專利名稱:共有植酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物酶領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及共有植酸酶。
背景技術(shù)：
植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶；EC3.1.3.8)是將植酸(肌醇六磷酸)水解成肌醇和無機(jī)磷酸且已知是一種有價(jià)值的食品添加劑的酶。
植酸酶于1907年在水稻糠中首先被描述[Suzuki等，Bull.Coll.Agr.Tokio Imp.Univ.7，495(1907)]且1911年發(fā)現(xiàn)來自曲霉屬種類的植酸酶[Dox和Golden，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，10，183-186(1911)]。植酸酶也在小麥糠，植物種子，動(dòng)物腸道和微生物中發(fā)現(xiàn)[Howsen和Davis，酶微生物學(xué)技術(shù)(Enzyme Microb.Technol.)，5，377-382(1983)，Lambrechts等，生物技術(shù)通訊(Biotech.Lett.)14，61-66(1992)，Shieh和Ware，應(yīng)用微生物學(xué)(Appl.Microbiol.)，16，1348-1351(1968)]。
來自黑曲霉(無花果)的植酸酶的克隆和表達(dá)已由VanHartingsveldt等在“基因”(Gene)，127，87-94(1993)和在歐州專利申請(qǐng)公開號(hào)(EP)420358中描述，來自黑曲霉變種awamori的植酸酶由Piddington等在“基因”，133，55-62(1993)中描述。

發(fā)明內(nèi)容
具有改進(jìn)特性的植酸酶的克隆，表達(dá)和純化已在EP684313中公開。然而，由于仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)的植酸酶，特別是關(guān)于其熱穩(wěn)定性，因此本發(fā)明的目的是提供下面的方法，但它不僅僅可應(yīng)用于植酸酶。
一種用于制備共有蛋白質(zhì)的方法，其中該方法的特征在于下面的步驟a)以本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比程序?qū)Ρ冉o定蛋白質(zhì)家族的至少三個(gè)，優(yōu)選四個(gè)氨基酸序列；b)以本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)程序比較按該序列對(duì)比在相同位置的氨基酸的進(jìn)化相似性，而將該程序提供的限定氨基酸最小相似性的相似性程度設(shè)定為較不嚴(yán)格數(shù)，該最小相似性用于確定相應(yīng)位置的氨基酸，設(shè)定參數(shù)使該程序能夠僅從相應(yīng)位置的2個(gè)相同氨基酸確定為共有蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸；然而，如果比較的氨基酸序列中是互相間比與其余序列顯示出更高程度相似性的序列，那么這些序列以其共有序列表示，該共有序列按與用于共有蛋白的共有序列的本方法中相同的方式來確定，或?qū)@些序列中的每一個(gè)指定以這種序列的數(shù)目除1的選擇權(quán)重。
c)如果以該程序鑒定在限定位置沒有共同氨基酸，則選擇用于比較的所有序列的任意氨基酸，優(yōu)選選擇所有這類序列的最常見氨基酸，或根據(jù)實(shí)施例2提供的意見選擇氨基酸。
d)一旦限定了共有序列，將該序列轉(zhuǎn)譯為DNA序列，優(yōu)選使用在其中發(fā)生表達(dá)的生物的常用密碼子表進(jìn)行轉(zhuǎn)譯；e)以本領(lǐng)域已知的方法合成DNA序列，用整合在合適的表達(dá)載體中的形式或以其自身轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；f)在合適的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以本領(lǐng)域已知的方法從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)基分離共有蛋白質(zhì)。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟b)也可限定如下b)以本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)程序比較按該序列對(duì)比在相同位置的氨基酸的進(jìn)化相似性，而將該程序提供的相似性程度設(shè)定為最低可能性值，選擇用于比較的至少一半序列最相似的氨基酸用于共有蛋白質(zhì)氨基酸序列的相應(yīng)位置。
可見整個(gè)方法的優(yōu)選實(shí)施方案在于在該方法中從許多高度同源的序列選擇一個(gè)序列，只取代那些與在中等嚴(yán)格條件下計(jì)算的該蛋白質(zhì)家族的共有序列明顯不同的氨基酸殘基，而在該方法不能在中等嚴(yán)格條件下確定氨基酸的序列對(duì)比的所有位置選擇優(yōu)選序列的氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這樣一種方法，其中用于在限定位置比較氨基酸的進(jìn)化相似性的程序是程序“PRETTY”。本發(fā)明的更具體的一個(gè)目的是提供這樣一種方法，其中給定的蛋白質(zhì)家族是植酸酶家族，特別是其中植酸酶來源于真菌。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供這樣一種方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，特別是真菌，優(yōu)選曲霉或酵母，優(yōu)選釀酒酵母或漢遜氏酵母來源。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可從，優(yōu)選以，這類方法獲得的共有蛋白質(zhì)，特別是具有圖2所示氨基酸序列的共有蛋白質(zhì)或其變異體。在本發(fā)明說明書中“變異體”指具有圖2所示氨基酸序列的共有蛋白質(zhì)，其中在一個(gè)或多個(gè)位置的氨基酸被缺失、添加或取之以一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸，只要所得序列蛋白質(zhì)的諸如酶活性(類型及比活)、熱穩(wěn)定性、在某一pH范圍內(nèi)的活性(pH穩(wěn)定性)等基本特性無明顯改變。本說明書中“明顯”是指本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白變異體的特性可能有所不同，但相對(duì)于具有圖2氨基酸序列的共有蛋白質(zhì)本身而言不是非顯而易見的。
本發(fā)明說明書中的突變蛋白質(zhì)指圖2所示的共有蛋白質(zhì)氨基酸序列中的氨基酸被取代，產(chǎn)生具有進(jìn)一步改進(jìn)特性(例如，活性)的共有蛋白質(zhì)。該突變蛋白質(zhì)可根據(jù)歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?7810175.6提供的教導(dǎo)進(jìn)行定義和制備，例如，Q50L、Q50T、Q50G、Q50L-Y51N或Q50T-Y51N。在本說明書中“Q50L”指在氨基酸序列的50位氨基酸Q被氨基酸L取代。
另外，含有上文限定的共有蛋白質(zhì)的食品、飼料或藥用組合物也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
在本說明書中“給定蛋白質(zhì)家族的至少三個(gè)優(yōu)選三個(gè)氨基酸序列”指三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六至12、20、50或更多個(gè)序列可用于序列對(duì)比，且比較以產(chǎn)生共有蛋白質(zhì)的氨基酸序列?！敖o定蛋白質(zhì)家族的序列”指折疊成三維結(jié)構(gòu)的這類序列，其中α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角位于相同位置使這些結(jié)構(gòu)具有本領(lǐng)域的技術(shù)人員所謂的可重疊性。而且這些序列決定顯示出相同類型的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，例如，給定的酶類型，例如，植酸酶。正如本領(lǐng)域已知的，一個(gè)這類序列的三維結(jié)構(gòu)足以允許模擬該家族其它序列的結(jié)構(gòu)。其如何發(fā)揮效力的一個(gè)例子在本申請(qǐng)的參考實(shí)施例中提供。在本申請(qǐng)說明書中“進(jìn)化相似性”指按結(jié)構(gòu)相似性分類氨基酸的程序，它使得一個(gè)氨基酸可被對(duì)總體結(jié)構(gòu)具有最小影響的另一氨基酸取代，例如以本領(lǐng)域已知的程序，如“PRETTY”，可做到這一點(diǎn)。在本發(fā)明說明書中短語“將該程序提供的相似性程度...設(shè)定為較不嚴(yán)格數(shù)”指在實(shí)施本發(fā)明所用的程序中測(cè)定相似性程度的參數(shù)的值的選擇方式是允許該程序限定所有氨基酸序列最多位置的共有氨基酸，例如，如果是程序PRETTY，可選擇THRESHOLD的值為2或3，PLURALITY的值為2。另外，在本發(fā)明說明書中“以該序列數(shù)除1的選擇權(quán)重”指限定與其它用于共有序列測(cè)定的序列具有高度相似性的一組序列的序列僅給該測(cè)定提供等于該組所有序列數(shù)除1的系數(shù)。
如前所述，假使該程序不能選擇最相似的氨基酸，則選擇最常見的氨基酸，假使后者不可能，則本領(lǐng)域的技術(shù)人員將從所有用于比較的序列中選擇這樣一個(gè)氨基酸，其中在本領(lǐng)域中已知該氨基酸在蛋白質(zhì)中具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的特性，例如由下列文獻(xiàn)所述Janecek，S.(1993)，生化方法(Process Biochem)，28，435-445或Fersht，A.R.和Serrano，L.(1993)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的現(xiàn)代觀點(diǎn)(Curr.Opin.Struct.Biol.)，3，75-83。
Alber，T.(1989)，生化年鑒(Annu.Rev.Biochem.)，58，765-798或Matthews，B.W.(1987)，生化(Biochemistry)26，6885-6888.
Matthews，B.W.(1991)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的現(xiàn)代觀點(diǎn)，1，17-21.
酶的穩(wěn)定性是許多工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此已進(jìn)行了或多或少有所成功的許多嘗試以理性(van den Burg等，1998)或非理性途徑(Akanuma等，1998)增強(qiáng)穩(wěn)定性，優(yōu)選酶的熱穩(wěn)定性。影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的作用力與負(fù)責(zé)肽鏈正確折疊的作用力相同(疏水相互作用，范德華相互作用，氫鍵，鹽橋，構(gòu)象張力(Matthews，1993))。而且，如Matthews等(1987)所示，非折疊狀態(tài)的自由能也對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有影響。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增強(qiáng)是指有利的相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度增加且不利的相互作用的數(shù)目和強(qiáng)度減少?？蓪?dǎo)入二硫鍵(Sauer等，1986)，用丙氨酸殘基取代甘氨酸殘基或增加脯氨酸含量以減小非折疊狀態(tài)的自由能(Margarit等，1992；Matthews，1987a)。其它小組致力于用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的其它氫鍵和鹽橋的重要性的研究(Blaber等，1993)或嘗試填充蛋白質(zhì)內(nèi)的空穴以增加遮蓋的疏水表面積和范德華相互作用(Karpusas等，1989)。另外，也研究了例如經(jīng)過增加螺旋保護(hù)帽對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件特別是α-螺旋的穩(wěn)定作用(Munoz和Serrano，1995)。
然而，還沒有快速而有價(jià)值的方案來鑒定可增加穩(wěn)定性，優(yōu)選蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的氨基酸取代。通常，需要蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)來發(fā)現(xiàn)在分子中可能會(huì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)的氨基酸取代位置。圍繞這一問題的其它研究方式是尋找嗜熱或嗜高溫生物中的同源蛋白質(zhì)或以隨機(jī)誘變方案檢測(cè)增強(qiáng)穩(wěn)定性的氨基酸取代。后一種可能性僅在103至104個(gè)突變中會(huì)成功且局限于可得到快速篩選程序的酶(Arase等，1993；Risse等，1992)。對(duì)于所有這些方案，成功率會(huì)變化且是不可預(yù)料的，如果成功，熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)幾乎總是相當(dāng)小。
這里我們提供了另一種方式來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。Imanaka等(1986)首先使用同源蛋白質(zhì)比較來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。他們使用來自嗜熱生物的蛋白酶與嗜溫生物的同源蛋白酶的比較來增強(qiáng)嗜溫蛋白酶的穩(wěn)定性。Serrano等(1993)使用兩種同源嗜溫RNA酶的氨基酸序列的比較來構(gòu)建更具熱穩(wěn)定性的RNA酶。他們逐一突變了兩者之間不同的所有殘基并以多重突變組合增加穩(wěn)定性的突變。
Pantoliano等(1989)和特別是Steipe等(1994)表明在同源蛋白質(zhì)序列對(duì)比的每個(gè)位置最常見的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)最大。Steipe等(1994)對(duì)免疫球蛋白的可變區(qū)證實(shí)了這一點(diǎn)，而Pantoliano等(1989)檢查了枯草桿菌蛋白酶一級(jí)序列中選擇用于提高穩(wěn)定性的酶序列差異極大的位置。他們的研究產(chǎn)生了取代物M50F，它將枯草桿菌蛋白酶的Tm提高了1.8℃。
Steipe等(1994)在免疫球蛋白的可變區(qū)證實(shí)了僅通過使用在該結(jié)構(gòu)域的某一位置測(cè)定最常見的氨基酸殘基的統(tǒng)計(jì)方法可預(yù)期具有超過60％成功率的致穩(wěn)定突變。它也表明該方法不僅對(duì)于抗體可變區(qū)的穩(wěn)定，而且對(duì)于其它蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域可提供有用的結(jié)果。然而，它沒有提及該方法可延伸到完整的蛋白質(zhì)。而且沒有提到用于在一個(gè)明確的位置計(jì)算氨基酸頻率的程序或是否使用如本發(fā)明中的計(jì)分模板。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于制備共有蛋白質(zhì)的方法，包括計(jì)算用于所謂的共有蛋白質(zhì)的幾乎所有位置的氨基酸殘基并從這種序列合成能在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的完全基因的方法。
本發(fā)明的DNA序列可從編碼蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列開始構(gòu)建，例如從現(xiàn)有技術(shù)已知的[序列信息見上述參考文獻(xiàn)，例如，EP684313或序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如，Genbank(Intelligenetics，California，USA)，歐洲生物信息研究所(Hinston Hall，英國(guó)劍橋)，NBRF(Georgetown University，醫(yī)學(xué)中心，美國(guó)華盛頓區(qū))和Vecbase(University of Wisconsin，生物技術(shù)中心，Madison，Wisconsin，美國(guó))]或以體外誘變方法[參見，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約]獲得并在附圖中所公開的植酸酶。最初由Hurchinson和Edgell所述[病毒學(xué)雜志，8，181(1971)]的用于該定點(diǎn)誘變的廣泛使用的策略涉及將攜帶所需核苷酸取代的合成寡核苷酸與待導(dǎo)入該突變的單鏈DNA序列的靶區(qū)域退火[綜述見Smith，遺傳學(xué)年鑒(Annu.Rev.Genet.)，19，423(1985)，改進(jìn)方法見Stanssen等，核酸研究，17，4441-4454(1989)中的參考文獻(xiàn)2-6]。優(yōu)選用于實(shí)施本發(fā)明的突變給定DNA序列的另一可能性是經(jīng)過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行誘變。作為起始材料的DNA以本領(lǐng)域已知的和例如在Sambrook等(分子克隆)中所述的方法從各自的菌株中分離。對(duì)于菌株信息，參見例如，EP684313或下面所述的任何保藏機(jī)構(gòu)。黑曲霉[ATCC9142]，嗜熱毀絲霉[ATCC48102]，嗜熱踝節(jié)菌[ATCC20186]和煙曲霉[ATCC34625]已根據(jù)布達(dá)佩斯條約的要求分別以下列保藏號(hào)ATCC74337、ATCC74340、ATCC74338和ATCC74339重新保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。然而，應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明編碼共有蛋白質(zhì)的DNA也能以在例如EP747483中所述或以本領(lǐng)域已知的方法實(shí)例所述的合成方式制備。
