分子量范圍的分離物用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-ms/ms)鑒定肽序列。

27、本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選技術(shù)方案為，步驟s8中，首先初步篩選：結(jié)合denovo評分、肽活性排名和gbdt預(yù)測評分進(jìn)行篩選，獲得候選肽；然后第二輪篩選：第二輪篩選的評價指標(biāo)是選擇肽段長度在3-8個氨基酸之間的肽；第三輪篩選：以分子對接作為篩選程序，結(jié)合能作為相互作用強度的度量。

28、分子對接作為篩選程序，用于模擬ace抑制肽與ace之間的相互作用。結(jié)合能作為相互作用強度的度量，提供了肽與蛋白質(zhì)結(jié)合親和力的見解。

29、更優(yōu)選地，步驟s9中，步驟s9中，通過選擇denovo評分大于90％、gbdt預(yù)測評分大于50且肽活性排名評分大于0.8的肽，獲得候選肽；第二輪篩選：第二輪篩選的評價指標(biāo)是選擇肽段長度在3-8個氨基酸之間的肽，并將來源未知的肽序列刪除；第三輪篩選：結(jié)合能≤-8.0kcal/mol且綜合評分排名前10的肽被識別，

30、第二輪篩選中，評價指標(biāo)是選擇肽段長度在3-8個氨基酸之間的肽，并且確保這些能水解出的這些肽序列的蛋白信息能在uniprot上查到，將來源未知的肽序列刪除。

31、本發(fā)明提出的又一優(yōu)選技術(shù)方案為，人工合成步驟s8預(yù)測序列的肽。測試合成肽的物理化學(xué)性質(zhì)和半抑制濃度(ic50)值；優(yōu)選選擇最低半抑制濃度的肽合成，研究其生物化學(xué)性能。

32、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

33、本發(fā)明提出的青稞蛋白來源的降壓肽，據(jù)我們所知，這是首次從青稞(hb)中挖掘抗高血壓肽，本降壓肽顯示出高效的ace抑制效果。在我們的研究中，fprpfl和apffs的ic50值分別為1.18μm和23.12μm，這表明它們具有比目前已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)ace抑制肽更好的顯著ace抑制效果。

34、本發(fā)明通過機器學(xué)習(xí)從青稞蛋白中篩選并鑒定降壓肽，采用多種酶解方法來確定青稞蛋白原料的最佳酶解條件；通過肽組學(xué)技術(shù)，從顯示最顯著抑制效應(yīng)的水解產(chǎn)物中獲取肽信息。采用機器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行潛在降壓肽的綜合高通量篩選。隨后，利用計算分析和分子對接進(jìn)一步篩選肽，評估表現(xiàn)出最強ace抑制活性的肽的ic50、抑制模式和穩(wěn)定性本技術(shù)提出的的方法將有助于系統(tǒng)性研究食品來源的ace肽。這一創(chuàng)新方法不僅降低了發(fā)現(xiàn)生物活性肽所需的成本和時間，還全面評估了ace抑制肽的功能。

35、通過采用分子對接、分子動力學(xué)模擬和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對所識別的降壓肽進(jìn)行研究，建立了快速篩選和挖掘ace抑制肽的策略。

36、本提取鑒定方法不僅簡化了ace抑制肽的發(fā)現(xiàn)過程，使其成為一種經(jīng)濟(jì)高效的預(yù)測管道，而且具有實際應(yīng)用價值，有利于食品來源生物活性肽的大規(guī)模生產(chǎn)和制備，并促進(jìn)其商業(yè)化生產(chǎn)。