專利名稱:微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3－丙二醇和2，3丁二醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇(PDO)是一種重要的化工原料，可作為有機溶劑應(yīng)用于油墨、印染、涂料、潤滑劑、抗凍劑等行業(yè)。1，3-丙二醇最主要的用途是作為聚酯和聚氨酯合成的單體，特別是與對苯二甲酸聚合生成的聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)，顯示了比以1，2-丙二醇、丁二醇、乙二醇為單體合成的聚合物更優(yōu)良的性能。目前全球每年消費數(shù)千萬噸聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，而PTT的化學(xué)穩(wěn)定性、生物可降解性等與PET相當(dāng)，但耐污染性、韌性和回彈性及抗紫外性能等更優(yōu)越。此外PTT纖維還具有耐磨、吸水性低、低靜電等優(yōu)點，可在地毯領(lǐng)域與尼龍競爭。它還可用于具有優(yōu)良性能的無紡布、工程塑料、服裝、家庭裝飾、墊襯料、織物等方面。PTT被評為美國98年六大石化新產(chǎn)品之一，被認(rèn)為將是PET的升級產(chǎn)品。
PTT的優(yōu)越性能及市場潛力早在50年前就被人們所認(rèn)識，只因原料1，3-丙二醇生產(chǎn)技術(shù)難度大、成本高而導(dǎo)致PTT很難大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止，只有Dupont和Shell兩家跨國公司采用傳統(tǒng)的化學(xué)合成路線，以環(huán)氧乙烷或丙烯為原料生產(chǎn)僅供它們合成PTT自用的1，3-丙二醇。化學(xué)合成法的缺點是副產(chǎn)物多，選擇性差，操作條件需高溫高壓，設(shè)備投資巨大，原料為不可再生資源，且環(huán)氧乙烷和另一路線的中間產(chǎn)物丙烯醛分別是易燃易爆或劇毒的危險品。由于發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇選擇性高，操作條件溫和，因此近年來受到特別的重視。
2，3-丁二醇(2，3-butanediol)作為發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的一種副產(chǎn)物也是一種重要的化工原料。它是一種無色無味液體，可作為燃料，可用來制備聚合物、油墨、香水、防凍劑、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥以及藥物的手性載體等。2，3-丁二醇還可作為一個很有價值的化工原料來合成其他化學(xué)品，如2，3-丁二醇脫水可產(chǎn)生甲乙酮，甲乙酮的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，再進一步脫水可形成1，3-丁二烯。2，3-丁二醇可通過Diels-Alder反應(yīng)聚合生成苯乙烯。2，3-丁二醇與甲乙酮縮合并進行加氫反應(yīng)生成辛烷，辛烷可用來產(chǎn)生高質(zhì)量的飛行原料。2，3-丁二醇與乙酸反應(yīng)生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯類可添加到奶油中改善風(fēng)味。但由于其在1，3-丙二醇發(fā)酵中產(chǎn)量較低，一般不作為產(chǎn)物進行分離、提純。
目前，由甘油發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇主要有以下幾條途徑1)采用腸道細(xì)菌厭氧條件下將甘油歧化為1，3-丙二醇(USP5254467，EP0373230 A1)。
2)克雷伯氏桿菌等厭氧菌在厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇(Ruch etal.Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes.J Bacteriol.1974，119(1)50-56；Streekstra et al.Overflow metabolism during anaeric growthof Klebsiella pneumoniae NCTC418 on glycerol and dihydroxyacetone inchemostat culture.Arch Microbiol.1987，147268-275；Zeng et al.Pathwayanalysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniaeRegulation ofreducing equivalent balance and product formation.Enzyme Microbiol Technol.1993，15770-779.)。
3)采用克雷伯氏桿菌在微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇(王劍鋒等，克雷伯氏菌微氧發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的研究，現(xiàn)代化工，2001，21(5)28-31。修志龍等，一種微生物微氧發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，中國專利公開號CN1348007)4)采用克雷伯氏桿菌在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇(Biebl et al.Fermentation of glycerol to 1，3-propanediol and 2，3-butanediol.Appl Microbiol Biotechnol，1998，5024-29)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，其特征在于所述由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法是采用微生物前期厭氧、后期好氧的兩段發(fā)酵新工藝。第一步厭氧發(fā)酵是將種子液加入含甘油濃度為20-80g/l的工業(yè)甘油或甘油發(fā)酵液的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵溫度30～40℃條件下利用厭氧菌進行厭氧發(fā)酵，在發(fā)酵的過程中通入0.2-0.4vvm的惰性氣體氮氣或二氧化碳，發(fā)酵開始3～5小時后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)；第二步進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度仍保持在30～40℃，在發(fā)酵過程中通入空氣或氧氣，通氣量為0.2-0.6vvm，發(fā)酵過程中同時流加500-1000g/l甘油、50-200g/l葡萄糖和3-5M氫氧化鈉，其中甘油∶葡萄糖∶氫氧化鈉＝10∶1∶1(w/w/w)。發(fā)酵結(jié)束時通過常規(guī)的脫鹽、蒸餾和真空精餾步驟將1，3-丙二醇和2，3-丁二醇分離、提純，制備產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果采用前期厭氧后期好氧的兩段發(fā)酵新工藝，可通過兩段發(fā)酵過程中通氣量的調(diào)節(jié)以及兩段發(fā)酵轉(zhuǎn)換時機的控制來調(diào)控1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的產(chǎn)物濃度。提高產(chǎn)物濃度、得率和生產(chǎn)強度，并在得到產(chǎn)物1，3-丙二醇的同時將較高濃度的2，3-丁二醇分離，得到了產(chǎn)物2，3-丁二醇，從而有效提高原料利用率，降低生產(chǎn)成本。