一旦獲得了本發(fā)明的完整的DNA序列，可將它們以本領(lǐng)域已知的和例如，在Sambrook等(出處同上)中所述的方法整合進(jìn)載體以在合適的宿主系統(tǒng)中過度表達(dá)編碼的多肽。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道DNA序列本身也可用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的合適的宿主系統(tǒng)以獲得所編碼的多肽的過度表達(dá)。合適的宿主系統(tǒng)是例如，真菌，如曲霉，例如黑曲霉[ATCC9142]或無花果曲霉[NRRL3135]，或如木霉屬，例如Trichoderma reesei或酵母，如糖酵母屬，例如，啤酒糖酵母或畢赤氏酵母屬，如巴斯德畢赤氏酵母，或多形漢遜氏酵母，例如，多形漢遜氏酵母(DSM5215)或植物，由例如，Pen等，生物/技術(shù)(Bio/Technology)11，811-814(1994)所述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道這些微生物可從保藏機(jī)構(gòu)獲得，例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，真菌菌種保藏中心(CBS)或德國(guó)微生物和培養(yǎng)物保藏中心(DSM)或在“工業(yè)產(chǎn)權(quán)”(Industrial Property)雜志[(1991)1，29-40頁(yè)]中所列的任何其它保藏機(jī)構(gòu)。可使用的細(xì)菌有，例如，大腸桿菌，桿菌，例如，枯草芽孢桿菌或鏈霉菌屬，例如，變青鏈霉菌(例如，見Anne和Mallaert，在FEMS Microbiol.Letters114，121(1993))?？墒褂玫拇竽c桿菌是大腸桿菌K12菌株，例如，M15[Villarejo等，在“細(xì)菌學(xué)雜志”，120，466-474(1974)中所述的DZ291]，HB101[ATCC No.33694]或大腸桿菌SG13009[Gottesman等，細(xì)菌學(xué)雜志，148，265-273(1981)]。
可用于在真菌中表達(dá)的載體在本領(lǐng)域是已知的，例如在EP420358中，或由Cullen等[生物/技術(shù)5，369-376(1987)]或Ward在“分子工業(yè)真菌學(xué)、絲狀真菌的系統(tǒng)和應(yīng)用”(Molecular IndustrialMycology，Systems and Applications for Filamentuns Fungi)，MarcelDekker，紐約(1991)，Upshall等[生物/技術(shù)5，1301-1304(1987)]，Gwynne等[生物/技術(shù)5，71-79(1987)]，Punt等[生物技術(shù)雜志17，19-34(1991)]以及對(duì)于酵母由Sreekrishna等[基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志28，265-278(1988)，生物化學(xué)28，4117-4125(1989)]，Hitzemann等[自然293，717-722(1981)]或在EP183070、EP183071、EP248227、EP263311中所述?？捎糜谠诖竽c桿菌中表達(dá)的合適的載體，例如，由Sambrook等[出處同上]或由Fiers等在“第8屆國(guó)際生物技術(shù)會(huì)議”[Soc.Franc.de Microbiol.，Paris(Durand等編輯)pp 680-697(1988)]或由Bujard等，在“酶學(xué)方法”，Wu和Grossmann，AcademicPress，Inc.Vol.155，416-433(1987)和Stuber等，在“免疫學(xué)方法”，Lefkovits和Pernis編，Academic Press，Inc.Vol.IV，121-152(1990)所述。可用于在桿菌中表達(dá)的載體在本領(lǐng)域是已知的，例如在EP405370，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)81，439(1984)，Yansura和Henner，酶學(xué)方法，185，199-228(1990)或EP207459中所述?？捎糜谠诙嘈螡h遜氏酵母中表達(dá)的載體在本領(lǐng)域是已知的，例如在Gellissen等，生物技術(shù)9，291-295(1991)中所述。
要么該載體已攜帶調(diào)節(jié)元件，例如，啟動(dòng)子，要么可將本發(fā)明的DNA序列改造成含有該元件?？墒褂玫暮线m的啟動(dòng)子元件在本領(lǐng)域中是已知的且例如對(duì)于Trichoderma reesei是cbh1-啟動(dòng)子[Haarki等，生物技術(shù)7，596-600(1989)]或pkil啟動(dòng)子[Schindler等，基因130，271-275(1993)]，對(duì)于米曲霉是amy-啟動(dòng)子[Christensen等，第19屆分子遺傳學(xué)Lunteren講演文摘F23(1987)，Christensen等，生物技術(shù)6，1419-1422(1988)，Tada等，分子普通遺傳學(xué)(Md.Gen.Genet.)229，301(1991)]，對(duì)于黑曲霉是glaA-啟動(dòng)子[Cullen等，生物/技術(shù)5，369-376(1987)，Gwynne等，生物/技術(shù)5，713-719(1987)，Ward，分子工業(yè)真菌學(xué)，絲狀真菌的系統(tǒng)和應(yīng)用，MarcelDekker，紐約，83-106(1991)]，alcA-啟動(dòng)子[Gwynne等，生物/技術(shù)5，718-719(1987)]，suc1-[Boddy等，現(xiàn)代遺傳學(xué)(Curr.Genet.)，24，60-66(1993)]，aphA-啟動(dòng)子[MacRae等，基因71，339-348(1988)，MacRae等，基因132，193-198(1993)]，tpiA啟動(dòng)子[McKnight等，細(xì)胞46，143-147(1986)，Upshall等，生物/技術(shù)5，1301-1304(1987)]，gpdA-[Punt等，基因69，49-57(1988)，Punt等，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)17，19-37(1991)]和pkiA-啟動(dòng)子[de Graaff等，現(xiàn)代遺傳學(xué)，22，21-27(1992)]?？捎糜谠诮湍钢斜磉_(dá)的合適的啟動(dòng)子元件在本領(lǐng)域是已知的且它們是，例如，pho5-啟動(dòng)子[Vogel等，分子細(xì)胞生物學(xué)，2050-2057(1989)；Rudolf和Hinnen，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，84，1340-1344(1987)]或用于在啤酒糖酵母和巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)的gap-啟動(dòng)子，例如，aoxl-啟動(dòng)子[Koutz等，酵母(Yeast)5，167-177(1989)；Sreekrishna等，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志，28，265-278(1988)]，或FMD啟動(dòng)子[Hollenberg等，EPA No.0299108]或用于多形漢遜氏酵母的MOX-啟動(dòng)子[Ledeboer等，核酸研究13，3063-3082(1985)]。
