本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、硫化氫(h2s)和一氧化碳(co)是氣體治療的重要?dú)怏w信號分子，這兩種氣體信號分子在人體內(nèi)有重要的生理作用，與許多疾病息息相關(guān)，它們在哺乳動物細(xì)胞中由酶催化合成產(chǎn)生，是具有獨(dú)特信號響應(yīng)的內(nèi)源性氣體信號分子，廣泛參與生物體內(nèi)各種生理病理活動的調(diào)節(jié)。

2、內(nèi)源性h2s在心血管系統(tǒng)中，具有舒張血管平滑肌、降低血壓、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡、抑制血管平滑肌細(xì)胞(vsmcs)增殖等多種生物學(xué)效應(yīng)。h2s也可抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，參與維持肺血管正常結(jié)構(gòu)，對于肺循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的調(diào)節(jié)作用；增加抗氧化劑谷胱甘肽水平、抑制和清除神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種氧化性物質(zhì)等，具有廣泛的生理作用。

3、co在心血管系統(tǒng)中，可導(dǎo)致頸動脈、股動脈和冠狀動脈等的平滑肌舒張，還可調(diào)節(jié)阻力血管口徑。此外，co在參與對中樞心血管活動的調(diào)節(jié)中，能加強(qiáng)減壓反射，使血壓下降、心率減慢；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理和病理過程中，co是公認(rèn)的神經(jīng)信使。其來源并不僅僅局限于血液循環(huán)，外周神經(jīng)組織產(chǎn)生的血紅素亞單位亦可到達(dá)并通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，在局部ho的作用下產(chǎn)生co。co的神經(jīng)信使作用不僅涉及包括學(xué)習(xí)和記憶過程、脊髓神經(jīng)痛覺傳遞、嗅覺受體神經(jīng)的發(fā)育及其功能、頸動脈化學(xué)感受活性的調(diào)節(jié)和自主神經(jīng)加壓調(diào)節(jié)的抑制等機(jī)制，還涉及括約肌松弛、激素釋放等過程。

4、由于h2s與co這兩種氣體都有在心血管方面的作用，因此研究兩種氣體在疾病中的協(xié)同作用，對疾病的發(fā)生、預(yù)防、治療都具有十分重要的意義。氣體信號分子在生物研究甚至疾病治療中無法直接使用。為了研究h2s與co在人體內(nèi)的氣體治療作用，需要?dú)怏w分子供體作為研究基礎(chǔ)，在生物體系內(nèi)原位釋放相關(guān)氣體。為了研究h2s與co在人體內(nèi)的氣體治療作用，需要?dú)怏w分子供體作為研究基礎(chǔ)，目前已報道的h2s供體和co供體，如：硫化氫供體gyy?4137、adt-oh；一氧化碳供體corms等，都是單氣體分子供體，在實際的生物過程中，往往會有多種氣體共同作用，因此單一供體難以滿足研究、治療需要；目前，市售的供體大多數(shù)為自發(fā)性供體，缺乏有效地控制，而在研究領(lǐng)域中所開發(fā)出一些可控釋放氣體信號分子的供體，在實際應(yīng)用上還需要使用其他分析手段對氣體進(jìn)行分析，如紫外法、esr法等，這些分析方法都會造成生物樣本的破壞。

5、針對目前所出現(xiàn)的技術(shù)問題，急切需要開發(fā)一種新型的雙氣體分子供體，可以同時或分別可控釋放h2s和co，同時在實際使用過程中可有效地對產(chǎn)生的氣體信號進(jìn)行檢測，并不會對生物樣本產(chǎn)生破壞。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種制備方法簡單的可控釋放硫化氫及一氧化碳的雙氣體供體，該供體能在生物體系內(nèi)可控釋放兩種氣體并給出熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)控，無需破壞生物樣品，能夠成為一種有力的分子工具。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

2、一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，包括以下步驟：

3、s1.將天然產(chǎn)物黃酮醇(cod)溶于15ml干燥的四氫呋喃中，得到含有cod的四氫呋喃混合液1；

4、s2.將步驟s1所述的混合液1在0℃下劇烈攪拌，并緩慢加入15ml含有硫光氣的二氯甲烷混合溶液，并在冰浴下持續(xù)攪拌反應(yīng)1h；待混合液溫度恢復(fù)到室溫后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，得到混合液2；

5、s3.將步驟s2中所述的混合液2重新置于0℃的冰浴中，加入苯基格氏試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液溫度逐漸恢復(fù)至室溫后，利用tlc監(jiān)控反應(yīng)的終點(diǎn)；

6、s4.待步驟s3所述反應(yīng)液反應(yīng)完成后，加入過量飽和氯化銨溶液淬滅格氏試劑，利用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，取有機(jī)相合并，旋干，得到固體混合物；

7、s5.將步驟s4所得到的固體混合物利用柱層析法進(jìn)行分離和提純，最終得到得到黃色熒光供體。

8、進(jìn)一步地，步驟s1中所述的天然產(chǎn)物黃酮醇(cod)的添加量為300mg。

9、進(jìn)一步地，步驟s2中所述的含有硫光氣的二氯甲烷混合溶液中硫光氣的添加量為180mg。

10、進(jìn)一步地，步驟s3中所述的苯基格氏試劑為3-甲氧基苯基溴化鎂，溴化3,4-(甲二氧基)苯基鎂，4-氟苯基溴化鎂中的一種。

11、進(jìn)一步地，步驟s3中所述的苯基格氏試劑的添加量為為3～5倍當(dāng)量。

12、進(jìn)一步地，步驟s3中所述的利用tlc監(jiān)控反應(yīng)的終點(diǎn)的方法為取適量反應(yīng)液，加入水將反應(yīng)進(jìn)行淬滅，取混合液點(diǎn)至tlc板，吹風(fēng)筒吹干溶劑，利用展開劑為二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇為20：1進(jìn)行展開，觀察到cod的點(diǎn)消失，反應(yīng)出現(xiàn)的新點(diǎn)不在增加。

