專利名稱:用于核酸擴(kuò)增的裝置和方法
用于核酸擴(kuò)增的裝置和方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于核酸擴(kuò)增的方法和裝置，具體涉及進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增的方法和裝置。然而應(yīng)理解，本發(fā)明不僅限于此種特定的應(yīng)用領(lǐng)域。
發(fā)明背景
提供以下對現(xiàn)有技術(shù)的討論是為了將本發(fā)明置于合適的技術(shù)背景中，并有利于完全理解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。然而應(yīng)理解，整個(gè)說明書中對現(xiàn)有技術(shù)的討論不應(yīng)被認(rèn)為是表示或暗示，這些現(xiàn)有技術(shù)被廣泛認(rèn)為或構(gòu)成本領(lǐng)域普通知識(shí)的一部分。
PCR是涉及通過多個(gè)循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增某種多核苷酸序列(毎次完成一個(gè)循環(huán))的技術(shù)。PCR技術(shù)是眾所周知的，在許多書籍中均由描述，包括《PCR:實(shí)踐方法》(PCR:A Practical Approach) M.J.McPherson 等，IRL 出版社(1991), Innis 等，《PCR 方案:方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols:A Guideto Method and Applications),學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) (1990)以及《PCR技術(shù):用于DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用》(PCR Technology:Principals andApplications for DNA Amplification)H.A.Erlich,斯托克頓出版社(StocktonPress) (1989)。PCR 也可參見許多美國專利，包括 US 4，683，195 ;4，683，202 ；4，800, 159 ;4，965，188 ;4，889，818 ;5，075, 216 ;5，079, 352 ;5，104, 792 ;5，023, 171 ；5，091，310 ;和 5，066，584。
PCR技術(shù)一般包括以下步驟:變性多核苷酸，然后將至少ー對引物寡核苷酸退火到變性的多核苷酸上，即使引物與變性的多核苷酸模板雜交。退火步驟之后，具有聚合酶活性的酶催化合成一條新的摻入了引物寡核苷酸的多核苷酸鏈，并使用最初的變性多核苷酸作為合成模板。這一系列步驟(變性、引物退火和引物延伸)構(gòu)成ー個(gè)PCR循環(huán)。
隨著循環(huán)的重復(fù)，新合成的多核苷酸的量指數(shù)増加，因?yàn)橛奢^早循環(huán)新合成的多核苷酸可用作后續(xù)循環(huán)的合·成模板。一般選擇可退火至給定雙鏈多核苷酸序列的相對鏈的成對引物寡核苷酸，以便擴(kuò)增這兩個(gè)退火位點(diǎn)之間的區(qū)域。
DNA的變性一般發(fā)生在約90-95 °C，引物一般在約40_60°C退火至變性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步驟一般在約70-75°C進(jìn)行。因此，在PCR循環(huán)中，必須改變反應(yīng)混合物的溫度，在多循環(huán)PCR實(shí)驗(yàn)中要多次改變。
PCR技術(shù)具有廣泛的生物學(xué)應(yīng)用，包括例如，DNA序列分析、探針產(chǎn)生、克隆核酸序列、定位誘變、檢測基因突變、診斷病毒感染、分子“指紋分析”和監(jiān)測生物液體和其他來源中的污染微生物。
除PCR外,本領(lǐng)域還了解和使用其他體外擴(kuò)增技術(shù)，包括如Landegren和Hood,US4，988，617所述的連接酶鏈反應(yīng)。更一般地，生物技術(shù)領(lǐng)域：
已知的幾種重要方法，例如核酸雜交和測序依賴于以受控方式改變含有樣品分子的溶液溫度。常規(guī)技術(shù)依賴于使用單個(gè)孔或管在不同溫度區(qū)域上循環(huán)。然而，已經(jīng)提出連續(xù)流動(dòng)法。然而，這些裝置需要使用高壓泵通過狹窄的管道移動(dòng)流體，這限制了這些裝置在PCR小型化和自動(dòng)化中的實(shí)用性。然而，實(shí)現(xiàn)這些方法的自動(dòng)化和小型化仍然是本領(lǐng)域的期望目標(biāo)，具體說，在必須同時(shí)分析大量樣品或需要分析少量樣品的情況下特別需要自動(dòng)化和小型化。另外，也需要提供能減少樣品處理，從而降低污染概率，特別是DNA樣品污染概率，同時(shí)能夠使用相對便宜的實(shí)驗(yàn)隔室設(shè)備的裝置和方法。
本發(fā)明的目的是克服或改善至少ー項(xiàng)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，或提供有用的替代方式。

發(fā)明內(nèi)容
按照第一個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)備，該設(shè)備包括:
平臺(tái)，其包括:
適應(yīng)接受流體樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)的樣品隔室，和
多個(gè)反應(yīng)隔室，
經(jīng)調(diào)整，所述平臺(tái)能將所述流體樣品基本均勻地分配到所述多個(gè)反應(yīng)隔室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
按照第二個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的方法，該方法包括:
提供平臺(tái)，該平臺(tái)包括:樣品隔室，和
多個(gè)反應(yīng)隔室，
向所述樣品隔室中加入流體樣品，進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，和
將所述流體樣品基本均勻地分配到所述多個(gè)反應(yīng)隔室中，進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
按照第三個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的方法，該方法包括:按照第一個(gè)方面提供設(shè)備，向所述樣品隔室中加入流體樣品并進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，將所述流體樣品基本均勻地分配到所述多個(gè)反應(yīng)隔室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
在一個(gè)例子中，所述第一擴(kuò)增反應(yīng)使用多種引物(多種引物對)同時(shí)擴(kuò)增許多靶點(diǎn)，直至未發(fā)生競爭的點(diǎn)。然后，任選稀釋來自第一擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物(下文詳述)，并將其分配于反應(yīng)隔室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。各反應(yīng)隔室優(yōu)選含有ー對引物。應(yīng)理解，本發(fā)明設(shè)備和方法提供在任選稀釋和分配第一擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物時(shí)減少手工介入，從而降低污染概率的顯著優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用本發(fā)明設(shè)備和方法能認(rèn)識(shí)到許多其他優(yōu)點(diǎn)。
優(yōu)選地，該平臺(tái)可旋轉(zhuǎn)，且施加離心カ后該流體樣品可基本均勻地從樣品隔室分配到多個(gè)反應(yīng)隔室中。然而應(yīng)理解，該流體樣品可通過其他方式由樣品隔室基本均勻地分配到多個(gè)反應(yīng)隔室中。優(yōu)選地，多個(gè)反應(yīng)隔室呈放射狀位于樣品隔室外部。優(yōu)選地，所述多個(gè)反應(yīng)隔室包括以陣列形式分布在所述可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)外圍的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)隔室。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述流體樣品通過，例如計(jì)量歧管的方式基本均勻地分配于多個(gè)輻射狀外部反應(yīng)隔室中，所述歧管位于反應(yīng)隔室和樣品隔室之間。優(yōu)選地，該樣品隔室通過通道與計(jì)量歧管流體連通，該計(jì)量歧管進(jìn)而通過多個(gè)通道與多個(gè)輻射狀的外部反應(yīng)隔室流體連通。應(yīng)理解，術(shù)語“流體連通”和“流體相連”可互換使用，應(yīng)被認(rèn)為是隔室(或歧管)之間的通道。
應(yīng)理解，第一擴(kuò)增反應(yīng)可以在輻射狀內(nèi)部樣品隔室中進(jìn)行，分配或計(jì)量分配到多個(gè)輻射狀的外部反應(yīng)隔室中時(shí)，可進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。還應(yīng)理解，作為第二擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果的流體樣品也可被任選稀釋并計(jì)量分配到次級(jí)反應(yīng)隔室陣列中，以便進(jìn)行第三擴(kuò)增反應(yīng)或進(jìn)ー步的化學(xué)反應(yīng)。。[0027]在另ー個(gè)實(shí)施方式中，各反應(yīng)隔室通過通道與計(jì)量歧管流體相連，所述通道具有閥形式的選擇性流動(dòng)器件，以便選擇性地允許流體流過。在其他實(shí)施方式中，樣品隔室也通過通道與計(jì)量歧管流體相連，該通道具有選擇性允許流體流過的選擇性流動(dòng)器件。
在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)量歧管可同時(shí)用作稀釋隔室來稀釋反應(yīng)的流體樣品。在這個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)量歧管可含有稀釋流體，將引入計(jì)量歧管的流體樣品稀釋并基本均勻地計(jì)量分配到多個(gè)輻射狀的外部反應(yīng)隔室中。然而，在另ー實(shí)施方式中，提供以流體方式介于樣品隔室和計(jì)量歧管之間的單獨(dú)的稀釋隔室。在這種實(shí)施方式中，輻射狀的內(nèi)部樣品隔室與稀釋隔室流體連通，其進(jìn)而與計(jì)量歧管流體連通，其進(jìn)而與輻射狀外部反應(yīng)隔室陣列流體連通。
在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其包括:可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)，具有多個(gè)輻射狀內(nèi)部樣品隔室，每個(gè)樣品隔室接受多種流體樣品中的ー種，并進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，所述各樣品隔室與各個(gè)稀釋隔室流體連通，所述各稀釋隔室與各個(gè)計(jì)量歧管流體連通，一般將所述稀釋的流體樣品基本均勻地分配到輻射狀外部反應(yīng)隔室的各個(gè)陣列中，進(jìn)行多個(gè)第二擴(kuò)增反應(yīng)，所述各反應(yīng)隔室通過具有選擇性允許流體流過的選擇性流動(dòng)器件的通道與各個(gè)計(jì)量歧管流體相連，其中施加足夠的離心力能選擇性地將所述流體從ー個(gè)隔室中轉(zhuǎn)運(yùn)到下一個(gè)隔室中。
本發(fā)明也涉及ー種進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增的方法，所述方法包括以下步驟:按照前述實(shí)施方式提供設(shè)備，向所述樣品隔室中加入流體樣品，進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，向所述稀釋隔室中加入稀釋液體，施加足夠的離心カ以將所述流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到所述稀釋隔室中稀釋所述樣品，施加足夠的離心力將所述稀釋的樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到所述計(jì)量歧管中，致動(dòng)所述選擇性流動(dòng)器件，施加足夠的離心力將所述稀釋的流體樣品基本均勻地分配到所述反應(yīng)隔室中，并進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)是基本平坦的圓形或環(huán)形盤。然而，在其他實(shí)施方式中，可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)是圓形/環(huán)形盤的一個(gè)扇面或區(qū)段(即楔形)，優(yōu)選只具有1-2個(gè)樣品隔室(以及其各自的稀釋/測量隔室)(下文進(jìn)ー步討論)。應(yīng)理解，上述環(huán)形平臺(tái)或楔形平臺(tái)可安置在互補(bǔ)的可轉(zhuǎn)底座·中，該底座提供用于轉(zhuǎn)運(yùn)流體的離心力，并任選加熱/冷卻不同隔室以進(jìn)行核酸擴(kuò)增?；蛘?，以成套設(shè)備的形式単獨(dú)提供隔室和通道，可通過互補(bǔ)的保持插槽將它們可拆卸地約束在可旋轉(zhuǎn)基座中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供基本呈輻射狀延伸的通道，以便使樣品隔室與稀釋隔室，稀釋隔室與計(jì)量歧管，以及計(jì)量歧管與多個(gè)反應(yīng)隔室流體相連。串聯(lián)的通道將樣品隔室、稀釋隔室和計(jì)量歧管流體相連，而并聯(lián)的通道將各反應(yīng)隔室與計(jì)量歧管流體相連。然而應(yīng)理解，使各隔室流體相連的其他構(gòu)造也可能產(chǎn)生類似效果。在另ー實(shí)施方式中，多個(gè)反應(yīng)隔室串聯(lián)流體相連，即所述多個(gè)反應(yīng)隔室中的第一個(gè)反應(yīng)隔室與所述多個(gè)反應(yīng)隔室中的第二個(gè)反應(yīng)隔室流體相連，其進(jìn)而與所述多個(gè)反應(yīng)隔室中的第三個(gè)反應(yīng)隔室流體相連，等等。在這個(gè)實(shí)施方式中，無須將計(jì)量歧管和多個(gè)反應(yīng)隔室中的第一個(gè)反應(yīng)隔室與稀釋隔室流體相連。在另ー個(gè)有些類似的實(shí)施方式中，多個(gè)反應(yīng)隔室與初級(jí)通道并聯(lián)流體相連，而初級(jí)通道與稀釋隔室流體相連。在后兩個(gè)實(shí)施方式中，在離心條件下將稀釋的流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到多個(gè)反應(yīng)隔室中的最后ー個(gè)反應(yīng)隔室中，然后“回充”至前面的反應(yīng)隔室。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該平臺(tái)是圓形或環(huán)形盤，其中樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管、反應(yīng)隔室和通道嵌入該盤的表面中，如附圖所示。然而應(yīng)理解，也可能采取其他構(gòu)造。例如，各隔室、歧管和通道可以基本在ー個(gè)平面上并嵌入盤中，以使各隔室、歧管和通道基本不從該盤的上表面或下表面突出。
樣品隔室優(yōu)選以輻射狀內(nèi)部位置安置，所述多個(gè)反應(yīng)隔室優(yōu)選基本均勻地圍繞該盤外圍的圓周間隔排列；所述稀釋隔室和計(jì)量歧管位于它們之間。這種隔室的排列通常確定了盤的ー個(gè)扇面，該盤可包括多個(gè)扇面。例如，該盤可包括約2-20個(gè)扇面，總共具有約72個(gè)反應(yīng)隔室。然而，該盤可包括少至18個(gè),或多至144個(gè)反應(yīng)隔室。在一個(gè)例子中，可以在具有3個(gè)扇面和72個(gè)反應(yīng)隔室的盤上進(jìn)行24個(gè)基因測定。在另ー個(gè)例子中，可以在具有6個(gè)扇面和72個(gè)反應(yīng)隔室的盤上進(jìn)行12個(gè)基因測定。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可調(diào)整隔室的數(shù)量以適合特定的應(yīng)用/測定。另外，技術(shù)人員應(yīng)理解，扇面的數(shù)量與該盤的物理尺寸成正比。因此，扇面的數(shù)量與各種隔室的相對大小和該盤的物理尺寸有夫。
如上所述，在另選的實(shí)施方式中，該平臺(tái)僅包括圓盤的ー個(gè)扇面/區(qū)段(即楔形)，其中嵌有樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管和反應(yīng)隔室。該模塊排列可用于僅需要擴(kuò)增少量樣品，如I或2種樣品的應(yīng)用，從而避免使用具有許多扇面的整個(gè)盤。然而，在其它實(shí)施方式中，単獨(dú)提供樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管、反應(yīng)隔室和相連的通道，以使它們配合或夾在合適轉(zhuǎn)子裝備的插槽中(在下文中進(jìn)ー步討論)。
樣品隔室的容積約為5 U L-20 u L，稀釋隔室的容積約為100 U L-500 Uし計(jì)量歧管的總?cè)莘e優(yōu)選約為1200 y L，設(shè)置在計(jì)量歧管的輻射狀外壁上的軸向延伸的計(jì)量“漏斗”的總?cè)莘e約為100 u L-600 uし各反應(yīng)隔室的容積約為20 u L-250 uし應(yīng)理解，反應(yīng)隔室的總?cè)莘e大于樣品隔室的容積加上稀釋隔室的容積。另外，應(yīng)理解，設(shè)置在計(jì)量歧管的輻射狀外壁上的軸向延伸的計(jì)量“漏斗”的總?cè)莘e大于前面的樣品隔室與稀釋隔室的總?cè)莘e，從而保證流體樣品基本上均勻地分配到反應(yīng)隔室中。
·[0037]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品隔室和反應(yīng)隔室形成基本呈軸向延伸的基本呈圓柱形的孔。然而，稀釋隔室和計(jì)量歧管優(yōu)選形成基本呈弓形的槽(軸向觀察時(shí))。此外，由于在離心過程中的加速作用下，流體樣品傾向于遷移到稀釋隔室/槽的一端(取決于方向或旋轉(zhuǎn))，所以使稀釋隔室和計(jì)量歧管流體相連的通道優(yōu)選設(shè)置在這些隔室的共同端點(diǎn)處，而不是設(shè)置在中央。這種構(gòu)造的優(yōu)點(diǎn)是，使流體在這些隔室之間根據(jù)旋轉(zhuǎn)方向選擇性流動(dòng)。另夕卜，樣品隔室和/或計(jì)量歧管可具有傾斜的壁部分，以使施加離心カ時(shí)流體傾向于排出至通向后接隔室的通道。
提供使流體從計(jì)量歧管選擇性流動(dòng)到多個(gè)反應(yīng)隔室中的選擇性流動(dòng)器件。選擇性流動(dòng)器件優(yōu)選是預(yù)定熔解溫度為約95°C的蠟閥。因此，將蠟閥周圍區(qū)域的局部溫度提高到預(yù)定的熔解溫度以上能熔化蠟并打開通道，從而允許流體流過。在其它實(shí)施方式中，也可將犧牲閥整合到其它通道中(連接樣品/稀釋隔室，以及稀釋隔室/計(jì)量歧管)。優(yōu)點(diǎn)是，熔化蠟?zāi)茉诹黧w樣品表面上提供表面液封，因?yàn)橄灥拿芏纫话愕陀诹黧w樣品。
在采用蠟閥的實(shí)施方式中，如果需要加熱整個(gè)裝置來進(jìn)行PCR反應(yīng)，那么可能影響蠟閥的完整性。因此，可能需要向樣品隔室局部遞送熱量，例如使用微波或紅外加熱，如國際 PCT 公開號(hào) WO 2003/093407 和 W02003/102226 所述。
如上所述，初始流體樣品從樣品隔室連續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)到稀釋隔室，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到計(jì)量歧管中，最后轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)隔室中。在隔室之間轉(zhuǎn)運(yùn)流體的驅(qū)動(dòng)カ優(yōu)選是通過旋轉(zhuǎn)平臺(tái)，例如CR公司(Corbett Research)出售的Rotor- Gene 裝備施加離心カ(參見國際專利申請?zhí)朠CT/AU98/00277)。該平臺(tái)可以“低”速旋轉(zhuǎn)，最初將流體樣品從樣品隔室移動(dòng)到稀釋隔室，然后以“高”速旋轉(zhuǎn)，將稀釋的流體樣品從稀釋隔室移動(dòng)到計(jì)量歧管中。“低”速可以是約200-750rpm，“高”速大于約800rpm。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，也可采用其它旋轉(zhuǎn)速度獲得類似效果。例如，低速可以是 200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740 或 750rpm，或是以下范圍:約 200-約 220、220_ 約 240、240_ 約260、260-約 280、280-約 300、300-約 320、320-約 340、340-約 360、360-約 380、380-約400、400-約 420、420-約 440、440-約 460、460-約 480、480-約 500、500-約 520、520-約540、540-約 560、560-約 580、580-約 600、600-約 620、620-約 640、640-約 660、660-約680、680-約 700、700-約 720、720-約 740、或約 740-約 750rpm。高速可以是 800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、II10、I120、1130、I140、I150、1160、1170、1180、1190 或 1200rpm，或是以下范圍:約 800-約 820、820_ 約 840、840_ 約 860、860-約 880、880-約 900、900-約 920、920-約 940、940-約 960、960-約 980、980-約 1000、1000-約 1020、1020-約 1040、1040-約 1060、1060-約 1080、1080-約 1100、1100-約 1120、1120-約 1140、1140_ 約 1160、1160_ 約 1180、或 1180-約 1200rpm。
可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)優(yōu)選由耐熱的熱塑性材料，如聚丙烯或聚こ烯構(gòu)成，優(yōu)選注塑成型。然而應(yīng)理解，本發(fā)明設(shè)備可由，例如，玻璃或本領(lǐng)域已知的其他合適材料制成。優(yōu)點(diǎn)是，熱塑性材料可以是在預(yù)定波長下透明的，以便設(shè)置光源/檢測器來監(jiān)測隔室中發(fā)生的反應(yīng)。另夕卜，各隔室、歧管和通道可包括與蓋板密封配合的凸起的上邊緣，蓋板優(yōu)選為透明的可熱融合的塑料板，它具有一對開 孔，以便當(dāng)該板與上邊緣融合吋，該開孔提供到樣品隔室和稀釋隔室的通路，用于向樣品隔室中加入樣品，向稀釋隔室中加入稀釋液。反應(yīng)隔室中可以預(yù)先加入擴(kuò)增試劑，并用蓋板密封(因?yàn)橥ㄈ敕磻?yīng)隔室的通道被選擇性流動(dòng)器件封閉)。
優(yōu)選地，調(diào)整該開孔的尺寸以適應(yīng)自動(dòng)化加樣裝置，例如微量吸移管，如尖頭直徑為1.5mm的標(biāo)準(zhǔn)200 u L塑料吸移管尖頭；直徑Imm的微量吸移管尖頭；壓電或陶瓷液滴輸送系統(tǒng)；和噴墨式流體輸送系統(tǒng)。
在另選的構(gòu)造中，稀釋隔室和計(jì)量歧管可合并成單獨(dú)的稀釋/計(jì)量歧管。為了解釋，最初將流體樣品加入樣品隔室中并進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)。將稀釋流體加入稀釋/計(jì)量歧管中，并施加足夠的離心力，以便將流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到稀釋/計(jì)量歧管中進(jìn)行稀釋。然后，可致動(dòng)選擇性流動(dòng)器件，通過離心力將稀釋的流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到多個(gè)反應(yīng)隔室中進(jìn)行多個(gè)第二擴(kuò)增反應(yīng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，反復(fù)“攪拌”動(dòng)作可應(yīng)用于在稀釋/計(jì)量歧管中混合流體的裝置?；蛘撸烧鹗幵撛O(shè)備以實(shí)現(xiàn)混合。
調(diào)整樣品和反應(yīng)隔室，與熱交換器熱連通，以分別進(jìn)行第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可改造已有的Rotor- Gene 熱循環(huán)設(shè)備以接受本發(fā)明設(shè)備。在這個(gè)實(shí)施方式中，在隔室間轉(zhuǎn)運(yùn)流體所需的旋轉(zhuǎn)是計(jì)算機(jī)控制的。例如，按照第四個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其包括:適合接受第一方面的設(shè)備的基座，按照預(yù)定順序旋轉(zhuǎn)所述設(shè)備以將流體從ー個(gè)隔室選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)到下一個(gè)隔室中的旋轉(zhuǎn)器件，與所述樣品和反應(yīng)隔室熱連通以便為進(jìn)行所述第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)依順序提供熱學(xué)特性的溫度控制元件，以及用于儲(chǔ)存和控制所述順序的可編程控制器。
應(yīng)理解，其他裝備也可適用于本發(fā)明。例如，市售或已有的裝備可能適合接受本文所述的設(shè)備。該裝備可旋轉(zhuǎn)該設(shè)備，可改進(jìn)適合進(jìn)行核酸擴(kuò)增的熱交換器。或者，該裝備可能已適合進(jìn)行核酸擴(kuò)增，并且可能經(jīng)改進(jìn)能夠旋轉(zhuǎn)本文所述的設(shè)備。
例如，雖然Rotor- Gene 裝備包括適合對核酸擴(kuò)增樣品進(jìn)行熱循環(huán)的可旋轉(zhuǎn)基座，但可以預(yù)見其他樣品熱循環(huán)裝置。例如，紅外加熱器可與，例如，溫度傳感器件一起使用，如國際專利申請?zhí)朠CT/AU03/00673(公開號(hào)WO 2003/102522)所述。
按照第五個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增的成套設(shè)備，其包括:按照第一個(gè)方面的設(shè)備；和在反應(yīng)隔室中所含的進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)必需的試劑?；蛘?，或此外，在本發(fā)明設(shè)備具有稀釋隔室的實(shí)施方式中，該稀釋隔室含有稀釋第一擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物所必需的試劑。
按照第六個(gè)方面，第一擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選包括多重PCR反應(yīng)，第二擴(kuò)增反應(yīng)包括巢式或半巢式PCR反應(yīng)。
在其他實(shí)施方式中，該平臺(tái)包括“主旗(home-flag) ”，它可能是反射或吸收條，可設(shè)置在平臺(tái)表面并在平臺(tái)旋轉(zhuǎn)時(shí)被發(fā)射器/光電二極管對感知，從而確定該平臺(tái)相對于該設(shè)備的取向?；蛘?，主旗是標(biāo)簽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)反應(yīng)隔室與計(jì)量歧管并聯(lián)連接，然而在其它實(shí)施方式中，多個(gè)反應(yīng)隔室與計(jì)量歧管串聯(lián)連接。
除非說明書和權(quán)利要求
書中明確說明，術(shù)語‘包括’、‘包含’等應(yīng)被認(rèn)為是包括性含義，而不是排他性或窮舉性含義，也就是說，其含義是“包括但不限于”。
定義·
在說明和要求保護(hù)本發(fā)明的過程中，將依據(jù)以下定義使用以下術(shù)語。也應(yīng)當(dāng)理解本文所使用的術(shù)語僅為了描述本發(fā)明特定的實(shí)施方式而不是限制。除非另有限定，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常理解一致。
出于本發(fā)明目的，術(shù)語“樣品”應(yīng)理解為包括任何流體、溶液或混合物，可分離或檢測為更復(fù)雜混合物的組分，或者由前體物質(zhì)合成。具體說，術(shù)語“流體樣品”應(yīng)理解為包括感興趣的任何生物物質(zhì)。術(shù)語“生物學(xué)樣品”或“生物學(xué)流體樣品”應(yīng)理解為任何生物學(xué)衍生的樣品,包括但不限于:血液、血漿、血清、淋巴、唾液、淚液、腦脊液、尿液、汗液、植物和植物提取物、精液和腹水。應(yīng)理解，術(shù)語“流體樣品”和“反應(yīng)混合物”同義。
出于本發(fā)明目的，術(shù)語“選擇性流動(dòng)器件”應(yīng)理解為可從流體流動(dòng)路徑上選擇性移除的優(yōu)選由可代替材料制成的閥。在優(yōu)選實(shí)施方式中，選擇性流動(dòng)器件是通過各種加熱器件的加熱可從流體流動(dòng)路徑上移除的蠟閥，所述加熱器件包括紅外光照，最優(yōu)選通過激活加熱元件進(jìn)行加熱。適用于本發(fā)明的一種典型的蠟是石蠟。優(yōu)選的蠟不含生物污染物，并且密度小于樣品。
出于本發(fā)明目的，術(shù)語“流體連通”或“流體相連”可互換使用，其旨在定義操作性連接以便使流體在它們之間流動(dòng)的隔室/歧管。
出于本發(fā)明目的，“離心力”是將旋轉(zhuǎn)體拖離旋轉(zhuǎn)中心的表觀力。離心力等于向心力但方向相反。[0058]術(shù)語“串聯(lián)通道”指規(guī)則的線性通道排列，術(shù)語“并聯(lián)通道”指多個(gè)線性排列中的通道的陣列。
附圖簡要說明
下面參照附圖，僅以舉例的方式描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，附圖中:

圖1a是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的設(shè)備的平面圖，其中可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)是具有8個(gè)樣品隔室(以及各隔室的稀釋/計(jì)量隔室)的環(huán)形盤；
圖1b是本發(fā)明另一實(shí)施方式的設(shè)備的平面圖，其中可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)只是具有一個(gè)樣品隔室(以及其稀釋/計(jì)量隔室)的環(huán)形盤的一部分；
圖2是圖1所示設(shè)備的底面圖；
圖3是圖1所示設(shè)備的放大的平面圖；
圖4是圖3所示放大扇面的立體圖；和
圖5是圖4所示裝置的底面立體圖。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式
現(xiàn)在參照附圖進(jìn)行說明，在全部附圖中相同的附圖標(biāo)記指的是相同的部件。在附圖中，本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)核 酸擴(kuò)增的設(shè)備1，其包括通常呈平坦的圓形或環(huán)形盤3的可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)2。在一個(gè)實(shí)施方式中，如圖1b所示，可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)2是圓形或環(huán)形盤的一個(gè)扇面或區(qū)段，即楔形4。在圖1a所示的實(shí)施方式中，可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)2包括多個(gè)輻射狀的內(nèi)部樣品隔室5，用于接受多種流體樣品/反應(yīng)混合物以便進(jìn)行第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。樣品隔室5各自通過通道7與稀釋隔室6流體相連，稀釋隔室6進(jìn)而通過通道9與各計(jì)量歧管8流體相連，以便將各稀釋的流體樣品基本均勻地分配到輻射狀外部反應(yīng)隔室10的陣列中，進(jìn)行多個(gè)第二輪巢式或半巢式擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)隔室10各自通過通道11與計(jì)量歧管8流體相連，通道11具有選擇性允許流體流過的選擇性流動(dòng)器件(未顯示)。
提供基本呈輻射狀延伸的通道7、9和11，它們分別將樣品隔室5與稀釋隔室6、稀釋隔室6與計(jì)量歧管8，計(jì)量歧管8與反應(yīng)隔室10流體相連。并聯(lián)的通道7、9將樣品隔室
5、稀釋隔室6和計(jì)量歧管8流體相連，而并聯(lián)的通道11將各反應(yīng)隔室10與計(jì)量歧管8流體相連。然而應(yīng)理解，使各隔室流體相連的其他構(gòu)造也可能產(chǎn)生類似效果。
樣品隔室5優(yōu)選以輻射狀內(nèi)部位置安置，所述多個(gè)反應(yīng)隔室10優(yōu)選基本均勻地圍繞盤3外圍的圓周間隔排列；所述稀釋隔室6和計(jì)量歧管8位于它們之間。此種隔室排列通常確定盤3的一個(gè)扇面。盤3可包括多個(gè)扇面。例如，該盤可包括約2-20個(gè)扇面，總共具有約72個(gè)反應(yīng)隔室10。然而，該盤可包括少至18個(gè)，或多至144個(gè)反應(yīng)隔室10。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可調(diào)整隔室的數(shù)量以適合特定的應(yīng)用/測定。
樣品隔室5的容積約為5 μ L-20 μ L，稀釋隔室6的容積約為100 μ L-500 μ L。計(jì)量歧管8的總?cè)莘e優(yōu)選約為1200 μ L，設(shè)置在計(jì)量歧管8的輻射狀外壁上的軸向延伸的計(jì)量“漏斗”12的總?cè)莘e約為100 μ L-600 μ L。各反應(yīng)隔室10的容積約為20 μ L-250 μ L。樣品隔室5和反應(yīng)隔室10構(gòu)成基本呈軸向延伸的圓柱狀孔。然而，稀釋隔室6和計(jì)量歧管8優(yōu)選形成基本呈弓形的槽(軸向觀察時(shí))。
初始流體樣品可能從樣品隔室5連續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)到稀釋隔室6，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到計(jì)量歧管8中，最后轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)隔室10中。在隔室之間轉(zhuǎn)運(yùn)流體的驅(qū)動(dòng)力是通過旋轉(zhuǎn)平臺(tái)2施加的離心力。該平臺(tái)可以“低”速旋轉(zhuǎn)，最初將流體樣品從樣品隔室5移動(dòng)到稀釋隔室6，然后以“高”速旋轉(zhuǎn)，將稀釋的流體樣品從稀釋隔室6移動(dòng)到計(jì)量歧管8中。“低”速可以是約200-600rpm，“高”速大于約lOOOrpm。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，也可采用其它旋轉(zhuǎn)速度獲得類似效果。此外，由于在離心過程中的加速作用下，流體樣品傾向于遷移到稀釋隔室6的一端(取決于方向或旋轉(zhuǎn))，所以使稀釋隔室6和計(jì)量歧管8流體相連的通道7優(yōu)選設(shè)置在這些隔室的共同端點(diǎn)處，而不是基本設(shè)置在中央。這種構(gòu)造的優(yōu)點(diǎn)是，使流體在這些隔室之間根據(jù)旋轉(zhuǎn)方向選擇性流動(dòng)。
提供使流體從計(jì)量歧管8選擇性流動(dòng)到多個(gè)反應(yīng)隔室10中的選擇性流動(dòng)器件(未顯示)。選擇性流動(dòng)器件優(yōu)選是預(yù)定熔解溫度為約95°C的蠟閥。因此，將蠟閥周圍區(qū)域的局部溫度提高到預(yù)定的熔解溫度以上能熔化蠟并打開通道，從而允許流體流過。優(yōu)點(diǎn)是，熔化蠟?zāi)茉诹黧w樣品表面上方提供表面液封，因?yàn)橄灥拿芏纫话愕陀诹黧w樣品。
本發(fā)明還提供一種核酸擴(kuò)增的方法，該方法包括提供上述設(shè)備1，向樣品隔室5中加入流體樣品，并向稀釋隔室6中加入稀釋液，然后進(jìn)行第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。然后施加足夠的離心力，以便將流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到稀釋隔室6中稀釋樣品。第二輪反應(yīng)中的組分包括例如，本領(lǐng)域已知的緩沖劑、添加劑等，但不包括第二輪引物。然后施加額外的離心力，以便將稀釋的流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到計(jì)量歧管8中。然后，致動(dòng)選擇性流動(dòng)器件，再施加離心力以便將稀釋的流體樣品分配到反應(yīng)隔室10中。然后同時(shí)進(jìn)行多個(gè)第二輪巢式或半巢式擴(kuò)增反應(yīng)。
應(yīng)理解，上述環(huán)形平臺(tái)2或楔形平臺(tái)4可設(shè)置在互補(bǔ)的可旋轉(zhuǎn)基座(未顯示)中，該基座提供離心力轉(zhuǎn)運(yùn)流體并任選地加熱/冷卻各隔室以便進(jìn)行核酸擴(kuò)增，例如CR公司(Corbett Research)出售的 Rotor- Gene 裝備(參見國際專利申請?zhí)?PCT/AU98/00277)?；蛘撸瑔为?dú)提供樣品隔室5、稀釋隔室6、計(jì)量歧管8、反應(yīng)隔室10和相互連接的通道7、9和11，以使它們配合或夾在合適轉(zhuǎn)子裝備的插槽中。
Rotor- Gene 裝備可包括:適合接受設(shè)備I的基座，按照預(yù)定順序旋轉(zhuǎn)所述設(shè)備I以將流體從一個(gè)隔室選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)到下一個(gè)隔室中的旋轉(zhuǎn)器件，與所述樣品隔室5和反應(yīng)隔室10熱連通以便為進(jìn)行所述第一輪多重和后續(xù)第二輪巢式或半巢式擴(kuò)增反應(yīng)依順序提供熱學(xué)特性的溫度控制·元件，以及用于儲(chǔ)存和控制所述順序的可編程控制器。然而應(yīng)理解，其他裝備也可適用于本發(fā)明。
可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)2優(yōu)選由耐熱的熱塑性材料，如聚丙烯或聚乙烯構(gòu)成，它優(yōu)選為注塑成型。優(yōu)點(diǎn)是，熱塑性材料可以是在預(yù)定波長下透明的，以便設(shè)置光源/檢測器來監(jiān)測隔室5或10中發(fā)生的反應(yīng)。
實(shí)施例
現(xiàn)在參照以下實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例應(yīng)被認(rèn)為是說明性而非限制性的。
在一個(gè)實(shí)施例中，在樣品隔室5中凍干多種引物對。也將單個(gè)第二輪擴(kuò)增引物對凍干到各反應(yīng)隔室10中。反應(yīng)隔室10所含的引物對在樣品隔室5中所用的引物對內(nèi)進(jìn)行巢式或半巢式擴(kuò)增反應(yīng)，以構(gòu)成MT-PCR反應(yīng)。凍干引物后，用塑料板(未顯示)密封設(shè)備1，在樣品隔室5上方留下孔，以便加入啟動(dòng)反應(yīng)的組分，在稀釋隔室6上方留下孔以便引入稀釋劑。
將核酸樣品和主混合物引入帶有油封的樣品隔室5。將第二輪主混合物(MMX2)引入稀釋隔室6,將設(shè)備I放入改造的Rotor-Gene @裝備中。此種Rotor-Gene 裝備具有與反應(yīng)隔室5的底部相接觸的圓周加熱器。圓周加熱器的扇面可利用壓電式電阻加熱器和/或珀耳帖裝置保持不同溫度。
該圓周加熱器也可含有光源和檢測器，以利用插入的熒光染料或UV吸收衡量DNA產(chǎn)量，從而監(jiān)測反應(yīng)過程。這可用于防止在多重PCR反應(yīng)中靶過度擴(kuò)增。
利用步進(jìn)電動(dòng)機(jī)以低速(例如，每分鐘I圈)旋轉(zhuǎn)設(shè)備I。這能將反應(yīng)隔室5中的流體移動(dòng)到不同溫度帶上，以實(shí)現(xiàn)多重內(nèi)部引物的PCR擴(kuò)增。進(jìn)行所需數(shù)量的循環(huán)后，以中等速度旋轉(zhuǎn)設(shè)備1，以便將反應(yīng)隔室5的內(nèi)容物移動(dòng)到稀釋隔室6中。不需要蠟封，因?yàn)樾枰碗x心力將流體從樣品隔室5驅(qū)動(dòng)到稀釋隔室6中。優(yōu)選地，反應(yīng)隔室5具有傾斜的內(nèi)壁，以保證樣品在相對較低的力，即200-600rpm作用下流動(dòng)到稀釋隔室6中?？刹捎媒惶娴捻槙r(shí)針和逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)來徹底混合稀釋的反應(yīng)流體，或者可振動(dòng)步進(jìn)電動(dòng)機(jī)。
高速(即大于IOOOrpm)旋轉(zhuǎn)設(shè)備I將稀釋的反應(yīng)流體轉(zhuǎn)運(yùn)到計(jì)量歧管8中。注意，稀釋的反應(yīng)流體無法進(jìn)入反應(yīng)隔室10，因?yàn)槭褂?jì)量歧管8與反應(yīng)隔室10流體相連的通道11被蠟切斷。將稀釋隔室6和反應(yīng)隔室10之間的通道11加熱到95°C使蠟熔化，在此溫度下高速旋轉(zhuǎn)設(shè)備I將反應(yīng)流體轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)隔室10中。至此，稀釋的主混合物與凍干道各反應(yīng)隔室10中的單獨(dú)的引物對相接觸，使得凍干引物溶解到第二輪PCR反應(yīng)混合物中，并進(jìn)行第二輪巢式或半巢式PCR反應(yīng)?？衫貌迦肴玖?、熒光探針或高分辨率熔體分析實(shí)時(shí)檢測該反應(yīng)。
應(yīng)理解，設(shè)備I的設(shè)計(jì)使得稀釋隔室6中所含的MMX 2在低RPM(200_600rpm)下不進(jìn)入計(jì)量歧管8中。同樣應(yīng)理解，所述蠟形成物理屏障以保證可靠的計(jì)量，也用于消除第二輪PCR中的蒸發(fā)。另外，在反應(yīng)隔室10中，蠟位于反應(yīng)體積上方。
在另一實(shí)施例中 ，改造Rotor- Gene 裝備使其包括環(huán)形加熱元件，將該元件設(shè)置在反應(yīng)隔室下方。該環(huán)形加熱元件由鋁和嵌入的電加熱器構(gòu)成。為了加熱，向該環(huán)形加熱元件施加電流，為了冷卻，采用RG冷卻系統(tǒng)，即利用冷卻鼓風(fēng)機(jī)使空氣通過設(shè)置在環(huán)形加熱兀件下方的散熱器翅片。以低rpm,例如每分鐘I圈旋轉(zhuǎn)設(shè)備I，以便同時(shí)局部加熱樣品隔室5并完成第一輪PCR富集過程。
一旦第一輪PCR富集過程完成后，則拆去該環(huán)形加熱元件，以便加熱器表面迅速移動(dòng)至RG隔室的底部，然后RG開始正常工作。
通過順時(shí)針加速作用旋轉(zhuǎn)設(shè)備1，以便將流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到稀釋隔室6中。然后震蕩設(shè)備1，再次通過加速(逆時(shí)針方向加速)旋轉(zhuǎn)設(shè)備1，以便將稀釋的流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到計(jì)量歧管8中。一旦各計(jì)量漏斗中稀釋的流體樣品相等，則利用Rotor- Gene 裝備加熱(利用常規(guī)的空氣加熱冷卻對流方法)設(shè)備1，熔化蠟并通過旋轉(zhuǎn)將流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到反應(yīng)隔室10中。然后，用Rotor- Gene 裝備進(jìn)行第二輪巢式或半巢式PCR。
雖然參照具體實(shí)施例描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明可通過許多其它形式實(shí)施。
權(quán)利要求
1.ー種進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)備，所述設(shè)備包括: 平臺(tái)，其包括: 適應(yīng)接受流體樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)的樣品隔室，和 多個(gè)反應(yīng)隔室， 所述平臺(tái)可旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力，并且，所述平臺(tái)經(jīng)調(diào)整能將所述流體樣品基本均勻地分布到所述多個(gè)反應(yīng)隔室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)； 所述樣品隔室放射狀設(shè)置于所述反應(yīng)隔室內(nèi)側(cè)。
2.如權(quán)利要求
1所述的設(shè)備，還包括與所述樣品隔室和所述反應(yīng)隔室流體相連的稀釋隔室。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的設(shè)備，其包括計(jì)量歧管和稀釋隔室，其中所述樣品隔室與所述稀釋隔室流體相連，所述稀釋隔室與所述計(jì)量歧管流體相連，所述計(jì)量歧管與所述多個(gè)反應(yīng)隔室流體相連。
4.如權(quán)利要求
3所述的設(shè)備，其包括基本呈放射狀延伸的通道，這些通道在所述樣品隔室、所述稀釋隔室和所述計(jì)量歧管之間提供流體連接。
5.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室、稀釋隔室和計(jì)量歧管串聯(lián)流體相連，所述反應(yīng)隔室各自與所述計(jì)量歧管并聯(lián)流體相連。
6.如權(quán)利要求
4或5所述的設(shè)備，其特征在于，所述平臺(tái)為圓形或環(huán)形盤，所述樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管和反應(yīng)隔室嵌入所述圓形或環(huán)形盤的表面內(nèi)。
7.如權(quán)利要求
6所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)反應(yīng)隔室沿該盤外圍的圓周間隔排列。
8.如權(quán)利要求
7所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管和反應(yīng)隔室確定所述盤的ー個(gè)扇面。
9.如權(quán)利要求
8所述的設(shè)備，其特征在于，所述盤包括多個(gè)扇面。
10.如權(quán)利要求
9所述的設(shè)備，其包括3-12個(gè)扇面。
11.如權(quán)利要求
9或10所述的設(shè)備，其特征在于，每個(gè)扇面包括2-12個(gè)反應(yīng)隔室。
12.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室的容積為5u L-20 u L，所述稀釋隔室的容積為100iiL-500iiL，所述計(jì)量歧管的容積為100iiL-1200iiL，所述反應(yīng)隔室各自的容積為20 u L-250 uし
13.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備,其特征在于，當(dāng)所述平臺(tái)以足夠數(shù)值的rpm旋轉(zhuǎn)時(shí),所述流體樣品流過所述通道。
14.如權(quán)利要求
13所述的設(shè)備,其特征在于,所述rpm數(shù)值為200-1000rpm。
15.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在干，將所述各反應(yīng)隔室與所述計(jì)量歧管流體相連的所述通道包括選擇性允許流體流過的選擇性流動(dòng)器件。
16.如權(quán)利要求
15所述的設(shè)備，其特征在于，所述選擇性流動(dòng)器件是具有預(yù)定的熔解溫度的蠟閥。
17.如權(quán)利要求
16所述的設(shè)備，其特征在于，將所述選擇性流動(dòng)器件周圍的局部溫度提高到預(yù)定的熔解溫度以上能打開所述通道，從而允許流體流過。
18.如權(quán)利要求
17所述的設(shè)備，其特征在于，所述預(yù)定的熔解溫度為約95°C。
19.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室和所述反應(yīng)隔室形成基本呈圓柱形的孔，所述稀釋隔室和所述計(jì)量歧管形成基本呈弓形的槽。
20.如權(quán)利要求
19所述的設(shè)備，其特征在干，將所述稀釋隔室與所述計(jì)量歧管流體連接的所述通道設(shè)置在所述弓形槽的共同端點(diǎn)處，以便根據(jù)所述設(shè)備在加速作用下的旋轉(zhuǎn)方向?qū)⑺鱿♂尭羰抑械牧黧w選擇性移動(dòng)到所述計(jì)量歧管中。
21.如權(quán)利要求
6所述的設(shè)備，其特征在于，所述盤由注塑的熱塑性材料形成。
22.如權(quán)利要求
8所述的設(shè)備，其特征在于，所述盤的扇面由注塑的熱塑性材料形成。
23.如權(quán)利要求
21所述的設(shè)備，其特征在于，所述熱塑性材料在預(yù)定波長下是透明的，以設(shè)置光源/檢測器來監(jiān)測所述樣品隔室或反應(yīng)隔室中發(fā)生的反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室、稀釋隔室、計(jì)量歧管和反應(yīng)隔室各自包括與蓋板密封配合的凸起的上邊緣。
25.如權(quán)利要求
24所述的設(shè)備，其特征在于，所述蓋板是塑料的，所述密封是焊接。
26.如權(quán)利要求
24所述的設(shè)備，其特征在于，所述蓋板包括用于添加稀釋液的位于所述稀釋隔室上方的孔。
27.如權(quán)利要求
1所述的設(shè)備，其特征在于，所述流體樣品是包含進(jìn)行核酸擴(kuò)增的試劑的反應(yīng)混合物。
28.如權(quán)利要求
19所述的設(shè)備，其特征在于，所述樣品隔室和所述歧管各自包括傾斜的壁部分，以便在通過旋轉(zhuǎn)所述平臺(tái)施加離心カ時(shí)流體傾向于從所述樣品隔室排出至通向所述稀釋隔室的通道、從所述計(jì)量歧管排出至通向反應(yīng)隔室的通道。
29.如權(quán)利要求
4所述的設(shè)備，其特征在于，所述通道從樣品隔室向稀釋隔室、從稀釋隔室向計(jì)量歧管、從計(jì)量歧`管向反應(yīng)隔室直徑逐步變小，因此從樣品隔室向稀釋隔室、從稀釋隔室向計(jì)量歧管、從計(jì)量歧管向反應(yīng)隔室轉(zhuǎn)運(yùn)所述流體時(shí)所需的rpm數(shù)值越來越大。
30.如權(quán)利要求
1所述的設(shè)備，其特征在于，調(diào)整所述樣品隔室和所述反應(yīng)隔室與熱交換器熱連通，以便分別進(jìn)行所述第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)。
31.如權(quán)利要求
1所述的設(shè)備，其特征在于，所述第一擴(kuò)增反應(yīng)包括多重PCR反應(yīng)，所述第二擴(kuò)增反應(yīng)包括巢式或半巢式PCR反應(yīng)。
32.ー種進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)備，所述設(shè)備包括:可旋轉(zhuǎn)平臺(tái)，其具有多個(gè)經(jīng)調(diào)整能接受流體樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)的樣品隔室，所述各樣品隔室與各稀釋隔室流體相連，各稀釋隔室進(jìn)而與各計(jì)量歧管流體相連，以便將所述各稀釋的流體樣品基本均勻地分配到各反應(yīng)隔室陣列中進(jìn)行多個(gè)第二擴(kuò)增反應(yīng)，所述各反應(yīng)隔室通過具有選擇性允許流體流過的選擇性流動(dòng)器件的通道與各計(jì)量歧管流體相連。
33.如權(quán)利要求
32所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)樣品隔室呈輻射狀設(shè)置于所述反應(yīng)隔室內(nèi)側(cè)，其中施加足夠的離心力能將所述流體依次從所述樣品隔室向稀釋隔室、從所述稀釋隔室向所述計(jì)量歧管、或從所述計(jì)量歧管向所述反應(yīng)隔室選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。
34.一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，所述方法包括: 提供權(quán)利要求
32或33所述的設(shè)備； 向所述樣品隔室中加入流體樣品； 進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)； 向所述稀釋隔室中加入稀釋液； 施加足夠的離心力，以便將所述流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到所述稀釋隔室中稀釋所述樣品；施加足夠的離心力，以便將所述稀釋的流體樣品轉(zhuǎn)運(yùn)到所述計(jì)量歧管中； 致動(dòng)所述選擇性流動(dòng)器件； 施加足夠的離心力，以便將所述稀釋的流體樣品基本均勻地分配到所述反應(yīng)隔室中；和 進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
35.ー種進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，所述方法包括: 提供包括樣品隔室和多個(gè)反應(yīng)隔室的平臺(tái)，所述平臺(tái)可旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力，并且，所述樣品隔室放射狀設(shè)置于所述反應(yīng)隔室內(nèi)側(cè)； 向所述樣品隔 室中加入流體樣品并進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)；和 將所述流體樣品基本均勻地分配到所述多個(gè)反應(yīng)隔室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。
36.一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，所述裝置包括:權(quán)利要求
1或32所述設(shè)備和接受該設(shè)備的基座；按照預(yù)定順序旋轉(zhuǎn)所述設(shè)備以便從所述樣品隔室向稀釋隔室、從所述稀釋隔室向所述計(jì)量歧管、或從所述計(jì)量歧管向所述反應(yīng)隔室選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)所述流體樣品的旋轉(zhuǎn)器件；與所述流體樣品以及所述反應(yīng)和樣品隔室熱連通以便為進(jìn)行所述第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)依順序提供熱學(xué)特性的溫度控制元件；和用于儲(chǔ)存和控制所述順序的可編程控制器。
37.如權(quán)利要求
36所述的裝置，其特征在于，所述第一擴(kuò)增反應(yīng)包括多重PCR反應(yīng)，所述第二擴(kuò)增反應(yīng)包括巢式或半巢式PCR反應(yīng)。
38.ー種進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增的成套設(shè)備，其包括: 權(quán)利要求
1或32所述的設(shè)備；和 進(jìn)行所述反應(yīng)隔室中所含的所述第二擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑。
39.如權(quán)利要求
38所述的成套設(shè)備，還包括稀釋所述稀釋隔室中所含的所述第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物所必需的試劑。
40.如權(quán)利要求
22所述的設(shè)備，所述熱塑性材料在預(yù)定波長下是透明的，以設(shè)置光源/檢測器來監(jiān)測所述樣品隔室或反應(yīng)隔室中發(fā)生的反應(yīng)。
專利摘要
本發(fā)明提供進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)備(1)。所述設(shè)備(1)包括平臺(tái)(2)，平臺(tái)(2)具有樣品隔室(5)和多個(gè)反應(yīng)隔室(10)。調(diào)整樣品隔室(5)以接受流體樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，調(diào)整平臺(tái)(2)使其將流體樣品基本均勻地分配到多個(gè)反應(yīng)隔室(10)中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明也擴(kuò)展至進(jìn)行連續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的成套設(shè)備、方法和裝置。
文檔編號(hào)C12M1/02GKCN101675170 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200880006635
公開日2013年9月18日 申請日期2008年2月29日
發(fā)明者K·斯坦利, J·庫洛貝特 申請人:考貝特研究控股公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),