本發(fā)明涉及癌癥診斷用的分子影像探針，尤其是一種用于肺癌診斷的核酸適配體和分子影像探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。根據(jù)癌細(xì)胞的微觀組織學(xué)特征，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌（nsclc）和小細(xì)胞肺癌（sclc），前者占?85%。由于肺癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者診斷時(shí)已進(jìn)入晚期，導(dǎo)致治療結(jié)果差和預(yù)后差。因此，早期發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確診斷、精確分期和有效治療對(duì)于提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。

2、針對(duì)腫瘤組織的影像學(xué)檢查對(duì)于癌癥的預(yù)防及治療具有重大意義。目前臨床通常使用熒光、超聲、核磁共振（mri）、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（ct）、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（pet-ct）等方法對(duì)腫瘤進(jìn)行示蹤及成像。其中pet/ct作為一種核醫(yī)學(xué)臨床檢查的成像技術(shù)，是目前唯一的用解剖形態(tài)方式進(jìn)行功能、代謝和受體顯像的技術(shù)。其具有無(wú)創(chuàng)傷性的特點(diǎn)并能提供全身三維和功能運(yùn)作的圖像。因此，pet/ct技術(shù)在腫瘤學(xué)臨床醫(yī)學(xué)影像和癌擴(kuò)散方面的研究方面有著大量的應(yīng)用。

3、正電子發(fā)射斷層掃描/計(jì)算機(jī)斷層掃描（pet/ct）廣泛用于核醫(yī)學(xué)中，用于肺癌的診斷、分期、治療評(píng)估和監(jiān)測(cè)。它使用放射性核素標(biāo)記的生物分子作為成像劑，在分子水平上顯示組織或器官的功能或代謝狀態(tài)，并通過ct提供解剖細(xì)節(jié)?；趐et/ct技術(shù)的分子影像診斷能夠早期，無(wú)創(chuàng)對(duì)腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行顯像與分子分型，為相應(yīng)治療方案的實(shí)施提供了豐富且可靠的診斷依據(jù)。目前臨床應(yīng)用中最常用的pet成像追蹤劑是18f-fdg。其利用腫瘤組織代謝旺盛，對(duì)糖類分子攝取量大這一生理特點(diǎn)，能夠在腫瘤區(qū)域高效富集，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的靶向顯像。近年來，隨著分子影像學(xué)概念的提出及相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展，科研工作者構(gòu)建了基于抗體、小分子、核酸適配體等靶向分子的核素分子探針。該類探針能夠特異性的與腫瘤標(biāo)志物結(jié)合，通過pet/ct成像，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤組織高表達(dá)生物標(biāo)志物的分子成像，提供腫瘤組織的分子診斷信息。影像學(xué)分子診斷能夠提供完整的腫瘤分子生理信息，避免了病理切片免疫組化可能存在的診斷信息不全等問題。但目前18f-fdg?pet/ct成像在腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)中缺乏特異性，一些因素影響其臨床應(yīng)用效果：（1）18f-fdg不僅被腫瘤細(xì)胞吸收，而且被正常組織或非腫瘤性病變吸收可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；（2）某些低分化或缺氧腫瘤細(xì)胞中18f-fdg攝入低可能導(dǎo)致假陰性；（3）18f-fdg在大腦、心臟、肝臟和腎臟等重要代謝活躍器官中顯示出高背景信號(hào)，影響這些區(qū)域的腫瘤檢測(cè)；（4）18f-fdg?pet/ct的準(zhǔn)備需要患者在掃描前禁食并調(diào)節(jié)血糖水平，以減少18f-fdg在健康組織中的分布和吸收。

4、核酸適配體是一種能夠特異性與細(xì)胞靶分子結(jié)合的高度結(jié)構(gòu)化的dna或rna片段。相比于傳統(tǒng)的生物靶向分子如抗體、酶等，核酸適配體化學(xué)穩(wěn)定性好，能夠廣泛應(yīng)用于多種核素分子標(biāo)記手段，根據(jù)實(shí)際需個(gè)性化定制分子探針的標(biāo)記核素，為針對(duì)腫瘤的代謝及免疫組學(xué)分析提供合適的探針。隨著免疫pet的發(fā)展，精準(zhǔn)靶向探針逐漸被開發(fā)，其中，核酸適配體盡管顯示出巨大的臨床應(yīng)用潛力，基于核酸適配體pet/ct分子探針的臨床應(yīng)用尚未在肺癌中得到臨床應(yīng)用，仍存在諸多挑戰(zhàn)，例如核酸適配體易被核酸酶降解，活體內(nèi)穩(wěn)定性和靶向性不足等。因此，亟需開發(fā)高特異性和高穩(wěn)定性的新型核酸適配體pet/ct分子探針，實(shí)現(xiàn)肺癌的精準(zhǔn)診斷和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種特異性靶向腫瘤細(xì)胞膜表面腫瘤相關(guān)鈣通道傳感蛋白2的核酸適配體，以及采用所述核酸適配體制備而成具有高穩(wěn)定性、高特異性、高靈敏性的用于診斷肺癌的分子影像探針。同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述分子影像探針的制備方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列如seq?id?no?:?1所示，具體為5’-ctc?gac?acc?ctc?gtc?ccc?ggc?cgc?tcc?tgc?tcaatt?tca?tag?cag?g-3’。