13、進(jìn)一步地，步驟s4中所述的柱層析法進(jìn)行分離和提純的條件為利用400目硅膠，分離相為二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇＝30：1，加壓過柱。

14、進(jìn)一步地，該供體可控釋放兩種氣體信號分子并給出熒光信號變化，用于實時監(jiān)控氣體的釋放：在半胱氨酸存在下，釋放硫化氫，并產(chǎn)生紅色的增強(qiáng)型熒光；隨后在藍(lán)光照射下，釋放一氧化碳，紅色熒光信號逐漸減弱。

15、本發(fā)明的另一目的在于提供一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體在生物樣本檢測中的應(yīng)用。

16、結(jié)合上述的所有技術(shù)方案，本發(fā)明所具備的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

17、(1)本申請通過一鍋法合成可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體，反應(yīng)簡單、經(jīng)濟(jì)，有利于大規(guī)模推廣和應(yīng)用。

18、(2)合成的化合物hsco作為硫化氫與一氧化碳的雙氣體分子供體本身無熒光信號，加入半胱氨酸反應(yīng)后可釋放出h2s并生成化合物cod，該化合物cod可在溶液中生成具有熒光信號的產(chǎn)物，因此通過檢測溶液中化合物cod的熒光信號強(qiáng)度的增強(qiáng)，即可判斷出h2s的生成量；化合物cod作為一氧化碳的氣體分子供體本身具有熒光信號，經(jīng)過一定波長的光照射后可釋放出co，因此，通過檢測溶液中化合物cod的熒光信號強(qiáng)度的減弱，即可判斷出co的生成量。

19、(3)由于該雙氣體分子供體hsco在體內(nèi)與在半胱氨酸的存在下先釋放出硫化氫，同時生成cod，并在410nm波長的光照射下后釋放出一氧化碳。在同時存在半胱氨酸和光照的條件下，也能同時釋放h2s和co。通過用h2s熒光探針與co熒光探針測定反應(yīng)產(chǎn)物，可證明供體hsco釋放出了h2s和co，與現(xiàn)有的h2s供體和co供體相比，雙氣體分子供體hsco可由一個分子結(jié)構(gòu)同時釋放h2s和co，并且可通過檢測cod的熒光信號強(qiáng)度來判斷h2s和co的釋放過程，實現(xiàn)了該雙氣體分子供體的可視并且可控釋放。因此供體能在生物體系內(nèi)可控釋放兩種氣體并給出熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)控，無需破壞生物樣品，能夠成為一種有力的分子工具。

技術(shù)特征：

1.一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s1中所述的天然產(chǎn)物黃酮醇(cod)的添加量為300mg。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s2中所述的含有硫光氣的二氯甲烷混合溶液中硫光氣的添加量為180mg。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s3中所述的苯基格氏試劑為3-甲氧基苯基溴化鎂，溴化3,4-(甲二氧基)苯基鎂，4-氟苯基溴化鎂中的一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s3中所述的苯基格氏試劑的添加量為3～5倍當(dāng)量。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s3中所述的利用tlc監(jiān)控反應(yīng)的終點(diǎn)的方法為取適量反應(yīng)液，加入水將反應(yīng)進(jìn)行淬滅，取混合液點(diǎn)至tlc板，吹風(fēng)筒吹干溶劑，利用展開劑為二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇為20：1進(jìn)行展開，觀察到cod的點(diǎn)消失，反應(yīng)出現(xiàn)的新點(diǎn)不在增加。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備方法，其特征在于：步驟s4中所述的柱層析法進(jìn)行分離和提純的條件為利用400目硅膠，分離相為二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇＝30：1，加壓過柱。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7所述的方法制備的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體，其特征在于：該供體可控釋放兩種氣體信號分子并給出熒光信號變化，用于實時監(jiān)控氣體的釋放：在半胱氨酸存在下，釋放硫化氫，并產(chǎn)生紅色的增強(qiáng)型熒光；隨后在藍(lán)光照射下，釋放一氧化碳，紅色熒光信號逐漸減弱。

9.一種權(quán)利要求8所述的一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體在生物樣本檢測中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種可控釋放硫化氫及一氧化碳的熒光供體的制備及應(yīng)用，將化合物COD溶于干燥的THF中，緩慢加入含有硫光氣的DCM溶液,并劇烈攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)液至于冰浴當(dāng)中，加入苯基格氏試劑,冰浴下反應(yīng)1小時，反應(yīng)逐漸恢復(fù)至室溫后，利用TLC監(jiān)控反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后加入過量飽和氯化銨溶液淬滅格氏試劑，利用DCM萃取反應(yīng)液三次，取有機(jī)相合并，旋干，利用柱層析法得到黃色固體HSCO。本申請用簡易的方法獲得一種雙氣體供體，并且該供體能在生物體系內(nèi)可控釋放兩種氣體并給出熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)控，無需破壞生物樣品，能夠成為一種有力的分子工具。

技術(shù)研發(fā)人員：張子謙,李力,林珍梅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5