本發(fā)明涉及生物，具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型的構(gòu)建方法。進一步地，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型和sgrna。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，雪貂作為一種高等哺乳動物，因其與人類器官相似的解剖結(jié)構(gòu)、代謝途徑和生理特征，以及對多種人類病原體的敏感性，已逐漸成為重要的實驗動物模型。近年來，雪貂模型在多個研究領(lǐng)域，包括大腦發(fā)育、神經(jīng)功能、脊髓損傷、癲癇、心臟疾病、免疫系統(tǒng)功能、肥胖癥、腫瘤學、以及包括慢性阻塞性肺病、肺囊腫、肺纖維化、肺癌在內(nèi)的多種肺部疾病的研究中，展現(xiàn)了其獨特的價值。此外，雪貂模型也在傳染病研究中扮演了關(guān)鍵角色。

2、隨著基因編輯技術(shù)，尤其是crispr/cas9系統(tǒng)的快速發(fā)展，基因組編輯的效率和精確度得到了顯著提升，為雪貂模型的應(yīng)用提供了新的改進。然而，現(xiàn)有的基因敲入雪貂模型的方法操作復(fù)雜且效率不高。

3、因此，亟需開發(fā)一種新的高效精準轉(zhuǎn)基因敲入雪貂模型的制備方法。以提高基因敲入的效率和準確性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。為此，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型的構(gòu)建方法。

2、本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:

3、現(xiàn)有技術(shù)主要是在crispr/cas9的基礎(chǔ)上通過非同源重組的方法獲得轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型，該技術(shù)操作復(fù)雜，效率低，且精準敲入難度大。為了克服這一問題，發(fā)明人開發(fā)了一種高效精準轉(zhuǎn)基因敲入安格魯雪貂模型的制備方法，并已成功制備多個品系的轉(zhuǎn)基因敲入安格魯雪貂品系。

4、在本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型的構(gòu)建方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括:將sgrna導(dǎo)入到安格魯雪貂受精卵中，以便獲得轉(zhuǎn)基因雪貂模型，所述sgrna適于靶向預(yù)干預(yù)基因。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法，能夠高效地構(gòu)建轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型，包含基因敲入、基因敲除和人源化雪貂模型。

5、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述導(dǎo)入之前，進一步包括:對雪貂受精卵進行離心處理。

6、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理的速度為7800g～8000g。

7、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理的時間為6分鐘～8分鐘。

8、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理的速度為7850g～7950g。

9、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理的時間為6.5分鐘～7.5分鐘。

10、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述將sgrna導(dǎo)入到安格魯雪貂受精卵是通過如下方式中的至少之一進行的:細胞核顯微注射和細胞質(zhì)顯微注射。

11、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理后，對顯示出核區(qū)的所述受精卵進行所述細胞核顯微注射。

12、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心處理后，對未顯示出核區(qū)的所述受精卵進行所述細胞質(zhì)顯微注射。

13、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞核顯微注射壓力為200pa～240pa。

14、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞核顯微注射時間為0.35秒～0.45秒。

15、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞質(zhì)顯微注射壓力為190pa～210pa。

16、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞質(zhì)顯微注射的時間為0.25秒～0.35秒。

17、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雪貂受精卵是通過如下方式獲得的:

18、在正常交配后的雌貂體內(nèi)注射hcg；以及注射hcg預(yù)定時間后，進行受精卵取出處理，以便獲得所述雪貂受精卵；其中，在正常交配后的30min～1h內(nèi)的雌貂體內(nèi)注射所述hcg。

19、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述hcg的注射量為250單位～350單位。

20、根據(jù)本發(fā)明的實施例，注射hcg?42小時～44小時后進行所述受精卵取出處理。

21、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna適于靶向emx1、nkx2.1、hace2和chd8中的至少之一。

22、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:1、seq?id?no:2、seqid?no:3和seq?id?no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。

23、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

24、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列。

25、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。

26、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:44所示的核苷酸序列。

27、在本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述模型是利用本發(fā)明的第一個方面所述的方法進行制備獲得的。根據(jù)本發(fā)明實施例的雪貂模型，能廣泛應(yīng)用于研究大腦皮層發(fā)育和功能研究、自閉癥自閉機制研究、和新冠病毒sars-cov-2感染致病機制和疫苗藥物開發(fā)。

28、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型包括emx1-creert2轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂、nkx2.1-creert2轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂、人源化ace2替代雪貂模型和chd8敲除轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂中的至少之一。

29、在本發(fā)明的第三個方面，本發(fā)明提出了一種sgrna。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?id?no:3和seq?id?no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:44所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述sgrna的trrna適于靶向cas9蛋白。根據(jù)本發(fā)明實施例的sgrna，能夠精準高效靶向預(yù)干預(yù)基因。

30、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

技術(shù)特征：

1.一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括:

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)入之前，進一步包括:對雪貂受精卵進行離心處理。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述離心處理的速度為7800g～8000g；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述將sgrna導(dǎo)入到安格魯雪貂受精卵是通過如下方式中的至少之一進行的:細胞核顯微注射和細胞質(zhì)顯微注射；

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述細胞核顯微注射壓力為200pa～240pa；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雪貂受精卵是通過如下方式獲得的:

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgrna適于靶向emx1、nkx2.1、hace2和chd8中的至少之一；

8.一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型，其特征在于，利用權(quán)利要求1～7任一項所述的方法進行制備獲得的。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的模型，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型包括emx1-creert2轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂、nkx2.1-creert2轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂、人源化ace2替代雪貂模型和chd8敲除轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂中的至少之一。

10.一種sgrna，其特征在于，所述sgrna的crrna具有如seq?id?no:1、seq?id?no:2、seqid?no:3和seq?id?no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型的構(gòu)建方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括:將sgRNA導(dǎo)入到安格魯雪貂受精卵中，以便獲得轉(zhuǎn)基因雪貂模型，所述sgRNA適于靶向預(yù)干預(yù)基因。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法，能夠高效地構(gòu)建轉(zhuǎn)基因安格魯雪貂模型，包含基因敲入、基因敲除和人源化雪貂模型。

技術(shù)研發(fā)人員：時松海,馬健,于淼,賀明,何南,張淞博
受保護的技術(shù)使用者：清華大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5