因此，含有本發(fā)明的DNA序列，優(yōu)選用于在細(xì)菌或真菌或酵母宿主中表達(dá)所述DNA序列的載體和其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或真菌或酵母宿主也是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供允許蛋白質(zhì)，優(yōu)選本發(fā)明的植酸酶類共有植酸酶在漢遜氏酵母中高度表達(dá)的系統(tǒng)，其特征在于根據(jù)用于表達(dá)的生物，例如在本例中的酵母(例如，見實(shí)施例3)的常用密碼子表選擇編碼該蛋白質(zhì)DNA序列的密碼子，并任選按實(shí)施例3中的具體情況所述的方式選擇信號(hào)序列的密碼子。這意味著根據(jù)編碼給定蛋白質(zhì)家族的氨基酸序列的DNA序列中所用的密碼子做出常用密碼子表。然后從用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的常用密碼子表中選擇設(shè)計(jì)信號(hào)序列的DNA序列的密碼子，從而使用在兩表中常用性相當(dāng)?shù)某Ｓ妹艽a子。
一旦在合適的培養(yǎng)基的合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)了該DNA序列，如果所編碼的蛋白質(zhì)被分泌進(jìn)培養(yǎng)基，則可從該培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)，或者如果該蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，則用蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域已知的方法或?qū)χ菜崦杆龅姆椒?，例如在EP420358中所述從宿主生物分離該蛋白質(zhì)。因此，制備本發(fā)明多肽的方法其特征在于在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或宿主細(xì)胞，從中回收該多肽，以該方法生產(chǎn)的多肽或以本發(fā)明的DNA序列編碼的多肽也是本發(fā)明的目的。
一旦獲得，可鑒定本發(fā)明的多肽在農(nóng)業(yè)中有用的特征，可使用本領(lǐng)域已知的和由，例如Simons等[Br.J.Nutr.64，525-540(1990)]，Schoner等[動(dòng)物生理學(xué)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志(J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.)，66，248-255(1991)]，Vogt[Arch.Geflugelk.56，93-98(1992)]，Jongbloed等[動(dòng)物科學(xué)雜志(J.Anim.Sci.)，70，1159-1168(1992)]，Perney等[Poultry Sci.72，2106-2114(1993)]，F(xiàn)arrell等[動(dòng)物生理學(xué)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志，69，278-283(1993)]，Broz等[Br.Poultry Sci.35，273-280(1994)]和Dungelhoef等[動(dòng)物飼料科學(xué)技術(shù)(Animal Feed Sci.Technol.)，49，1-10(1994)]所述的任何試驗(yàn)。
一般來說，可使用本發(fā)明的多肽而不局限于特定的應(yīng)用領(lǐng)域，例如，植酸酶可用于將諸如肌醇六磷酸的肌醇多磷酸轉(zhuǎn)變成肌醇和無機(jī)磷酸鹽。
而且，本發(fā)明的多肽可用于制備藥用組合物或復(fù)合食品或飼料，其中，該組合物的成分與一種或多種本發(fā)明的多肽混合。因此，含有一種或多種本發(fā)明的多肽的復(fù)合食品或飼料或藥用組合物也是本發(fā)明的主題。本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)其制備方法是熟悉的。該藥用組合物或復(fù)合食品或飼料可進(jìn)一步包括一般用于該目的且在現(xiàn)有技術(shù)中已知的添加劑或成分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供降低動(dòng)物糞便中肌醇六磷酸水平的方法，其特征在于以在將飼料中肌醇六磷酸轉(zhuǎn)變成肌醇和無機(jī)磷酸鹽中有效量的這種飼料組合物飼養(yǎng)動(dòng)物。
在更詳細(xì)地描述本發(fā)明前，下面提供了對(duì)表和附圖的簡(jiǎn)短解釋。
表1所用的真菌植酸酶的氨基酸序列的權(quán)重。該表顯示了用于計(jì)算真菌植酸酶共有序列的權(quán)重。
表2真菌植酸酶的同源性。以程序GAP(GCG程序包，9；Devereux等，1984)使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)比較序列對(duì)比中所用的植酸酶的氨基酸序列。比較局限于部分序列，即也用于缺乏差異較大的信號(hào)肽的序列對(duì)比的序列(見圖1的說明)。斜線上和下的數(shù)值分別代表氨基酸相同性和相似性。
表3真菌共有植酸酶與用于其計(jì)算的植酸酶的氨基酸序列同源性。使用程序GAP(GCG程序包，9.0)比較了所有植酸酶的氨基酸序列與真菌共有植酸酶序列。另外，比較局限于用于序列對(duì)比的部分序列。
表4用于將單個(gè)突變導(dǎo)入真菌共有植酸酶的引物。為了導(dǎo)入各突變，需要兩個(gè)含所需突變的引物(見實(shí)施例8)。改變的三聯(lián)體密碼子以黑體字母來突出。
表5真菌共有植酸酶和來自煙曲霉，黑色曲霉，構(gòu)巢曲霉和嗜熱毀絲霉的植酸酶的最適溫度和Tm值。最適溫度來自圖3。用實(shí)施例10所述和圖7所示的差示掃描量熱術(shù)測(cè)定Tm值。



圖1從幾乎所有已知的真菌植酸酶氨基酸序列的序列對(duì)比計(jì)算共有植酸酶序列。字母代表以單字母代碼表示的氨基酸殘基。下面的序列用于序列對(duì)比來自土曲霉9A-1的phyA(Mitchell等，1997；從氨基酸(aa)27)，來自土曲霉cbs 116.46的phyA(van Loon等，1997；從aa27)，來自黑色曲霉變種awamori的phyA(Piddington等，1993；從aa27)，來自黑色曲霉T213的phyA(從aa27)，來自黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA(van Hartingsveldt等，1993；從aa27)，來自煙曲霉ATCC13073的phyA(Pasamontes等，1997b；從aa25)，來自煙曲霉ATCC32722的phyA(van Loon等，1997；從aa27)，來自煙曲霉ATCC58 128的phyA(van Loon等，1997；從aa27)，來自煙曲霉ATCC26906的phyA(van Loon等，1997；從aa27)，來自煙曲霉ATCC32239的phyA(van Loon等，1997；從aa30)，來自構(gòu)巢曲霉的phyA(Pasamontes等，1997a；從aa25)，來自嗜熱踝節(jié)菌的phyA(Pasamontes等，1997a；從aa24)，來自嗜熱毀絲霉的phyA(Mitchell等，1997；從aa19)。使用程序PILEUP計(jì)算序列對(duì)比。人工推敲缺口位置。在給定位置的對(duì)比序列中大寫的氨基酸殘基屬于形成共有殘基的氨基酸聯(lián)合。在計(jì)算的共有序列下面，以黑體顯示了最終構(gòu)建的真菌共有植酸酶(Fcp)的氨基酸序列。根據(jù)實(shí)施例2所述的原理人工補(bǔ)齊計(jì)算的共有序列中的缺口。
圖2真菌共有植酸酶基因(fcp)和用于基因構(gòu)建的合成引物的DNA序列。使用程序BACKTRANSLATE(Devereux等，1984)和高度表達(dá)的酵母基因的常用密碼子表(GCG程序包，9.0)將計(jì)算的氨基酸序列(圖1)轉(zhuǎn)變成DNA序列。來自土曲霉cbs的植酸酶的信號(hào)肽與N-末端融合。黑體堿基代表用于產(chǎn)生基因的寡核苷酸的序列。各自的寡核苷酸名稱在序列上面或下面注明。下面劃線的堿基代表基因的起始和終止密碼子。斜體字堿基表示兩個(gè)導(dǎo)入的Eco RI位點(diǎn)。
圖3真菌共有植酸酶和用于計(jì)算共有序列的其它植酸酶的最適溫度。為了測(cè)定最適溫度，在37℃至85℃之間的一系列溫度下進(jìn)行植酸酶標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)施例5純化所用的植酸酶。，真菌共有植酸酶；，煙曲霉13073植酸酶；□，黑色曲霉NRRL3135植酸酶；○，構(gòu)巢曲霉植酸酶；■，土曲霉9A-1植酸酶；●土曲霉cbs植酸酶。
圖4真菌共有植酸酶和突變體Q50L、Q50T和Q50G的pH-依賴性活性圖。在不同的pH值下使用在合適緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(見實(shí)施例9)測(cè)定植酸酶活性。圖a)顯示了真菌共有植酸酶(●)與突變體Q50L()、Q50T()和Q50G(○)的活性百分?jǐn)?shù)的比較。圖b)顯示了使用在多形漢遜氏酵母中表達(dá)的純化酶的比活比較真菌共有植酸酶(○)與突變體Q50L(●)和Q50T()。
圖5與真菌共有植酸酶突變體Q50L和Q50T相比，突變體Q50L、Y50N和Q50T、Y51N的pH-依賴活性圖。在不同的pH值下使用在合適緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(見實(shí)施例9)測(cè)定植酸酶活性。圖a)顯示了突變Y51N(●)對(duì)突變體Q50L(○)的影響。圖b)顯示了相同突變(●)對(duì)突變體Q50T(○)的影響。
圖6真菌共有植酸酶和其突變體Q50L、Q50T和Q50G的底物特異性。線段表示與用肌醇六磷酸(100％)的活性相比，用各種已知天然和合成的磷酸化化合物的相對(duì)活性。
圖7真菌共有植酸酶和其突變體Q50T的差示掃描量熱術(shù)(DSC)。蛋白質(zhì)樣品濃縮至大約50-60mg/ml并用10mM乙酸鈉，pH5.0充分透析。使用10℃/分的恒定加熱速率加熱到90℃。共有植酸酶Q50T的DSC(上圖)產(chǎn)生78.9℃的解鏈溫度，它幾乎相同于真菌共有植酸酶的解鏈溫度(78.1℃，下圖)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例參考實(shí)施例煙曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的同源性模型比較煙曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的氨基酸序列與三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)用X射線晶體學(xué)測(cè)定的黑色曲霉NRRL3135植酸酶的序列(見圖1)。
黑曲霉NRRL3135植酸酶、煙曲霉植酸酶和土曲霉cbs116.46植酸酶的多氨基酸序列的序列對(duì)比用程序“PILEUP”(Prog.Menu forthe Wisconsin Package，version 8，1994年9月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)公司(Genetics Computer Group)，575Science Drive，MadisonWisconcin，USA53711)計(jì)算。煙曲霉植酸酶和土曲霉cbs116.46植酸酶的三維模型使用黑色曲霉NRRL3135植酸酶的結(jié)構(gòu)作模板并根據(jù)分別與煙曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的氨基酸的序列對(duì)比交換黑色曲霉NRRL3135植酸酶的氨基酸來建立。使用程序Moloc(Gerber和Muller，1995)進(jìn)行模型構(gòu)建和能量最優(yōu)化。C-α位置保持固定，除新的插入/缺失和遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的袢環(huán)區(qū)域外。
在外部袢環(huán)中可觀察到模型結(jié)構(gòu)與原始晶體結(jié)構(gòu)僅有較小的區(qū)別。而且構(gòu)建了主要在以假單胞菌屬細(xì)菌植酸酶進(jìn)行的植酸(肌醇六磷酸)降解途徑中出現(xiàn)的以及由黑色曲霉NRRL3135植酸酶(Cosgrove，1980)測(cè)定的不同底物分子并構(gòu)成各植酸酶結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)腔。各底物以建議用于組氨酸酸性磷酸酶的假定結(jié)合模式(VanEtten，1982)定向。易切割的磷酸基團(tuán)定向于催化必需的His59以形成共價(jià)磷酸酶中間產(chǎn)物。裂解后由Asp339質(zhì)子化的底物磷酸酯鍵的氧定向于質(zhì)子供體。用程序Moloc.經(jīng)能量最優(yōu)化進(jìn)行底物剩余結(jié)構(gòu)部分以及周圍活性位點(diǎn)的構(gòu)象松弛。
根據(jù)結(jié)構(gòu)模型鑒定在活性位點(diǎn)腔中的殘基。超過一半(60％)的這些位置在三個(gè)植酸酶中相同，而只有少數(shù)位置不保守(見圖1)。這些觀察結(jié)果可延伸到四個(gè)其它的植酸酶序列(構(gòu)巢曲霉，土曲霉9A1，嗜熱踝節(jié)菌，嗜熱毀絲霉)。
實(shí)施例1真菌植酸酶氨基酸序列的序列對(duì)比使用來自序列分析包Release9.0的程序PILEUP(Devereux等，1984)以標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(缺口產(chǎn)生罰12分，缺口延伸罰4分)計(jì)算序列對(duì)比。使用文本編輯程序精選缺口位置。無信號(hào)序列的下列序列(見圖1)用于以以下述氨基酸(aa)起始進(jìn)行序列對(duì)比來自土曲霉9A-1的phyA基因，aa27(Mitchell等，1997)來自土曲霉cbs116.46的phyA基因，aa27(van Loon等，1997)來自黑色曲霉變種awamori的phyA基因，aa27(Piddington等，1993)來自黑色曲霉T213的phyA基因，aa27來自黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA基因，aa27(vanHartingsveldt等，1993)來自煙曲霉ATCC13073的phyA基因，aa26(Pasamontes等，1997)來自煙曲霉ATCC32722的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)來自煙曲霉ATCC58128的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)來自煙曲霉ATCC26906的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)來自煙曲霉ATCC32239的phyA基因，aa30(van Loon等，1997)來自構(gòu)巢曲霉的phyA基因，aa25(Roche Nr.R1288，Pasamontes等，1997a)來自嗜熱踝節(jié)菌ATCC20186的phyA基因，aa24(Pasamontes等，1997a)
來自嗜熱毀絲霉的phyA基因，aa19(Mitchell等，1997)表2顯示了上述植酸酶序列的同源性。
實(shí)施例2真菌共有植酸酶氨基酸序列的計(jì)算使用實(shí)施例1所述的精選序列對(duì)比，以來自序列分析包Release9.0的程序PRETTY(Devereux等，1984)計(jì)算共有序列。PRETTY以其所排列的各欄打印序列且可表現(xiàn)出序列對(duì)比的共有序列。指定所有序列關(guān)于所比較的植酸酶氨基酸序列之間相似性的權(quán)重。設(shè)定權(quán)重，例如，來自一個(gè)序列亞組(相同的來源種但不同的菌株)的所有植酸酶的組合影響，例如，設(shè)定所選定的來自煙曲霉的所有植酸酶的氨基酸序列為1，這意味著各序列提供菌株序列數(shù)除1的值(見表1)。以這種方式可防止，例如，來自不同煙曲霉菌株的植酸酶中極相似的氨基酸序列控制計(jì)算的共有序列。
用下列參數(shù)開始程序PRETTY限定小于該值則無共有序列的票數(shù)設(shè)定為2.0，確定小于該值的氨基酸殘基不能用作殘基的聯(lián)合的計(jì)分基值的閾值設(shè)定為2。對(duì)多肽PRETTY使用PrettyPep.Cmp共有計(jì)分基礎(chǔ)。
根據(jù)下列規(guī)則人工補(bǔ)充序列對(duì)比的10個(gè)位置(位置46、66、82、138、162、236、276、279、280、308；圖1)；如果存在最常見的殘基，則選擇該殘基(138、236、280)；如果存在化學(xué)上相似或相當(dāng)?shù)臍埢某Ｒ娀鶊F(tuán)，選擇帶有該基團(tuán)的最常見的一個(gè)殘基或如果不可能，則選擇帶有該基團(tuán)的一個(gè)殘基(46、66、82、162、276、308)。如果既無常見殘基，又無常見基團(tuán)，根據(jù)其對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響的常見假定選擇一個(gè)現(xiàn)存殘基(279)。八個(gè)其它位置(132、170、204、211、275、317、384、447；圖1)不用以該程序選擇的氨基酸殘基補(bǔ)充但一般用與該程序選擇的殘基相同頻率出現(xiàn)的氨基酸來補(bǔ)充。在大多數(shù)情況下，以這種校正法排除對(duì)三個(gè)黑曲霉序列的略微低估(總權(quán)重0.99)。
表3顯示了所計(jì)算的真菌共有植酸酶氨基酸序列與用于該計(jì)算的植酸酶序列的同源性。
實(shí)施例3將真菌共有植酸酶氨基酸序列轉(zhuǎn)變成DNA序列使用土曲霉cbs116.46植酸酶的前26個(gè)氨基酸殘基作為信號(hào)肽并因此融合到所有共有植酸酶的N末端。對(duì)于這一段序列，我們使用一種特定的方法計(jì)算相應(yīng)的DNA序列。Purvis等(1987)認(rèn)為在基因中摻入稀少密碼子對(duì)蛋白質(zhì)的折疊效力有影響。因此，至少稀少密碼子在土曲霉cbs116.46信號(hào)序列(用于真菌共有植酸酶且對(duì)該蛋白質(zhì)的分泌極重要，但轉(zhuǎn)變成啤酒糖酵母的慣用密碼子)中的分布轉(zhuǎn)變成用于在啤酒糖酵母中表達(dá)的新信號(hào)序列。對(duì)于該蛋白質(zhì)的其余部分，我們使用從GCG程序包獲得的高度表達(dá)的啤酒糖酵母基因的常用密碼子表將計(jì)算的氨基酸序列翻譯成DNA序列。
所得的fcp基因序列在圖2中顯示。
實(shí)施例4真菌共有植酸酶序列的構(gòu)建和克隆交替使用有意義和反義鏈的序列，將計(jì)算的真菌共有植酸酶的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每個(gè)寡核苷酸與其前面和其后面的反鏈寡核苷酸重疊20bp。從Microsynth，Balgach(瑞士)購(gòu)買的和以PAGE純化形式獲得的所有引物的位置在圖2中表示。
在三個(gè)PCR反應(yīng)中，合成的寡核苷酸組成完整的基因。為進(jìn)行PCR，使用來自Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國(guó))的高保真(High Fidelity Kit)試劑盒和來自AMS生物技術(shù)(歐洲)有限公司(Lugano，瑞士)的熱循環(huán)儀The ProtokolTM。
寡核苷酸CP-1至CP-10(混合物1，圖2)與每種寡核苷酸各為0.2pMol/μl的濃度混合。用CP-9至CP-22(每種寡核苷酸各0.2pMol/μl)制備第二種寡核苷酸混合物(混合物2)。另外，在PCR反應(yīng)中使用四種短引物
CP-a Eco RI5’-TAT ATG AAT TCA TGG GCG TGT TCG TC-3’CP-b5’-TGA AAA GTT CAT TGA AGG TTT C-3’CP-c5’-TCT TCG AAA GCA GTA CAA GTA C-3’CP-e Eco RI5’-TAT ATG AAT TCT TAA GCG AAA C-3’PCR反應(yīng)a10μl混合物1(每種寡核苷酸各2.0pmol)2μl核苷酸(每種核苷酸各10mM)2μl引物CP-a(10pmol/μl)2μl引物CP-c(10pmol/μl)10.0μl PCR緩沖液0.75μl聚合酶混合物73.25μl H2OPCR反應(yīng)b10μl混合物2(每種寡核苷酸各2.0pmol)2μl核苷酸(每種核苷酸各10mM)2μl引物CP-b(10pmol/μl)2μl引物CP-e(10pmol/μl)10.0μl PCR緩沖液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反應(yīng)a和b的反應(yīng)條件步驟1 2分鐘-45℃步驟2 30秒-72℃步驟3 30秒-94℃
步驟4 30秒-52℃步驟5 1分鐘-72℃步驟3至5重復(fù)40次。
以瓊脂糖凝膠電泳(0.9％瓊脂糖)并隨后凝膠提取(QIAEX II凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden，德國(guó))純化PCR產(chǎn)物(670和905bp)。純化的DNA片斷用于PCR反應(yīng)c。
PCR反應(yīng)c6μl反應(yīng)a的PCR產(chǎn)物(≈50ng)6μl反應(yīng)b的PCR產(chǎn)物(≈50ng)2μl引物CP-a(10pmol/μl)2μl引物CP-e(10pmol/μl)10.0μl PCR緩沖液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反應(yīng)c的反應(yīng)條件步驟1 2分鐘-94℃步驟2 30秒-94℃步驟3 30秒-55℃步驟4 1分鐘-72℃步驟2至4重復(fù)31次。
如上所述純化所得的PCR產(chǎn)物(1.4kb)，用Eco RI消化，并連接進(jìn)Eco RI消化的且去磷酸化的pBsk(-)-載體(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中。將1μl連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。按Sambrook等(1987)所述進(jìn)行所有標(biāo)準(zhǔn)程序。經(jīng)測(cè)序(質(zhì)粒pBsk-fcp)證實(shí)所構(gòu)建的真菌共有植酸酶基因(fcp)。
實(shí)施例5真菌共有植酸酶基因fcp及其變異體在啤酒糖酵母中的表達(dá)及其從培養(yǎng)物上清中的純化從質(zhì)粒pBsk-fcp分離真菌共有植酸酶基因，連接進(jìn)啤酒糖酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen，San Diego，CA，USA)表達(dá)盒的Eco RI位點(diǎn)或按Janes等(1990)所述亞克隆進(jìn)變短的GAPFL(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子與pho5終止子之間。經(jīng)PCR檢查基因的正確取向。根據(jù)Hinnen等(1978)完成啤酒糖酵母菌株，例如，INVSc1(Invitrogen，San Diego，CA，USA)的轉(zhuǎn)化。挑選含有在GAPFL啟動(dòng)子控制下的植酸酶基因的單一菌落并在30℃下在5ml選擇培養(yǎng)基(SD-尿嘧啶，Sherman等，1986)中劇烈搖動(dòng)(250rpm)培養(yǎng)一天。然后將預(yù)培養(yǎng)物加入500mlYPD培養(yǎng)基(Sherman等，1986)中并在相同條件下生長(zhǎng)。根據(jù)廠商建議進(jìn)行g(shù)al1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。培養(yǎng)4天后，離心(7000rpm，GS3轉(zhuǎn)子，15分鐘，5℃)細(xì)胞培養(yǎng)液以去掉細(xì)胞并在Amicon8400杯(PM30膜)和ultrafree-15離心過濾裝置(Biomax-30K，Millipore，Bedford，MA，USA)中以超濾方式濃縮上清液。以10mM乙酸鈉，pH5.0用作洗脫緩沖液將濃縮物(10ml)在40ml Sephadex G25 Superfine柱(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))上脫鹽。脫鹽的樣品放入2M(NH4)2SO4中并直接上樣到1mlButyl Sepharose 4 Fast Flow疏水相互作用色譜柱(PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))上，用在10mM乙酸鈉，pH5.0中從2M至0M(NH4)2SO4的線型梯度洗脫。在臨界點(diǎn)洗脫了植酸酶，濃縮并上樣到120ml Sephacryl S-300凝膠滲透色譜柱(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))上。真菌共有植酸酶和真菌共有植酸酶7作為均一的對(duì)稱峰洗脫且以SDS-PAGE顯示為大約95％的純度。
實(shí)施例6真菌共有植酸酶基因fcD及其變異體在多形漢遜氏酵母中的表達(dá)經(jīng)過將編碼共有植酸酶或變異體的pBsk-fcp的Eco RI片斷插入多形漢遜氏酵母表達(dá)載體pFPMT121的多克隆位點(diǎn)來構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化多形漢遜氏酵母的植酸酶表達(dá)載體，其中pFPMT121以u(píng)ra3選擇標(biāo)記和FMD啟動(dòng)子為基礎(chǔ)。fcp基因的5’端與FMD啟動(dòng)子融合，3’端與MOX終止子融合(Gellissen等，1996；EP0299108B)。所得的表達(dá)載體命名為pFPMTfcp和Bsk-fcp7。
在大腸桿菌中繁殖構(gòu)建的質(zhì)粒。使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化質(zhì)粒DNA。使用Gelissen等，(1996)所述的用于感受態(tài)細(xì)胞制備和酵母轉(zhuǎn)化的方法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)乳清苷-5’-磷酸脫羧酶(ura3)缺陷型多形漢遜氏酵母菌株RP11。將各轉(zhuǎn)化的混合物涂布到含2％葡萄糖和1.8％瓊脂的YNB(0.14％w/v Difco YNB和0.5％硫酸銨)中并在37℃培養(yǎng)。4至5天后挑出單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落并在上述液體培養(yǎng)基上37℃生長(zhǎng)2天。隨后，將該培養(yǎng)物的等分試樣用于接種含2％葡萄糖的YNB培養(yǎng)基的新鮮瓶。在選擇培養(yǎng)基中再傳代7次后，將表達(dá)載體以多體形式整合進(jìn)酵母基因組。隨后，再經(jīng)過在3ml非選擇培養(yǎng)基(YPD，2％葡萄糖，10g酵母提取物和20g蛋白胨)中的2個(gè)培養(yǎng)步驟獲得分裂穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。為了獲得遺傳上均一的重組菌株，將來自最后穩(wěn)定培養(yǎng)物的等分試樣涂布到選擇平板上。分離單個(gè)菌落用于在含2％甘油代替葡萄糖以抑制fmd啟動(dòng)子的YNB中分析植酸酶表達(dá)。按實(shí)施例5所述進(jìn)行真菌共有植酸酶的純化。
實(shí)施例7真菌共有植酸酶基因fcp及其變異體在黑色曲霉中的表達(dá)質(zhì)粒pBsk-fcp或fcp基因變異體的相應(yīng)質(zhì)粒用作將Bsp HI位點(diǎn)導(dǎo)入該基因起始密碼子上游和將Eco RV位點(diǎn)導(dǎo)入終止密碼子下游的模板。使用ExpandTM高度保真PCR試劑盒(BoehringerMannheim，Mannheim，德國(guó))及下列引物引物Asp-1Bsp HI5’-TAT ATC ATG AGC GTG TTC GTC GTG CAT CTGTTC-3’用于fcp和fcp7克隆的引物Asp-2
3’-ACC CGA CTT ACA AAG CGA ATTCTA TAGATATAT-5’Eco RV按供應(yīng)商所述進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增的fcp基因在起始密碼子處有一個(gè)由引物Asp-1導(dǎo)入的新的Bsp HI位點(diǎn)，這導(dǎo)致第二個(gè)氨基酸殘基甘氨酸被絲氨酸取代。隨后，用Bsp HI和Eco RV消化DNA片斷并連接進(jìn)黑色曲霉葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子(glaA)下游的Nco I位點(diǎn)和構(gòu)巢曲霉色氨酸C終止子(trpC)上游的Eco RV位點(diǎn)(Mullaney等，1985)。克隆步驟后，測(cè)序基因以檢查PCR可能導(dǎo)入的錯(cuò)誤?；旧舷鄳?yīng)于EP684313實(shí)施例9所述的pGLAC載體的所得表達(dá)質(zhì)粒含有粗糙鏈孢霉乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyr4)作為選擇標(biāo)記。按EP684313所述進(jìn)行黑色曲霉的轉(zhuǎn)化和共有植酸酶基因的表達(dá)。按實(shí)施例5所述純化真菌共有植酸酶。
實(shí)施例8構(gòu)建真菌共有植酸酶突變體為了構(gòu)建在黑色曲霉，啤酒糖酵母，多形漢遜氏酵母中表達(dá)的突變體，含真菌共有植酸酶基因的相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒用作定點(diǎn)誘變的模板。使用來自Stratagene(La Jolla，CA，USA)的“quick exchangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖邪凑諒S商的方案并使用相應(yīng)的引物導(dǎo)入突變。制備的所有突變和相應(yīng)的引物在表4中概括。以本領(lǐng)域已知的DNA序列分析鑒定含有所需突變的克隆。經(jīng)過完整基因的測(cè)序證實(shí)突變的植酸酶。
實(shí)施例9植酸酶活性和共有植酸酶及其變異體最適溫度的測(cè)定基本上按Mitchell等(1997)所述測(cè)定植酸酶活性。在含0.5％植酸(≈5mM)，200mM乙酸鈉，pH5.0的試驗(yàn)混合物中測(cè)定活性。在37℃培養(yǎng)15分鐘后，加入等體積的15％的三氯乙酸終止反應(yīng)。經(jīng)過混合100μl試驗(yàn)混合物與900μl H2O和1ml 0.6M H2SO4，2％抗壞血酸和0.5％鉬酸銨定量釋放的磷酸。磷酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液用作參考。一單位的酶活定義為37℃下每分鐘釋放1μmol磷酸的酶量。使用根據(jù)Pace等(1995)計(jì)算的280nm處酶的消光系數(shù)真菌共有植酸酶，1.101；真菌共有植酸酶7，1.068確定蛋白質(zhì)濃度。
對(duì)于pH最適值曲線，純化的酶在10mM乙酸鈉，pH5.0中稀釋。經(jīng)過將稀釋的蛋白質(zhì)等分試樣與在一系列不同緩沖液0.4M甘氨酸/HCl，pH2.5；0.4M乙酸/NaOH，pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；0.4M咪唑/HCl，pH6.0、6.5；0.4M Tris/HCl pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0中的等體積的1％植酸(≈10mM)混合開始保溫。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示混合步驟僅對(duì)pH有微弱的影響。如上所述在37℃下進(jìn)行保溫15分鐘。
