本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及特異性下丘腦pomc神經(jīng)元sirt1過表達(dá)小鼠模型構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、zfns(鋅指核酸酶)技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，效率低下且耗時費力。第二代基因編輯技術(shù)talen的出現(xiàn)，基因編輯效率大幅提高。talen是合成蛋白，對靶序列切割后可產(chǎn)生黏性突出端dsb。talen大大加快了基因編輯技術(shù)的發(fā)展，但在應(yīng)用過程中，其復(fù)雜的蛋白設(shè)計、昂貴的成本和較高的難度，仍使基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用受限。第三代基因編輯技術(shù)crispr/cas9系統(tǒng)不需要設(shè)計復(fù)雜的dna結(jié)合蛋白以及dna結(jié)合蛋白與fok?i核酸酶的融合過程。通過軟件就可快速設(shè)計sgrna,并對其進行初步篩選。同時，通過改變sgrna中的一小段序列，crispr/cas9系統(tǒng)可快速實現(xiàn)對其他基因位點的編輯。

2、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin?1,sirt1)，是哺乳動物中與酵母沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(silencing?information?regulator2，sir2)高度同源的蛋白質(zhì)，是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的ⅲ類組蛋白去乙?；?hdac)，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、dna損傷修復(fù)、能量及內(nèi)分泌代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，同時在基因沉默、表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。但目前關(guān)于沉默調(diào)節(jié)蛋白1的研究較少，因此亟需提供一種sirt1過表達(dá)小鼠，通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)干預(yù)小鼠體內(nèi)sirt1的活性，用于研究sirt1基因的各種功能，例如細(xì)胞衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展、dna損傷修復(fù)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供特異性下丘腦pomc神經(jīng)元sirt1過表達(dá)小鼠模型構(gòu)建方法及其應(yīng)用，本方案合理設(shè)計及修飾sgrna，保證了構(gòu)建的同源重組載體的高特異性與低脫靶率。將需要進行編輯的目的基因及其載體通過顯微注射的方式導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，實現(xiàn)目的基因的編輯能夠穩(wěn)定遺傳，最終獲得穩(wěn)定遺傳的基因編輯動物。

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下所示：

3、特異性下丘腦pomc神經(jīng)元sirt1過表達(dá)小鼠模型構(gòu)建方法，包括以下步驟：利用crispr/cas9技術(shù)，將cag-lsl-msirt1-3-3xflag-wpre-polya基因片段定點插入到小鼠的h11位點；重組后的小鼠的h11位點后的序列如seq?id?no.1所示。

4、進一步的，將crispr/cas9體系和同源重組載體顯微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，獲得f0代小鼠；經(jīng)pcr基因鑒定驗證正確的f0代陽性小鼠與c57bl/6jgpt小鼠交配獲得可穩(wěn)定遺傳的f1代陽性小鼠模型；將f1代小鼠與pomc-cre小鼠交配獲得f2代小鼠并對其進行基因鑒定。

5、進一步的，構(gòu)建攜帶靶位點同源區(qū)域及目的片段的同源重組載體；將轉(zhuǎn)錄好的sgrna和cas9系統(tǒng)以及純化后的同源重組載體樣品顯微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，獲得f0代小鼠。

6、進一步的，所述同源重組載體的鑒定引物如下：

7、1213513-seqf1：tccccatcaagctgataaca；

8、1213513-seqr2：gctcaggtggaggaattgtt；

9、1213513-seqf5：ccaagcaacaaacaacaatg；

10、h11-3arm-tr：ctcaggacctctgaaagacc。

11、進一步的，sgrna的序列為5′-ctgagccaacagtggtagta-3′。

12、進一步的，f0代小鼠的鑒定引物如下：

13、h11-tf2：atgcccaccaaagtcatcagtgtag；

14、h11-cag-5tr2：aggcgggccatttaccgtaagtta；

15、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

16、h11-tr1：gacccactattctgcaccactcattag；

17、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

18、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag；

19、進一步的，f1代小鼠的鑒定引物如下：

20、h11-tf2：atgcccaccaaagtcatcagtgtag；

21、h11-cag-5tr2：aggcgggccatttaccgtaagtta；

22、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

23、h11-tr2：tcacagaaaccatatggcgctcc；

24、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

25、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag。

26、進一步的，f2代小鼠的鑒定引物如下：

27、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

28、h11-tr3：atatccccttgttccctttctgc；

29、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

30、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag；

31、oimr1084：gcggtctggcagtaaaaactatc；

32、oimr1085：gtgaaacagcattgctgtcactt。

33、本發(fā)明還提供上述方法構(gòu)建的特異性下丘腦pomc神經(jīng)元sirt1過表達(dá)小鼠模型在制備藥物中的應(yīng)用。

34、進一步的，所述藥物為改善肥胖的藥物。

35、有益效果

36、sirt1(sirtuin?1)是一種關(guān)鍵的蛋白質(zhì)，屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)依賴的組蛋白去乙酰化酶類，對細(xì)胞分化、衰老、凋亡、dna損傷修復(fù)等生理過程起著重要作用。

37、同時，sirt1可作為能量傳感器，在控制身體代謝中發(fā)揮重要作用。在外周組織中，大量研究表明sirt1能夠調(diào)節(jié)肝臟、胰腺、骨骼肌等器官的代謝進程。在中樞，下丘腦通過多個神經(jīng)元回路的緊密協(xié)調(diào)在控制食物攝入和能量消耗方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。sirt1亦在下丘腦中表達(dá)，禁食后其表達(dá)增加。而下丘腦sirt1的急性抑制抑制了空腹誘導(dǎo)的大鼠食欲亢進。

38、由于sirt1在pomc神經(jīng)元中表達(dá)，這一代謝傳感器神經(jīng)元中的這種代謝傳感器蛋白可能在協(xié)調(diào)身體能量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明利用crispr/cas9技術(shù)，將cag-lsl-msirt1-3-3xflag-wpre-polya基因片段定點插入到小鼠的h11位點。sgrna的序列為5′-ctgagccaacagtggtagta-3′。將crispr/cas9體系和同源重組載體顯微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，獲得f0代小鼠。經(jīng)pcr驗證正確的f0代陽性小鼠與c57bl/6jgpt小鼠交配獲得可穩(wěn)定遺傳的f1代陽性小鼠模型。將f1代小鼠與b012339stocktg(pomc1-cre)16lowlj小鼠交配獲得f2代小鼠并對其進行基因鑒定?；赾rispr?cas9系統(tǒng)，我們生成了下丘腦pomc神經(jīng)元特異性sirt1過表達(dá)小鼠，研究該小鼠(以下簡稱oe小鼠)與其同窩對照小鼠(以下簡稱wt)在飲食誘導(dǎo)肥胖后體重、攝入、血糖的區(qū)別。7周喂養(yǎng)可見oe小鼠重于wt小鼠，但是兩種小鼠的累積攝入量并沒有統(tǒng)計意義的差異。同時，oe小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐量受損。

39、此外，在這過程中生成的h11-cag-lsl-msirt1-3×flag-wpre-polya小鼠即sirt1過表達(dá)小鼠能夠與各種cre工具鼠配繁從而啟動sirt1基因過表達(dá)，進而生成不同區(qū)域的sirt1過表達(dá)小鼠，從而用于研究sirt1基因的其他功能，例如細(xì)胞衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展、dna損傷修復(fù)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等。

40、總之，通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)干預(yù)小鼠體內(nèi)sirt1的活性，對研究與sirtl功能密切相關(guān)的疾病具有重大科學(xué)意義和社會經(jīng)濟效益。