具體實施方式
本發(fā)明提供一種微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，所述由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法是采用微生物前期厭氧、后期好氧的兩段發(fā)酵新工藝第一步厭氧發(fā)酵是將種子液加入含甘油濃度為20-80g/l的工業(yè)甘油或甘油發(fā)酵液的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度30～40℃條件下利用厭氧菌-克雷伯氏桿菌進行厭氧發(fā)酵，在發(fā)酵的過程中通入0.2-0.4vvm的惰性氣體氮氣或二氧化碳等，發(fā)酵開始3～5小時后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)；第二步進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度仍保持在30～40℃，在發(fā)酵過程中通入空氣或氧氣，通氣量為0.2-0.6vvm，發(fā)酵過程中同時流加500-1000g/l甘油、50-200g/l葡萄糖和3-5M氫氧化鈉，其中甘油∶葡萄糖∶氫氧化鈉＝10∶1∶1(w/w/w)，發(fā)酵結(jié)束時通過常規(guī)的脫鹽、蒸餾和真空精餾步驟將1，3-丙二醇和2，3-丁二醇分離、提純，制備產(chǎn)品。
下面再舉具體實施例對本發(fā)明予以進一步說明。
實例1(1)菌種克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)M5al(2)培養(yǎng)基培養(yǎng)基組分 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基 微量元素溶液(/l) (/l) (mg/l)甘油 20g 20-80g ZnCl270K2HPO4·3H2O 4.45g 2.225g MnCl2·4H2O 100(NH4)2SO42.0g 2.0g H3BO360KH2PO41.3g 0.65g CoCl2·6H2O 200MgSO4·7H2O 0.2g 0.2g NiCl2·6H2O 25酵母粉 1.0g 1.5g NiCl2·H2O 27.64微量元素溶液 2ml 2ml Na2MoO4·2H2O 35CaCO32.0g CuCl2·H2O 20消泡劑 0.1ml CuSO4·5H2O 29.28濃鹽酸(37％) 0.9ml(3)培養(yǎng)方式A.種子培養(yǎng)甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接至LB斜面，30℃下活化12小時。種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ml三角瓶，裝液量100ml。培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
B.發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)使用5L發(fā)酵罐，裝液量4L，培養(yǎng)溫度35℃，pH值7。發(fā)酵過程中用含濃度為50g/l的工業(yè)甘油的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵開始3.5小時后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)。
(4)發(fā)酵方式克雷伯氏桿菌發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度控制為35℃，前期厭氧發(fā)酵，通入氮氣，通氣量0.2vvm。在發(fā)酵進行至30小時進行后期好氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入空氣，通氣量0.2vvm，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速150rpm。。
(5)發(fā)酵結(jié)果如下發(fā)酵共進行68小時，殘余甘油濃度8.3g/l，發(fā)酵液中含1，3-丙二醇61.7g/l，2-丁二醇20g/l，乳酸12g/l濃度，醋酸5g/l。1，3-丙二醇摩爾得率0.48，生產(chǎn)強度0.91g/(1h)，2，3-丁二醇摩爾得率0.13?？偠寄柕寐?.61實例2(1)菌種同實例1(2)培養(yǎng)基同實例1(3)培養(yǎng)方式A.種子培養(yǎng)甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接至LB斜面，30℃下活化12小時。種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ml三角瓶，裝液量100ml。培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
B.發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)使用5L發(fā)酵罐，裝液量4L，培養(yǎng)溫度37℃，pH值7。發(fā)酵過程中用含濃度為30g/l工業(yè)甘油的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵開始4小時后流加800g/l甘油和80g/l葡萄糖混合溶液。其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)(4)發(fā)酵方式克雷伯氏桿菌發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度控制為37℃，前期厭氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入二氧化碳，通氣量0.2vvm。在發(fā)酵進行至32小時進行后期好氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入空氣，通氣量0.2vvm，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速150rpm。。
(5)發(fā)酵結(jié)果如下發(fā)酵共進行68小時，殘余甘油濃度10.7g/l，發(fā)酵液中含1，3-丙二醇69.6g/l，2，3-丁二醇16g/l，乳酸9.2g/l濃度，醋酸5.2g/l。1，3-丙二醇摩爾得率0.51，生產(chǎn)強度1.0g/(1h)，2，3-丁二醇2，3-丁二醇0.09?？偠寄柕寐?.6.