3、本發(fā)明所述核酸適配體是針對(duì)腫瘤相關(guān)鈣通道傳感蛋白2（trop-2）靶向的核酸適配體，本發(fā)明通過指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化（selex）技術(shù)篩選了一條靶向trop-2的核酸適配體dna單鏈，經(jīng)過體外親和力檢測(cè)，以及肺癌腫瘤細(xì)胞水平靶向性檢測(cè)，并經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該核酸適體與trop-2過表達(dá)的肺癌細(xì)胞如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞h1650、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞sbc-2等的特異性靶向識(shí)別，能夠在細(xì)胞水平及荷瘤小鼠模型中區(qū)分trop-2陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞。進(jìn)一步，通過構(gòu)建靶向trop-2的核酸適配體-核素靶向造影劑，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)trop-2陽(yáng)性肺癌患者的分子顯像，避免了穿刺活檢的侵入性。在保證高特異性識(shí)別靶向分子的同時(shí)降低了病人的痛苦。

4、優(yōu)選地，所述核酸適配體為凍干粉。本發(fā)明所述的核酸適配體利用固相合成的方法合成，優(yōu)選為凍干粉末形式。

5、第二方面，本發(fā)明提供了如上所述核酸適配體在制備診斷肺癌的分子影像探針中的應(yīng)用。本發(fā)明所設(shè)計(jì)篩選得到特定核苷酸序列的核酸適配體，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其與trop-2過表達(dá)的肺癌細(xì)胞如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞h1650、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞sbc-2等的特異性靶向識(shí)別，能夠在細(xì)胞水平及荷瘤小鼠模型中區(qū)分trop-2陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞，可以用于制備診斷肺癌的分子影像探針，具有高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。

6、第三方面，本發(fā)明提供一種用于診斷肺癌的分子影像探針，為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種用于診斷肺癌的分子影像探針，所述分子影像探針包含如上所述的核酸適配體、核素螯合配體和標(biāo)記用核素；所述核酸適配體與所述核素螯合配體偶聯(lián)，并由所述標(biāo)記用核素標(biāo)記。

7、本發(fā)明所述用于診斷肺癌的分子影像探針，采用所述特定序列的核酸適配體偶聯(lián)核素螯合配體并由所述標(biāo)記用核素標(biāo)記而成，所得分子影像探針能夠用于肺癌的無(wú)創(chuàng)可視化分子顯像，而且具有高特異性、高靈敏性、成像效果佳等優(yōu)點(diǎn)。

8、優(yōu)選地，所述核素螯合配體包括去鐵胺、1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸中的至少一種。所述核素螯合配體包括但不限于去鐵胺（deferoxamine）、1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（nota）、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（dota），更優(yōu)選地，所述核素螯合配體為1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（nota）或1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（dota）。

9、優(yōu)選地，所述標(biāo)記用核素為tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、i-124、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188、y-86、mn-52、sc-44、y-90、ac-225、as-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra-223、ru-106、na-24、sr-89、tb149、th-227、xe-133、yb-169、yb-177中的至少一種。更優(yōu)選地，所述標(biāo)記用核素為ga-68。

10、優(yōu)選地，所述核素螯合配體為1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸，所述標(biāo)記用核素為ga-68。當(dāng)所述核素螯合配體選擇1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（nota）且所述標(biāo)記用核素選擇ga-68時(shí)，所得分子影像探針表示為[68ga]ga-nota-trp，經(jīng)本技術(shù)發(fā)明人驗(yàn)證，其實(shí)現(xiàn)了對(duì)trop-2受體蛋白表達(dá)的無(wú)創(chuàng)可視化檢測(cè)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了肺癌的無(wú)創(chuàng)分子顯像。

11、第四方面，本發(fā)明提供一種反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、成本低廉的分子影像探針制備方法，為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種用于診斷肺癌的分子影像探針的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

12、步驟（1）：采用固相合成方法合成核酸適配體；

13、步驟（2）：將合成的核酸適配體與核素螯合配體偶聯(lián)，得到核酸適配體-核素分子探針前體；

14、步驟（3）：將步驟（2）所得核酸適配體-核素分子探針前體與標(biāo)記用核素溶液混合反應(yīng)，得到分子影像探針。

15、本發(fā)明所述分子影像探針的制備方法，首先采用固相合成方法合成如上所述核苷酸序列的核酸適配體，所述固相合成方法的合成時(shí)間一般為1~2小時(shí)，然后將核酸適配體與核素螯合配體進(jìn)行偶聯(lián)，得到核酸適配體-核素分子探針前體，最后將其與標(biāo)記用核素溶液進(jìn)行混合反應(yīng)，得到分子影像探針。所述制備方法中反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，成本低廉。

16、優(yōu)選地，所述步驟（3）具體為：將標(biāo)記用核素用鹽酸溶解，得到核素鹽酸溶液，然后加入醋酸鈉緩沖溶液，得到標(biāo)記用核素溶液；將標(biāo)記用核素溶液與核酸適配體-核素分子探針前體混合，加熱反應(yīng)后冷卻至室溫，得到分子影像探針。所述標(biāo)記用核素對(duì)核酸適配體-核素分子探針前體進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，先將所述標(biāo)記用核素配制成特定ph的標(biāo)記用核素溶液，具體地，先將標(biāo)記用核素用鹽酸溶液進(jìn)行溶液，所述鹽酸溶液優(yōu)選為0.1?m的鹽酸溶液，溶解后得到核素鹽酸溶液，然后加入醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)ph值到特定的范圍，所述醋酸鈉緩沖液的濃度優(yōu)選為1?m，即得所述標(biāo)記用核素溶液。

17、優(yōu)選地，所述步驟（3）中，標(biāo)記用核素在核素鹽酸溶液中的放射性劑量為7?mci~10mci。所述核素鹽酸溶液中的標(biāo)記用核素放射性劑量?jī)?yōu)選但不限于7?mci~10?mci，例如可以為7?mci、8?mci、9?mci、10?mci以及它們之間的任意中間值。

18、優(yōu)選地，所述核素鹽酸溶液與醋酸鈉緩沖液的體積比為1：（5~6）；更優(yōu)選地，所述標(biāo)記用核素溶液的ph為4.0。

19、優(yōu)選地，所述步驟（3）中，反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。

20、優(yōu)選地，所述核酸適配體-核素分子探針前體與標(biāo)記用核素溶液混合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行純化后得到分子影像探針，所述純化優(yōu)選但不限于使用cytiva?pd?minitrap?g-25脫鹽純化柱進(jìn)行純化。

21、本發(fā)明所述核酸適配體為由46個(gè)核苷酸組成的特異性靶向肺癌腫瘤細(xì)胞表面trop-2的核酸適配體，其與trop-2過表達(dá)的肺癌細(xì)胞如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞h1650、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞sbc-2等的特異性靶向識(shí)別，能夠在細(xì)胞水平及荷瘤小鼠模型中區(qū)分trop-2陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞。

22、本發(fā)明所述用于診斷肺癌的分子影像探針，采用所述特定的核酸適配體進(jìn)行核素螯合配體偶聯(lián)，并進(jìn)一步進(jìn)行放射性核素標(biāo)記，構(gòu)建了一種針對(duì)特定分子標(biāo)志物trop-2的pet分子探針，并利用肺癌腫瘤模型荷瘤鼠驗(yàn)證了該探針分子顯像效能，實(shí)現(xiàn)了對(duì)trop-2受體蛋白表達(dá)的無(wú)創(chuàng)可視化檢測(cè)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了肺癌的無(wú)創(chuàng)分子顯像，能夠作為顯像劑應(yīng)用于pet/ct分子影像，對(duì)于肺癌的診斷具有重要意義。

23、本發(fā)明所述用于診斷肺癌的分子影像探針的制備方法，先使用dna合成儀進(jìn)行固相合成特定序列的核酸適配體，序列可個(gè)性化定制，批次間差異小，與傳統(tǒng)抗體探針制備相比，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，探針合成前體及探針本身穩(wěn)定性好，不受溫度、酸堿度影響，而且所述方法能夠通用于針對(duì)其他分子靶標(biāo)及不同核素的分子探針制備，在未來腫瘤組織的診斷與精準(zhǔn)治療中具有廣闊的應(yīng)用前景及非常高的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、特異性高、穩(wěn)定性高、成像信倍比高、易于臨床轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)。