專利名稱:突變的d-氨基轉(zhuǎn)移酶和使用它們生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種用于生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的D-氨基轉(zhuǎn)移酶，特別涉及以氨基酸取代的方式使野生型D-氨基轉(zhuǎn)移酶突變所獲得的突變D-氨基轉(zhuǎn)移酶，其可自monatin前體有效生產(chǎn)(2R，4R)-monatin。本發(fā)明還涉及ー種使用突變D-氨基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)谷氨酸衍生物,如monatin的(2R，4R)異構(gòu)體的方法。
背景技術(shù)：
由下列結(jié)構(gòu)式(3)表示的4_(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-谷氨酸(3-(1-氨基-1，3- ニ羧基-3-輕基-丁 -4-基)-Π引哚)(下文稱作“ monatin”)存在于植物Schlerochitomilicifolius的根中，而且因為它甜度非常高，是ー種特別有前途的低-卡路里甜味劑(JP64-25757 A)
權(quán)利要求
1.一種由在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中經(jīng)下列(1)-(12)取代中的任一取代的氨基酸序列組成的蛋白 (1)第181位的絲氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代； (2)第243位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代； (3)第243位的絲氨酸殘基被亮氨酸殘基取代；
(4)第243位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (5)第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (6)第243位的絲氨酸殘基被谷胺酰胺殘基取代； (7)第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (8)第180位的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (9)第180位的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代和第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (10)第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代和第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (11)第100位的天門冬酰胺殘基被丙氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (12)第182位的丙氨酸殘基被絲氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代。
2.一種由在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中經(jīng)下列取代(i)-(vii)中的任一取代的氨基酸序列組成的蛋白 (i)用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基； ( )用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基； (iii)用丙氨酸殘基取代第180位的絲氨酸殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基； (iv)用丙氨酸殘基取代第180位的絲氨酸殘基并用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基; (v)用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基并用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基； (vi)用丙氨酸殘基取代第100位的天門冬酰胺殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基；和 (vii)用絲氨酸殘基取代第182位的丙氨酸殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基。
3.一種由在SEQ ID NO :4所示氨基酸序列中經(jīng)下列(a')和(b')中的任一種取代的氨基酸序列組成的蛋白 (a')用賴氨酸或天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基；和 (b')用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基。
4.一種用于生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的方法，包括在有權(quán)利要求
1-3任何一項的蛋白和氨基供體存在的條件下，使由下列通式(I)表示的酮酸反應(yīng)
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的用于生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述R是苯基或口引噪基。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的用于生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述氨基供體是氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的用于生產(chǎn)旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述反應(yīng)是在反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行的，該反應(yīng)系統(tǒng)還含有酶，該酶具有催化將L-氨基酸轉(zhuǎn)化成D-氨基酸的反應(yīng)的活性，或該反應(yīng)系統(tǒng)還含有具有這種酶活性的微生物。
8.一種編碼在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中經(jīng)下列(1)-(12)取代中的任一種取代的氨基酸序列組成的蛋白的DNA (1)第181位的絲氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代； (2)第243位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代； (3)第243位的絲氨酸殘基被亮氨酸殘基取代； (4)第243位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (5)第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (6)第243位的絲氨酸殘基被谷胺酰胺殘基取代； (7)第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (8)第180位的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (9)第180位的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代和第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (10)第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代和第244位的絲氨酸殘基被賴氨酸殘基取代； (11)第100位的天門冬酰胺殘基被丙氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代； (12)第182位的丙氨酸殘基被絲氨酸殘基取代和第243位的絲氨酸殘基被天門冬酰胺殘基取代。
9.一種編碼在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中經(jīng)下列(i)-(vii)取代中的任一種取代的氨基酸序列組成的蛋白的DNA (i)用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基； ( )用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基；(iii)用丙氨酸殘基取代第180位的絲氨酸殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的 絲氨酸殘基； (iv)用丙氨酸殘基取代第180位的絲氨酸殘基并用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基; (v)用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基并用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基； (vi)用丙氨酸殘基取代第100位的天門冬酰胺殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基；和 (vii)用絲氨酸殘基取代第182位的丙氨酸殘基并用天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基。
10.一種編碼在SEQ ID NO :4所示氨基酸序列中經(jīng)下列(a')和(b')的任一取代的氨基酸序列組成的蛋白的DNA (a')用賴氨酸或天門冬酰胺殘基取代第243位的絲氨酸殘基；和 (b')用賴氨酸殘基取代第244位的絲氨酸殘基。
11.一種通過將權(quán)利要求
8-10任一項的DNA與載體DNA連接獲得的重組DNA。
12.—種用權(quán)利要求
11的重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
13.一種用于生產(chǎn)具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
12的細(xì)胞并在所述培養(yǎng)基和/或所述細(xì)胞中積聚具有所述D-氨基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。
專利摘要
通過取代SEQ ID NO2所示野生型D-氨基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列中涉及有效生產(chǎn)(2R，4R)-monatin的至少一個位置(第100、180-183、243和244位)處的氨基酸而修飾D-氨基轉(zhuǎn)移酶，從而自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸有效生產(chǎn)高甜度的(2R，4R)-monatin。
文檔編號C12P17/10GKCN1723281 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200380105550
公開日2012年8月15日 申請日期2003年12月9日
發(fā)明者杉山雅一, 柏木立己, 渡部乙比古, 鈴木榮一郎 申請人:味之素株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (4),