實例3(1)菌種同實例1(2)培養(yǎng)基同實例1(3)培養(yǎng)方式A.種子培養(yǎng)甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接至LB斜面，30℃下活化12小時。種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ml三角瓶，裝液量100ml。培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
B.發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)使用5L發(fā)酵罐，裝液量4L，培養(yǎng)溫度40℃，pH值7。發(fā)酵過程中用含80g/l甘油的甘油發(fā)酵液作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵開始5小時后流加1000g/l甘油和100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)。
(4)發(fā)酵方式克雷伯氏桿菌發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度控制為40℃，前期厭氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入氮氣，通氣量0.2vvm。在發(fā)酵進行至32小時進行后期好氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入空氣，通氣量0.2vvm，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速150rpm。
(5)發(fā)酵結(jié)果如下發(fā)酵共進行68小時，殘余甘油濃度11.8g/l，發(fā)酵液中含1，3-丙二醇52.4g/l，2，3-丁二醇10.6g/l，乳酸7.4g/l濃度，醋酸3.7g/l。1，3-丙二醇摩爾得率0.53，生產(chǎn)強度0.77g/(1h)，2，3-丁二醇摩爾得率0.09?？偠寄柕寐?.62。
權(quán)利要求
1.一種微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，其特征在于所述由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法是采用微生物前期厭氧、后期好氧的兩段發(fā)酵工藝第一步厭氧發(fā)酵是將種子液加入含甘油濃度為20-80g/l的工業(yè)甘油或甘油發(fā)酵液的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度30～40℃條件下利用厭氧菌進行厭氧發(fā)酵，在發(fā)酵的過程中通入0.2-0.4vvm的惰性氣體氮氣或二氧化碳，發(fā)酵開始3～5小時后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)；第二步進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度仍保持在30～40℃，在發(fā)酵過程中通入空氣或氧氣，通氣量為0.2-0.6vvm，發(fā)酵過程中同時流加500-1000g/l甘油、50-200g/l葡萄糖和3-5M氫氧化鈉，其中甘油∶葡萄糖∶氫氧化鈉＝10∶1∶1(w/w/w)。發(fā)酵結(jié)束時通過常規(guī)的脫鹽、蒸餾和真空精餾步驟將1，3-丙二醇和2，3-丁二醇分離、提純，制備產(chǎn)品。
專利摘要
本發(fā)明公開了屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
，是采用前期厭氧后期好氧兩段發(fā)酵的新工藝?yán)梦⑸镉筛视屯瑫r生產(chǎn)1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的方法，發(fā)酵過程中先將種子液加入含工業(yè)甘油或甘油發(fā)酵液的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵開始3～5小時后流加甘油和葡萄糖混合溶液。通過兩段發(fā)酵過程中通氣量的調(diào)節(jié)以及發(fā)酵溫度的控制來調(diào)控1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的產(chǎn)物濃度，發(fā)酵結(jié)束時通過脫鹽、蒸餾、真空精餾等步驟將1，3－丙二醇和2，3－丁二醇分離、提純，制備產(chǎn)品。該方法可以有效提高1，3－丙二醇的發(fā)酵濃度、得率和生產(chǎn)強度，同時還可獲得較高濃度的2，3－丁二醇，從而提高了的原料利用率、降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/18GKCN1570123SQ200410037692
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月29日
發(fā)明者劉德華, 孫燕, 程可可, 劉衛(wèi)斌, 劉宏娟 申請人:清華大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan