本發(fā)明涉及微生物制藥和工業(yè)生物，具體涉及一種頂頭孢霉生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體高效制備和再生的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、絲狀真菌基因組龐大復(fù)雜，細(xì)胞壁成分復(fù)雜，針對(duì)絲狀真菌的遺傳操作比單細(xì)胞真菌和酵母的難度大。目前絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電轉(zhuǎn)法和醋酸鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中最為常用的是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。

2、頭孢菌素c是臨床上廣泛使用的頭孢類抗生素的重要前體物，優(yōu)點(diǎn)是具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性、廣譜的抗性和較低的毒性等。目前頭孢菌素c是由絲狀真菌頂頭孢霉(acremoniumchrysogenum)發(fā)酵產(chǎn)生的，高產(chǎn)頭孢菌素c的頂頭孢霉工業(yè)菌株基本是通過傳統(tǒng)誘變方法獲得。不同于模式真菌底盤構(gòu)巢曲霉等研究較多的絲狀真菌，頂頭孢霉由于缺乏完善的遺傳操作體系，應(yīng)用基因編輯技術(shù)等現(xiàn)代基因工程和代謝工程的方法對(duì)頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造是亟待發(fā)展的技術(shù)領(lǐng)域。通過代謝工程等合成生物學(xué)技術(shù)將為提高頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)。

3、頂頭孢霉工業(yè)菌株的細(xì)胞壁成分非常復(fù)雜，將外源dna轉(zhuǎn)化進(jìn)入頂頭孢霉細(xì)胞需要高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是絲狀真菌主要的轉(zhuǎn)化方法之一。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是以絲狀真菌原生質(zhì)體的高效制備和細(xì)胞壁再生為基礎(chǔ)的，因此在實(shí)際對(duì)頭孢菌素c工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行菌種遺傳改造之前，開發(fā)針對(duì)頂頭孢霉工業(yè)菌株的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法和再生方法具有重要的意義。我們通過參考模式真菌構(gòu)巢曲霉等的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，對(duì)細(xì)胞壁水解酶酶種類和復(fù)配比、酶解時(shí)間、再生培養(yǎng)基配方和涂布方法等方面的探索考察了頂頭孢霉原生質(zhì)體的制備和再生條件，對(duì)頂頭孢霉菌工業(yè)菌株原生質(zhì)體的制備和再生條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高效的適用于高產(chǎn)頭孢菌素c的頂頭孢霉工業(yè)菌株原生質(zhì)體制備和細(xì)胞壁再生的方法。

2、為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體制備的方法，其特征在于，包括以下步驟：

4、s1將纖維素酶、溶壁酶和復(fù)合酶yatalase混合溶解于滲透壓緩沖液中制備得到酶解液；

5、s2取頂頭孢霉工業(yè)菌株菌體液體發(fā)酵；離心收集的菌體重懸于含dtt的滲透壓緩沖液中孵育；

6、s3然后加入纖維素酶、溶壁酶和復(fù)合酶yatalase混合溶解于滲透壓緩沖液制備得到的酶解液中進(jìn)行酶解釋放原生質(zhì)體；

7、s4進(jìn)一步處理得到原生質(zhì)體。

8、優(yōu)選地，所述酶解液是纖維素酶cellulase、溶壁酶lysing?enzyme和復(fù)合酶yatalase按2-4：2-4：3-5質(zhì)量比(優(yōu)選為3：3：4質(zhì)量比)溶解于滲透壓緩沖液得到；

9、具體濃度為5-15mg/ml酶解液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌備用。

10、進(jìn)一步地，液體發(fā)酵是將新鮮頂頭孢霉生產(chǎn)菌株菌體接種于csl液體發(fā)酵培養(yǎng)基，180-240rpm，25-30℃搖菌3-6d；再將csl培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物按5-15％體積比接種yps液體培養(yǎng)基，180-240rpm，25-30℃振蕩培養(yǎng)16-20h。

11、具體地，所述s2步具體操作是于5000-8000rpm離心2-10min收集菌絲，用滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，離心收集菌體，重懸于含5-15mm?dtt的滲透壓緩沖液中，50-150rpm，25-32℃振蕩孵育0.5-1.5h。

12、另外具體地，所述s3步具體操作是對(duì)s2步孵育后的菌液離心收集菌體，用滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，加入酶解液，28-32℃，50-130rpm酶解2-3h,鏡檢至菌絲大量釋放原生質(zhì)體。

13、在具體實(shí)施方式中，所述s4步具體操作是加入3-8倍體積的滲透壓緩沖液終止反應(yīng)，4-6層滅菌擦鏡紙過濾除去菌絲；濾過液1000-3000rpm離心2-8min收集原生質(zhì)體，用滲透壓緩沖液洗滌原生質(zhì)體除去殘留的酶解液，然后用滲透壓緩沖液重懸原生質(zhì)體。

14、本發(fā)明提供一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生的方法，其包括如下步驟：

15、a1：用所述方法得到的原生質(zhì)體細(xì)胞和含瓊脂的滲透壓緩沖液混合；

16、a2：混勻輕柔涂布均勻鋪在再生培養(yǎng)基平板上，正置培養(yǎng)后倒置培養(yǎng)至再生轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。

17、具體地，再生培養(yǎng)基配方為：麥芽汁100(v/v)，麥芽糖40g/l，聚蛋白胨20g/l，蔗糖20g/l；0.6m?kcl，25mm?cacl2，10mm?mgcl2，瓊脂粉20g/l，滅菌前ph?7.0；

18、優(yōu)選地，a2步中于25-30℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)0.5-2d，倒置培養(yǎng)4-8d至再生轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。

19、本發(fā)明還提供所述的方法在對(duì)頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造過程中應(yīng)用。

20、本發(fā)明公開的一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體高效制備和再生的方法可高效獲得較多量且活性好的原生質(zhì)體、再生效率高，為應(yīng)用于頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行基因編輯等遺傳改造和基因工程領(lǐng)域的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立和優(yōu)化提供了新的選擇。

技術(shù)特征：

1.一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體制備的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液是纖維素酶cellulase、溶壁酶lysing?enzyme和復(fù)合酶yatalase按2-4：2-4：3-5質(zhì)量比(優(yōu)選為3：3：4質(zhì)量比)溶解于滲透壓緩沖液得到；

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，液體發(fā)酵是將新鮮頂頭孢霉生產(chǎn)菌株菌體接種于csl液體發(fā)酵培養(yǎng)基，180-240?rpm，25-30℃搖菌3-6?d；再將csl培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物按5-15?%體積比接種yps液體培養(yǎng)基，180-240?rpm，25-30℃振蕩培養(yǎng)16-20h。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2步具體操作是于5000-8000?rpm離心2-10?min收集菌絲，用滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，離心收集菌體，重懸于含5-15?mm?dtt的滲透壓緩沖液中，50-150?rpm，25-32℃振蕩孵育0.5-1.5?h。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述s3步具體操作是對(duì)s2步孵育后的菌液離心收集菌體，用滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，加入酶解液，28-32℃，50-130?rpm酶解2-3?h,?鏡檢至菌絲大量釋放原生質(zhì)體。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述s4步具體操作是加入3-8倍體積的滲透壓緩沖液終止反應(yīng)，4-6層滅菌擦鏡紙過濾除去菌絲；濾過液1000-3000?rpm離心2-8?min收集原生質(zhì)體，用滲透壓緩沖液洗滌原生質(zhì)體除去殘留的酶解液，然后用滲透壓緩沖液重懸原生質(zhì)體。

7.一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生的方法，其特征在于，包括如下步驟：

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，再生培養(yǎng)基配方為：麥芽汁100（v/v），麥芽糖40?g/l，聚蛋白胨20?g/l，蔗糖20?g/l；0.6?m?kcl，25?mm?cacl2，10?mm?mgcl2，瓊脂粉20?g/l，滅菌前ph?7.0。

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，a2步中于25-30℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)0.5-2d，倒置培養(yǎng)4-8?d至再生轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。

10.如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的方法在對(duì)頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造過程中應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體制備和再生的方法。本發(fā)明包括以下步驟：將纖維素酶、溶壁酶和復(fù)合酶Yatalase混合溶解于滲透壓緩沖液中制備得到混合酶解液；取新鮮頂頭孢霉工業(yè)菌株菌體液體發(fā)酵后，離心收集的菌體重懸于含DTT的滲透壓緩沖液中孵育，然后加入混合酶解液中進(jìn)行酶解，得到原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體和含瓊脂的滲透壓緩沖液混合，均勻鋪在再生培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至再生轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。本發(fā)明的原生質(zhì)體制備和再生方法可高效獲得較多量活性好的原生質(zhì)體，在具體實(shí)例中原生質(zhì)體再生率可達(dá)23.7%，可用于對(duì)頂頭孢霉工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行基因編輯等遺傳改造過程和基因工程領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：高書山,丁忠濤,楊路佳,崔成森,劉向紅,孫雅琪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5