本發(fā)明屬于水稻誘變育種和基因型檢測。本發(fā)明具體涉一種鑒定水稻鎘砷積累等位基因的特異性分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、重金屬鎘、類金屬砷是毒性較強(qiáng)的兩種化學(xué)元素。然而，由于鎘砷在土壤中具有相反的地球化學(xué)行為，導(dǎo)致稻米中鎘砷濃度呈負(fù)相關(guān)。目前，大量研究集中在通過改良水分管理、施用土壤改良劑等措施來同步降低籽粒的鎘砷含量。

2、農(nóng)田土壤中鎘砷的阻控主要遵循改變鎘砷在土壤中的賦存形態(tài)，降低其生物有效性；降低鎘砷元素在土壤中的濃度或總量等原則。目前適用于大田應(yīng)用的主要方法包括水分管理、客土法、鈍化技術(shù)、植物修復(fù)技術(shù)、葉面阻控技術(shù)等。利用不同水分條件下，鎘砷對土壤ph和氧化還原電位eh等條件的響應(yīng)差異，來降低土壤鎘和砷的生物有效性，該技術(shù)操作簡便，成本低廉，但大田中的ph和eh條件不易精準(zhǔn)控制，難以同時降低鎘砷的生物有效性。采用覆蓋表層污染土壤或稀釋污染土壤的客土法，能顯著降低水稻中鎘和砷含量，但該方法生產(chǎn)潔凈且類型相似的土源需要培肥，成本高昂。鈍化技術(shù)通過改變土壤ph值、eh條件和根際微生物反應(yīng)等條件來改變鎘和砷的賦存形態(tài)，降低其生物有效性，具有適用于實際大面積污染農(nóng)田修復(fù)的特點。但該技術(shù)需要篩選同步鈍化劑，新型鈍化材料成本相對較高，且存在潛在環(huán)境影響。利用蜈蚣草等超(高)累積植物吸取土壤中鎘和砷等重金屬，能直接減小土壤中鎘和砷的含量，被公認(rèn)為是無二次污染的環(huán)境友好型方法，但該方法耗時長，缺乏修復(fù)植物的后續(xù)處置。因此，在鎘砷復(fù)合污染農(nóng)田中，通過大田管理和修復(fù)很難實現(xiàn)同時降低水稻籽粒中鎘和砷積累的目標(biāo)。

3、重金屬元素低積累水稻品種的選育可有效降低水稻籽粒重金屬污染風(fēng)險，實現(xiàn)重金屬污染土地上的水稻安全生產(chǎn)?；谒咀蚜７e累鎘砷分子機(jī)制的研究基礎(chǔ)，陸續(xù)有單一的低鎘和低砷積累水稻材料被報道。有研究通過crispr/cas9技術(shù)敲除osnramp5、oslct1或osccx2，并通過camv?35s啟動子過量表達(dá)oshma3，培養(yǎng)出了低鎘積累的水稻栽培品種；ishikawa和cao等利用化學(xué)誘變技術(shù)分別創(chuàng)制了粳稻和秈稻低鎘積累種質(zhì)資源。與鎘相比，砷低積累水稻育種的報道相對較少。蜈蚣草的pvacr3基因被導(dǎo)入到水稻中異源表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻品種的籽粒中無機(jī)砷含量下降26.0～46.0％；包含兩種不同液泡隔離基因(scycf1和osabcc1)和細(xì)菌γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出糙米中砷積累量減少70％。但目前大多品種的篩選培育僅以單一重金屬低累積為目標(biāo)，很難獲得鎘和砷同時低積累的水稻種質(zhì)資源，以滿足鎘砷復(fù)合污染地區(qū)的種植需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述難題，本發(fā)明的目的是提供一種鑒定水稻鎘砷積累等位基因的特異性分子標(biāo)記及應(yīng)用。該方法具有簡便、快速、高通量的特點，為借助分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行鎘砷低積累性狀改良提供技術(shù)支撐。

2、為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種鑒定水稻鎘砷積累等位基因的特異性分子標(biāo)記，以日本晴水稻的基因組為參考基因組，第4號染色體的第31511987的位置，由野生型的c突變?yōu)閠，該snp分子標(biāo)記的多態(tài)性為c/t；突變體使osabcc1基因的翻譯產(chǎn)物在第372-382個氨基酸發(fā)生缺失和改變，并在第383個氨基酸處翻譯提前終止。

4、一種用于檢測所述特異性分子標(biāo)記的組合引物，包括兩條特異性引物序列：hca-f:5’-ctcaagatagccatgggagt-3’，如seq?id?no.1所示；

5、hca-r:5’-ctgcagtcactgggtgtt-3’，如seq?id?no.2所示。

6、所述組合引物，利用所述組合引物以水稻基因組進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到片段長度為201bp，如seq?id?no.3所示。

7、一種鑒定水稻鎘砷積累差異的方法，包括以下步驟：

8、(1)ctab法提取待測水稻基因組dna，并以其為模板，利用權(quán)利要求2中所述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

9、(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段的第120bp處堿基的種類，若堿基種類為t，則待測水稻為砷鎘高積累水稻，若堿基種類為c，則待測水稻不是鎘砷高積累水稻。

10、所述的方法，步驟(1)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以10μl計為：1μl模板dna，烘干后加入100μm的引物hca-f和引物hca-r各0.5μl，2×mix?5μl,ddh2o?3μl。

11、所述的方法，步驟(1)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃低溫保存10min。

12、含有所述引物對的輔助鑒定水稻籽粒鎘砷積累差異基因osabcc1的試劑盒。

13、含有所述引物對或所述試劑盒在水稻籽粒鎘砷積累種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明利用突變體的鎘砷高積累表型鑒定到參與鎘砷積累基因osabcc1?atg下游第2261核苷酸序列處snp，設(shè)計開發(fā)了一種特異性分子標(biāo)記。(2)利用該分子標(biāo)記，本發(fā)明只需通過簡單的pcr和測序即可完成對osabcc1的基因分型，在水稻未結(jié)實前同時預(yù)測籽粒中鎘砷含量差異。(3)檢測方法操作簡便，鑒定周期短、成本低，可更好地服務(wù)水稻鎘砷積累差異品種的篩選和改良，為解決同時降低鎘砷復(fù)合污染農(nóng)田中水稻籽粒中鎘砷含量的難題提供技術(shù)支撐。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定水稻鎘砷積累等位基因的特異性分子標(biāo)記，其特征在于，以日本晴水稻的基因組為參考基因組，第4號染色體的第31511987的位置，由野生型的c突變?yōu)閠，該snp分子標(biāo)記的多態(tài)性為c/t；突變體使osabcc1基因的翻譯產(chǎn)物在第372-382個氨基酸發(fā)生缺失和改變，并在第383個氨基酸處翻譯提前終止。

2.一種用于檢測根據(jù)權(quán)利要求1所述特異性分子標(biāo)記的組合引物，其特征在于，包括兩條特異性引物序列：

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述組合引物，其特征在于，利用所述組合引物以水稻基因組進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到片段長度為201?bp，如seq?id?no.3所示。

4.一種鑒定水稻鎘砷積累差異的方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（1）中pcr擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以10?μl計為：1?μl模板dna，烘干后加入100?μm的引物hca-f和引物hca-r各0.5?μl，2×mix5?μl,?ddh2o?3μl。

6.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（1）pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95?℃預(yù)變性3?min，95?℃變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸40?s，循環(huán)30次，最后72?℃延伸10min，產(chǎn)物4?℃低溫保存10?min。

7.含有根據(jù)權(quán)利要求2所述引物對的輔助鑒定水稻籽粒鎘砷積累差異基因osabcc1的試劑盒。

8.含有根據(jù)權(quán)利要求2所述引物對或權(quán)利要求7所述試劑盒在水稻籽粒鎘砷積累種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于分子標(biāo)記技術(shù)鑒定調(diào)控水稻鎘砷積累等位基因ABCC1基因及應(yīng)用。該分子標(biāo)記以日本晴水稻的基因組為參考基因組，第4號染色體的第31511987的位置，由野生型的C突變?yōu)門，該SNP分子標(biāo)記的多態(tài)性為C/T；突變體使OsABCC1基因的翻譯產(chǎn)物在第372?382個氨基酸發(fā)生缺失和改變，并在第383個氨基酸處翻譯提前終止。本發(fā)明還提供了設(shè)計的特異性引物對和檢測方法。本發(fā)明可減少培育鎘砷低積累的工作成本和培育周期，具有簡便、快速等優(yōu)點。本發(fā)明也可用于高效預(yù)測不同水稻品種籽粒的鎘砷積累特性和鎘砷低積累品種的資源篩選鑒定。

技術(shù)研發(fā)人員：楊歡,陳銘學(xué),牟仁祥,曹趙云
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國水稻研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5