為了測(cè)定植酸酶的底物特異性，試驗(yàn)混合物中的植酸用5mM濃度的各種磷酸化合物代替。如上所述進(jìn)行活性測(cè)定。
為了測(cè)定溫度最適值，在給定溫度下預(yù)保溫酶(100μl)和底物溶液(100μl)。經(jīng)過向酶中加入底物溶液開始反應(yīng)。保溫15分鐘后，用三氯乙酸終止反應(yīng)并測(cè)定釋放的磷酸量。
原始真菌共有植酸酶的最適pH大約為pH6.0-6.5(70U/mg)。經(jīng)過導(dǎo)入Q50T突變，最適pH變?yōu)閜H6.0(130U/mg)，而在相同位置以亮氨酸取代導(dǎo)致大約在pH5.5產(chǎn)生最大活性(212U/mg)。Q50G導(dǎo)致活性的最適pH超過pH6.0(見圖4)。在位置51用天冬酰胺交換酪氨酸導(dǎo)致pH5.0下的活性相對(duì)增加(見圖5)。特別是用Q50L突變顯著增加真菌共有植酸酶對(duì)植酸的特異性(見圖6)。
真菌共有植酸酶的最適溫度(70℃)比用于計(jì)算共有序列的野生型植酸酶的最適溫度(45℃-55℃)高15℃-25℃(見表5和圖3)。
實(shí)施例10以差示掃描量熱術(shù)(DSC)測(cè)定解鏈溫度為了測(cè)定真菌共有植酸酶的解折疊溫度，按以前公開的Brugger等(1997)所述進(jìn)行差別掃描量熱術(shù)。50-60mg/ml均一的植酸酶溶液用于該試驗(yàn)。進(jìn)行10℃/分鐘的恒定加熱率以達(dá)到90℃。
測(cè)定的解鏈溫度清楚地表明與野生型植酸酶相比真菌共有植酸酶熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)(見表5和圖7)。圖7顯示了真菌共有植酸酶及其突變體Q50T的解鏈情況。其共同的解鏈溫度測(cè)定為78至79℃。
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表1土曲霉9A-1的植酸酶 0.50土曲霉cbs116.46的植酸酶 0.50黑色曲霉變種awamori的植酸酶 0.3333黑色曲霉T213的植酸酶 0.3333黑色曲霉菌株NRRL3135的植酸酶 0.3333煙曲霉ATCC13073的植酸酶 0.20煙曲霉ATCC32722的植酸酶 0.20煙曲霉ATCC58128的植酸酶 0.20煙曲霉ATCC26906的植酸酶 0.20煙曲霉ATCC32239的植酸酶 0.20構(gòu)巢曲霉的植酸酶 1.00嗜熱踝節(jié)菌ATCC20186的植酸酶 1.00嗜熱毀絲霉的植酸酶 1.00表2％相同性


％相以性表3植酸酶 相同性[％] 相似性[％]黑色曲霉T213 76.6 79.6黑色曲霉變種awamori 76.6 79.6黑色曲霉菌株NRRL3135 76.6 79.4構(gòu)巢曲霉 77.4 81.5土曲霉9A-1 70.7 74.8土曲霉cbs116.46 72.1 75.9煙曲霉ATCC13073 80.0 83.9煙曲霉ATCC32239 78.2 82.3嗜熱踝節(jié)菌 72.7 76.8嗜熱毀絲霉 58.3 64.5表4表4突變 引物對(duì)Ssp BIQ50L 5’-CAC TTG TGG GGT TTG TAC AGT CCA TAC TTC TC-3’5’-GAG AAG TAT GGA CTG TAC AAA CCC CAC AAG TG-3’KpnIQ50T 5’-CAC TTG TGGGGT ACCTAC TCT CCA TAC TTC TC-3’5’-GA GAA GTA TGG AGA GTA GGT ACC CCA CAA GTG-3’Q50G 5’-CAC TTG TGG GGT GGT TAC TCT CCA TAC TTC TC-3’5’-GA GAA GTA TGG AGA GTA ACC ACC CCA CAA GTG-3’KpnIQ50T-Y51N 5’-CAC TTG TGGGGT ACCAAC TCT CCA TAC TTC TC-3’5’-GA GAA GTA TGG AGA GTT GGT ACC CCA CAA GTG-3’BsaIQ50L-Y51N 5’-CAC TTG TGGGGT CTCAAC TCT CCA TAC TTC TC-3’5’-GA GAA GTA TGG AGA GTT GAG ACC CCA CAA GTG-3’
表5


權(quán)利要求
1.一種制備具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的共有蛋白質(zhì)的方法，其中該方法的特征在于以下步驟a)用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比程序?qū)Ρ冉o定蛋白質(zhì)家族的至少3個(gè)、優(yōu)選4個(gè)氨基酸序列；b)以本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)程序比較按該序列對(duì)比在相同位置的氨基酸的進(jìn)化相似性，而將該程序提供的限定氨基酸最小相似性的相似性程度設(shè)定為較不嚴(yán)格數(shù)，該最小相似性用于確定相應(yīng)位置的氨基酸，設(shè)定參數(shù)使該程序能夠僅從相應(yīng)位置的2個(gè)相同氨基酸確定為共有蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸；然而，如果比較的氨基酸序列中是互相間比與其余序列顯示出更高程度相似性的序列，那么這些序列以其共有序列表示，該共有序列按與用于共有蛋白的共有序列的本方法中相同的方式來確定，或?qū)@些序列中的每一個(gè)指定以這種序列的數(shù)目除1的選擇權(quán)重；c)如果以該程序鑒定在限定位置沒有共同氨基酸，則選擇所有這類序列中的任意一個(gè)氨基酸，優(yōu)選最常見的氨基酸；d)一旦限定了共有序列，將該序列轉(zhuǎn)譯為DNA序列，優(yōu)選使用在其中發(fā)生表達(dá)的生物的常用密碼子表進(jìn)行轉(zhuǎn)譯；e)以本領(lǐng)域已知的方法合成DNA序列，用整合進(jìn)合適的表達(dá)載體中的形式或以其自身轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；f)在合適的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以本領(lǐng)域已知的方法從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)基分離該共有蛋白質(zhì)。
2.按權(quán)利要求
1所要求的方法，其中用于在限定位置比較氨基酸的進(jìn)化相似性的程序是程序“PRETTY”。
3.按權(quán)利要求
1所要求的方法，其中給定的蛋白質(zhì)家族是植酸酶家族。
4.按權(quán)利要求
3所要求的方法，其中植酸酶來源于真菌。
5.按權(quán)利要求
1至4中任意一項(xiàng)所要求的方法，其中宿主細(xì)胞為真核生物來源的。
6.按權(quán)利要求
5所要求的方法，其中真核生物指真菌。
7.按權(quán)利要求
6所要求的方法，其中所述真菌選自曲霉和酵母。
8.按權(quán)利要求
7所要求的方法，其中所述酵母選自糖酵母屬和漢遜氏酵母屬。
9.可獲自權(quán)利要求
1至8中任意一項(xiàng)所要求的方法的共有蛋白質(zhì)。
10.一種食品、飼料或藥用組合物，含有權(quán)利要求
9所要求的共有蛋白質(zhì)。
專利摘要
本發(fā)明涉及共有植酸酶、從許多真菌植酸酶的序列制備共有植酸酶的方法。還涉及以該方法制備的共有植酸酶及其變異體或突變體。本發(fā)明還涉及含有該共有植酸酶的食品，飼料或藥用組合物。
文檔編號(hào)C12R1/865GKCN1526815SQ200410004373
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期1998年7月23日
發(fā)明者M·雷曼, M 雷曼 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 弗 哈夫曼-拉羅切有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan