專利名稱:線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其使用方法
線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其使用方法
與相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2007年2月6日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號 60/899,693的優(yōu)先斗又。
動(dòng)子及其片段。本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于控制任一目的核酸在植物根中的轉(zhuǎn) 錄。尤其，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用來控制編碼物質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)錄，其中所述 的物質(zhì)破壞采食部位的形成或維持、破壞植物寄生線蟲的生長和/或繁殖， 賦予或改善植物對植物寄生線蟲的抗性或毒害植物寄生線蟲以減少作物破 壞。
發(fā)明背景
線蟲是以超過2，000種行栽作物、蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉及 莖為食，造成世界范圍估計(jì)一千億美元作物損失的微小線蟲。多種寄生線 蟲物種感染作物植物，包括根癌線蟲(RKN)、形成胞嚢及形成損傷的線蟲。
以造成采食部位處^r艮癭形成為特征的根癌線蟲具有相對廣泛的宿主范圍并
且因此對種類繁多的作物物種致病。形成胞嚢和形成損傷的線蟲物種具有 更有限的宿主范圍，不過依舊在易感作物中造成巨大損失。
致病性線蟲存在于美國各地，在南部和西部的溫暖濕潤地區(qū)及在沙壤 土中密度最大。大豆植物的最嚴(yán)重病蟲-大豆胞嚢線蟲(Heterodera glycines) 在1954年首次于美國的北卡萊羅納州發(fā)現(xiàn)。某些地區(qū)嚴(yán)重遭受大豆胞嚢線 蟲(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，則大豆生產(chǎn)不再可能是經(jīng)濟(jì)的。盡管大豆是受SCN侵襲的主要經(jīng)濟(jì)作物，然而SCN寄生總計(jì)約50種宿 主，包括大田作物、蔬菜、觀賞植物和雜草。
線蟲損傷的跡象包括在炎熱時(shí)期矮化與葉子發(fā)黃及植物萎蔫。然而， 線蟲侵染可以引起嚴(yán)重產(chǎn)量損失，而無任何明顯的地上部分發(fā)病癥狀。產(chǎn) 量減少的主要原因歸咎于地下的根損傷。受SCN感染的根矮縮或矮化。線 蟲侵染也可以減少根上固氮結(jié)節(jié)的數(shù)目，并且可以使根更易受其他土源性 植物病原體侵襲。
線蟲的生命周期具有三個(gè)主要階段卵、幼體和成體。該生命周期在 線蟲物種之間不同。例如，SCN的生命周期在最適條件下通常可以于24-30 日內(nèi)完成，而其他物種可能經(jīng)過長達(dá)一年或更長時(shí)間以完成生命周期。當(dāng) 溫度和濕度水平在春季變得適宜時(shí)，蠕蟲形狀的幼體在土壤中從卵孵化出 來。僅幼體發(fā)育階段的線蟲能夠感染大豆根。
SCN的生命周期已經(jīng)成為眾多研究的主題，并且因此是理解線蟲生命 周期的有用實(shí)例。在穿透大豆根后，SCN幼體通過根移動(dòng)直至它們接觸維 管組織，此時(shí)SCN幼體停止遷移并開始采食。借助口針，線蟲注射了調(diào) 節(jié)某些根細(xì)胞并將它們轉(zhuǎn)化成特化采食部位的分泌物。這些根細(xì)胞在形態(tài) 學(xué)上轉(zhuǎn)化成巨大的多核合胞體(或在RKN情況中為巨大細(xì)胞)，這種合胞體 被用作線蟲的營養(yǎng)物來源。主動(dòng)采食的線蟲因此從植物竊取重要的營養(yǎng)物， 導(dǎo)致產(chǎn)量損失。當(dāng)雌性線蟲采食時(shí)，它們膨脹并逐漸變得如此巨大，以至 于它們的身體突破根組織并暴露在根的表面。
在采食一段時(shí)間后，作為成體不膨脹的雄性SCN線蟲從根遷移至土 壤內(nèi)并使膨大的雌性成體受精。雄性線蟲隨后死亡，而雌性線蟲仍與根系 統(tǒng)附著并繼續(xù)采食。膨大雌性線蟲中的卵開始發(fā)育，最初在身體外的團(tuán)塊 或卵嚢(a mass or egg sac)中并隨后在線蟲體腔內(nèi)發(fā)育。雌性成體的整個(gè)體 腔最終充滿卵，并且雌線蟲死亡。正是充滿卵的死亡雌線蟲身體才稱作胞 嚢。胞嚢逐漸釋放并游離存在于土壤中。胞嚢的壁變得極堅(jiān)韌，從而為胞 嚢內(nèi)所含大約200-400粒卵提供良好的保護(hù)作用。SCN卵在胞嚢內(nèi)存活直 至適宜的孵化條件出現(xiàn)。盡管眾多的卵可以在頭一年中孵化，然而很多卵也會(huì)在保護(hù)性胞嚢內(nèi)存活幾年。
線蟲可以依賴其自身力量在土壤中每年穿行僅幾英寸。然而，線蟲侵 染可以在多種方式下傳播相當(dāng)遠(yuǎn)的距離。可以移動(dòng)受侵染土壤的任何事物， 包括農(nóng)場機(jī)械、車輛和工具、風(fēng)、水、動(dòng)物和農(nóng)場工人，能夠傳播這種侵 染。種子大小的土壤顆粒往往污染收獲的種子。因此，當(dāng)來自受侵染田地 的污染種子在非侵染田地中播種時(shí)，可以傳播線蟲侵染。存在某些線蟲可 以通過鳥類傳播的證據(jù)。僅可以預(yù)防這些病因中的某些病因。
防治線蟲侵染的常規(guī)方法包括在線蟲侵染的土地中保持合理的土壤 養(yǎng)分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆蟲與雜草病害；使用消 毒措施，如僅在處理線蟲非侵染田地后才翻耕、播種和中耕線蟲侵染的田 地；在侵染的田地中工作后用高壓水或蒸汽徹底清潔設(shè)備；不使用在侵染 田地中生長的種子播種非侵染田地，除非這種種子已經(jīng)得到正確地清潔； 輪作受侵染田地并且用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲劑；和播種 抗性植物品種。
已經(jīng)提出方法用于遺傳轉(zhuǎn)化植物以便賦予增加的植物寄生線蟲抗性。 美國專利號5，589，622和5,824,876涉及線蟲附著后在植物釆食部位內(nèi)或其 附近特異性表達(dá)的植物基因的鑒定。美國專利號5,589,622和5，824，876公 開了從馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)感染的馬鈴薯根分離的8種 啟動(dòng)子；沒有^Hf來自其他植物物種的線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。據(jù)稱這些啟動(dòng) 子可用于指導(dǎo)有毒蛋白或酶特異性表達(dá)或指導(dǎo)針對靶基因或針對一般細(xì)胞 基因的反義RNA的表達(dá)。
美國專利號5,023,179 ^Hf命名為ASF-1的分離自CaMV啟動(dòng)子的 啟動(dòng)子增強(qiáng)元件，據(jù)稱其增強(qiáng)植物基因在根中的表達(dá)。
美國專利號5，750，386公開煙草(Nicotiana tabacum)RB7根特異性啟 動(dòng)子的缺失片段，據(jù)稱其具有線蟲應(yīng)答性。
美國專利號5,837,876公開從煙草分離并命名為TobRD2的根皮層特 異性基因啟動(dòng)子。
美國專利號5，866，777公開了推遲線蟲采食結(jié)構(gòu)形成的雙基因方法。第一個(gè)基因-芽孢桿菌RNA酶基因處于驅(qū)動(dòng)至少在采食結(jié)構(gòu)中表達(dá)的啟動(dòng) 子控制下。第二個(gè)基因-芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因處于驅(qū)動(dòng)在除所述采 食結(jié)構(gòu)之外的全部植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子控制下。美國專利號5,866,777 中公開的采食部位特異性啟動(dòng)子包括截短形式的A0,3TobRB7和rolC啟動(dòng)子。
美國專利號5，955，646公開了基于源自根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章魚堿合酶基因的啟動(dòng)子的嵌合調(diào)節(jié)區(qū)， 據(jù)稱其具有線蟲誘導(dǎo)性。
美國專利號6,005,092公開了煙草內(nèi)切-l，4-P-葡聚糖酶(Ntce17)啟動(dòng)子。
美國專利號6,262,344和6,395,963公開了從擬南芥分離的啟動(dòng)子，據(jù)
稱其具有線蟲誘導(dǎo)性。
美國專利號6,448,471公開了來自擬南芥的啟動(dòng)子，其對線蟲釆食部 位是特異性的。
美國專利號6,593,513公開了用擬南芥內(nèi)切-l，4-P-葡聚糖酶基因(ce11) 啟動(dòng)子控制下的芽孢桿菌RNA酶轉(zhuǎn)化植物以產(chǎn)生能夠破壞線蟲侵襲的植物。
美國專利號6,703,541公開了玉米過氧化物酶P7X基因及其啟動(dòng)子的 克隆和分離。玉米過氧化物酶P7X啟動(dòng)子被報(bào)道為線蟲誘導(dǎo)型的。
美國專利號6，906，241公開了與編碼殺線蟲或殺昆蟲蛋白質(zhì)的異源核 酸組合的Ntcel7啟動(dòng)子。
美國專利號7,078,589公開大豆Pyk20基因和啟動(dòng)子的克隆與分離， 所述啟動(dòng)子據(jù)稱將受SCN感染誘導(dǎo)并在維管組織中顯示強(qiáng)烈活性。
美國專利號7，196,247公開了大豆異黃酮合酶I的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子 被報(bào)道為根特異的，并且在營養(yǎng)組織中是寄生蟲襲擊誘導(dǎo)型的。
美國專利號7，223,卯1公開了來自礴酸核糖甲酰甘氨脒核糖核苷酸合 酶(phosphoribosylformylglycinamidine ribonucleotide synthase)的啟動(dòng)子 及其缺失片段，所述啟動(dòng)子^皮報(bào)道為對線蟲感染應(yīng)答。美國專利申請公開號2004/0078841公開擬南芥TUB-1、 RPL16A及 ARSK1啟動(dòng)子和來自S宛豆(Pisum sativum)的PSMTA啟動(dòng)子的啟動(dòng)子 區(qū)，所述全部啟動(dòng)子區(qū)據(jù)稱;l^艮特異性的。
美國專利申請公開號2004/0029167公開了來自煙草的II類咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子序列，據(jù)稱所述啟動(dòng)子序列可應(yīng)答于機(jī)械性或化 學(xué)性損傷或應(yīng)答于致病體入侵而誘導(dǎo)。
WO 94/10320公開了來自煙草的A(UTobRB7啟動(dòng)子片段及其與多 種基因 一起用于線蟲采食細(xì)胞特異性表達(dá)。
WO 03/033651 -^開了命名為SCP1、 UCP3和SUP的合成的線蟲調(diào) 節(jié)型啟動(dòng)子序列。
WO 2004/029222及其美國同族專利-美國專利申請公開號 2005/0070697公開了來自大豆腺苷-5'-磷酸脫氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的 調(diào)節(jié)區(qū)，用于提高植物中的線蟲抗性。
上文提及的根特異性或采食部位特異性啟動(dòng)子目前均未用在含有抗線 蟲轉(zhuǎn)基因的商品種子中。雖然對這類產(chǎn)品的需求久已承認(rèn)，然而迄今無人 成功通過重組DNA技術(shù)開發(fā)抗線蟲植物。持續(xù)需求根特異性和/或線蟲采 食部位特異性啟動(dòng)子以與編碼毒害植物寄生線蟲物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因組合。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供適用于驅(qū)動(dòng)第二多核苷酸在易感于線蟲侵襲的植物根中表 達(dá)的啟動(dòng)子多核苷酸。本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸特別用于產(chǎn)生抵抗線蟲侵 染的農(nóng)業(yè)作物植物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含分離的啟動(dòng)子多核苷酸的啟動(dòng) 子，所述啟動(dòng)子能夠介導(dǎo)根優(yōu)選的和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，其中所述啟動(dòng)子 多核苷酸選自a)具有SEQ ID NO:l中公開的序列的多核苷酸；b)包含 下述多核苷酸的核苦酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列；c)與a)或b)的多核苷酸具有至少70。/。序列同一性的 多核苷酸;d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和e)包含下述多核普酸的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少IOO個(gè)連續(xù)核苷酸、或至 少200個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l 中公開的序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子多核苷酸的表達(dá)盒和轉(zhuǎn)基因 植物，還涉及在作物中控制寄生線蟲侵襲的方法，其中所述方法使用重組 核酸構(gòu)建體減少作物破壞，所述重組核酸構(gòu)建體包含與下述核酸有效結(jié)合 的本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子多核苷酸，所述核酸編碼破壞植物寄生線蟲代謝、 生長和/或生殖的物質(zhì)，賦予或改善植物對植物寄生線蟲抗性的物質(zhì)，或?qū)?植物寄生線蟲有毒的物質(zhì)。
附圖概述

圖1:擬南芥基因座At5gl2170的啟動(dòng)子多核苷酸的核酸序列(SEQ ID NO:l)。
圖2:大豆cDNA克隆50657480的核酸序列(SEQ ID NO:2)。 圖3:由大豆cDNA克隆50657480編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)， 其中"*，，表示終止密碼子。
圖4: cDNA克隆50657480的微陣列數(shù)據(jù)。(N)中的N表示cDNA微 陣列測量的數(shù)量，ND表示在該研究中所述的實(shí)驗(yàn)條件下不可檢出。名稱 "未處理的根，，表示下述全根組織aRNA (擴(kuò)增的RNA)，其來自與經(jīng) SCN接種的區(qū)段同齡的未感染的根區(qū)段。名稱"非合胞體"表示全根組織 aRNA，其來自與不含有SCN或進(jìn)食位點(diǎn)的感染區(qū)相鄰的被SCN感染的 根。名稱"合胞體"表示使用激光捕獲顯微解剖(LCM)獲得的aRNASCN 合胞體樣品。
圖5:由擬南芥At5gl2170基因編碼的氨基,列(SEQ ID NO: 4)， 其中"*，，表示終止密碼子。
圖6:大豆cDNA克隆50657480編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)與 擬南芥At5gl2170基因編碼的氨基,列(SEQ ID NO: 4)的比對。
圖7:在實(shí)施例4中公開的大豆發(fā)根測定中，雙元栽體pAW280的卩-葡糖酪酸糖苷酶表達(dá)模式。SCN接種后12天，對大豆胞嚢線蟲感染的發(fā) 根和對照未感染的發(fā)根染色。使用以下的評分指標(biāo)"-"表示無GUS染色， "+"表示弱GUS染色，"++"表示強(qiáng)GUS染色，"-/+"表示存在約25%的測 試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管GUS染色。
圖8:在實(shí)施例7中公開的大豆發(fā)根測定中，雙元載體pAW280、 RTJ119和RTJ120的P-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)模式。SCN接種后12天，對 大豆胞嚢線蟲感染的發(fā)根和對照未感染的發(fā)根染色。使用以下的評分指標(biāo) "-"表示無GUS染色，"+"表示弱GUS染色，"++"表示強(qiáng)GUS染色，"-/+" 表示存在約25%的測試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管 GUS染色。
圖9:用于克隆啟動(dòng)子多核苷酸的引物。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
本發(fā)明可以通過參考以下詳細(xì)描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案及其中所包 含實(shí)施例而更容易地理解。除非另外il明，本文中所用術(shù)語將根據(jù)相關(guān)領(lǐng) 域技術(shù)人員的習(xí)慣用法加以理解。除了下文提供的術(shù)語定義外，分子生物 學(xué)中常用術(shù)語的定義也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics: classical and molecular,第五版，Berlin: Springer-Verlag; 和在Current protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等編者，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.與John Wiley & Sons, Inc. (1998附錄) 中找到。
應(yīng)當(dāng)理解如本說明書及在權(quán)利要求
書中所用，"一種(a)"或"一個(gè)(an)" 可以意指一個(gè)或多個(gè)，這取決于該冠詞所用的上下文。因此，對"一種細(xì)胞" 的稱謂可以可以意指可以使用至少一種細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于具體 核酸、具體細(xì)胞類型、具體宿主細(xì)胞、具體條件或具體方法等，因?yàn)檫@些 當(dāng)然可以變化，并且其中的眾多4務(wù)改與變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易 見的。還應(yīng)當(dāng)理解本文中使用的術(shù)語僅僅旨在描述具體實(shí)施方案并且不意 圖是限制性的。在本申請通篇范圍內(nèi)，參考了多種出版物。全部這些出版物及這些出 版物中引用的那些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用方式完整地并入本申請，
旨在更充分地描述本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域狀態(tài)。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增 及純化，用于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等酶反應(yīng)的 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以及多種分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且通常使用的那些技 術(shù)。眾多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在Sambrook和Russell， 2001 Molecular Cloning,第三 版，Cold Spring Harbor, Plain view, New York; Sambrook等,1989 Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis等,1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu(編輯)1993 Meth. Enzymol. 218，第 I部分；Wu(編輯)1979 Meth Enzymol. 68; Wu等，(編輯)1983 Meth. Enzymol. 100和101; Grossman和Moldave(編輯)1980 Meth. Enzymol. 65; Miller(編輯)1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old和Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif 和 Wensink， 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover(編輯)1985 DNA Cloning第I和II巻，IRL Press, Oxford, UK; Hames和Higgins(編輯)1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods,第1-4巻,Plenum Press, New York中描述。
提供從其天然環(huán)境分離和/或純化的本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸，它們處于 基本上純的或均勻的形式，或者不含或基本上不含所述物種來源的其他核 酸。如本文中所用的"分離"核酸在通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)也基本上(在分離時(shí)) 不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或在化學(xué)地合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體。本 發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸是分離的核酸。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語"分離的" 包括全部這些可能。
術(shù)語"約"在本文中用來意指大約、大致、左右或處于......范圍。術(shù)語
"約"與數(shù)字范圍 一起使用時(shí)，它通過擴(kuò)張邊界 于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常，術(shù)語"約"在本文中用來修飾某數(shù)值高于和低于所述值，即
在該數(shù)值之上或之下(較高或較低)達(dá)10%的偏差。
如本文中所用的術(shù)語"啟動(dòng)子"或啟動(dòng)子多核苷酸指與目的核苷酸序列
連接時(shí)能夠控制該目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子一 般(盡管不必要)位于目的核苷酸的5'(例如上游)(例如接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn))，所述目的核苷酸向mRNA轉(zhuǎn)錄的受所述啟動(dòng)子的控制，并為 用于啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子提供特異性結(jié)合位點(diǎn)。"組成 型啟動(dòng)子"指這樣的啟動(dòng)子，它能夠在植物整個(gè)或幾乎整個(gè)發(fā)育期期間于全 部或幾乎全部植物組織中表達(dá)該啟動(dòng)子控制的可讀框或調(diào)節(jié)元件。"調(diào)節(jié)型 啟動(dòng)子"指不以組成型方式而以時(shí)間和/或空間方式指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng) 子，并且包括組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。不同啟動(dòng)子可以指導(dǎo)基
境條件下表達(dá)。"組織特異性啟動(dòng)子，，指不在全部植物細(xì)胞中表達(dá)而僅在特 定器官(如根或種子)、特定組織(如胚或子葉)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型或特 定細(xì)胞類型(如葉薄壁組織或種子貯藏細(xì)胞)中表達(dá)的調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。"誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子"指可以在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型中通過外部刺激如化學(xué)、光、激素、 脅迫或病原體開啟的那些調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。
本文中使用的術(shù)語"線蟲抗性，，表示植物避免被線蟲感染、殺死線蟲 或阻礙、減少或終止線蟲發(fā)育、生長或繁殖的能力。這可通過主動(dòng)過程(例 如通過產(chǎn)生對線蟲有害的物質(zhì))或被動(dòng)過程(例如通過減少給線蟲的養(yǎng)分 或抑制由線蟲誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)如合胞體或巨細(xì)胞的發(fā)育)實(shí)現(xiàn)。植物的線蟲抗 性水平可以以多種方式測定，例如通過計(jì)數(shù)在感染后能夠在植物上建立寄 生的線蟲，或通過測量感染后多個(gè)時(shí)間存在的線蟲發(fā)育階段，或通過測量 雄性和雌性線蟲的比例或產(chǎn)生的線蟲卵或胞嚢的數(shù)量。
術(shù)語"序列同 一性"或"同 一性"在兩個(gè)多核苷酸序列或多肽序列環(huán)境下 指這兩個(gè)序列中的這些位置，其中當(dāng)所述序列在指定比較窗口范圍(例如全 局比對中的整個(gè)序列或在局部比對中的相似性區(qū)域)內(nèi)為最大對應(yīng)進(jìn)行比 對時(shí)，相同的符號對歸集在一起。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)用來指多肽時(shí)，可認(rèn)識到的是不同 一的殘基位置經(jīng)常因保守性氨基酸置換而不同，其中氨基 酸殘基被替換為具有相似化學(xué)屬性(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基 并且因此沒有改變分子的功能屬性。當(dāng)序列因保守性置換而不同時(shí)，序列 同一性百分?jǐn)?shù)可以向上調(diào)整以針對所述置換的保守性本質(zhì)進(jìn)行修正。將因 此類保守性置換而不同的序列稱為具有"序列相似性"或"相似性"。用于進(jìn) 行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。 一般，這種方法包括將保守 性置換判定為部分匹配而非錯(cuò)配，因而增加序列相似性的百分?jǐn)?shù)。
如本文中所用，"序列同一性的百分?jǐn)?shù)"或"序列同一性百分?jǐn)?shù)"指通過 如此方式確定的值，即首先在全局或局部比較窗口中的兩個(gè)最佳比對序列 中在每個(gè)組成位置處注明相同的核酸堿基或氨基酸殘基是否在這兩個(gè)序列 中出現(xiàn)，若出現(xiàn)，指定為匹配，或若不出現(xiàn)，則指定為不匹配。由于所述 比對通過優(yōu)化匹配堿基數(shù)目而建立，與此同時(shí)允許在任一位置處的錯(cuò)配以
及允許引入任一大小的空位或空白區(qū)域，如此提高所述比對的顯著性A^ 量，因而這種計(jì)算確定了匹配條件存在的位置總數(shù)，并且隨后將這個(gè)數(shù)字 除以比較窗口內(nèi)的位置總數(shù)，并且最后將結(jié)果乘以ioo以產(chǎn)生序列同一性 百分?jǐn)?shù)?？梢允褂孟嗤韺Φ鞍踪|(zhì)序列計(jì)算"序列相似性百分?jǐn)?shù)"，其中 將保守性置換計(jì)算為部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在給予相 同氨基酸評分i并且給予非保守性置換評分o的情況下，給予保守性置換 (M之間的評分。對保守性置換的評分可以從本領(lǐng)域已知的氨基酸矩陣?yán)?br>Blosum或PAM矩陣中獲得。
用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)兩 個(gè)序列之間同一性百分?jǐn)?shù)或相似性百分?jǐn)?shù)(對于蛋白質(zhì))的確定。此類數(shù)學(xué) 算法的優(yōu)選、非限制性實(shí)例是Myers和Miller算法(Bioinformatics, 4(1):11-17， 1988)、 Needleman-Wunsch全局比對法(J. Mol. Biol" 48(3):443-53， 1970) 、 Smith-Waterman局部比對法(J. Mol. Biol" 147:195-197， 1981)、 Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS， 85(8): 2444 2448， 1988)、 Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J. Mol. Biol" 215(3):403-410， 19卯；PNAS， 90:5873-5877,1993)?？梢允褂眠@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)以比W列來確定序列同 一性或鑒定同源物。
與美國專利申請系列號60/899,739同時(shí)提交的共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申 請系列號60/899,739公開并要求保護(hù)稱作GM50657480的大豆cDNA，其 在本文中由SEQ ID NOs:2和3表示。如實(shí)施例2中所示，在SCN誘導(dǎo)的 合胞體中，GM50657480的表達(dá)4皮上調(diào)。如圖6中所示，GM50657480的 氨基酸序列(SEQ ID NO:3)顯示與At5gl2170的氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 的顯著比對，指出兩種蛋白質(zhì)是直向同源物。如實(shí)施例4中所證明的，當(dāng) 與GUS報(bào)告基因處于有效連接中時(shí)，本發(fā)明的擬南芥啟動(dòng)子多核苷酸 (SEQ ID NO: 1 )在被線蟲感染的大豆發(fā)根中上調(diào)。
因此，本發(fā)明涉及具有SEQIDNO:l中公開序列的分離的啟動(dòng)子多核 苷酸，或從具有SEQIDNO:l中公開序列的分離的啟動(dòng)子多核苷酸得到的 最小啟動(dòng)子多核苷酸片段，所述片段能夠驅(qū)動(dòng)第二多核苷酸的根特異和/ 或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。本文中使用術(shù)語"等同片段"或"最小啟動(dòng)子多核苷 酸片段"是指能夠介導(dǎo)第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子 多核苷酸片段?？赏ㄟ^去除非必需功能元件而不缺失關(guān)鍵的功能元件例如 關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，獲得本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸的等同片段。所 述啟動(dòng)子多核苷酸序列縮小至必需的功能元件可以在體外通過試錯(cuò)缺失突 變或在計(jì)算機(jī)上利用啟動(dòng)子元件搜索途徑實(shí)現(xiàn)。對啟動(dòng)子活性必需的區(qū)域 常常顯示為成簇的某些已知啟動(dòng)子元件。此類分析可以使用可獲得的計(jì)算 機(jī)算法如PLACE("植物順式作用調(diào)節(jié)性DNA元件"；Higo 1999)、 BIOBASE 數(shù)據(jù)庫 "Transfac"(Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001)或數(shù)據(jù)庫PIantCARE(Lescot 2002)進(jìn)行。 特別優(yōu)選的是通過缺失編碼mRNA 5，-非翻譯區(qū)從而僅提供(未轉(zhuǎn)錄的) 啟動(dòng)子多核苷酸區(qū)域而獲得的啟動(dòng)子多核苷酸的等同片段?？扇菀椎赝ㄟ^ 本領(lǐng)域已知的方法(例如5，-RACE分析)確定5，-非翻譯區(qū)。因此，本發(fā) 明的一些啟動(dòng)子多核苷酸是其他啟動(dòng)子多核苷酸的等同片段。本發(fā)明特異 的最小啟動(dòng)子多核苷酸片段包括但不僅限于，包含SEQIDNO:l中公開序 列的核苷酸476到1476的多核苷酸，下述多核苷酸，其包含具有SEQIDNO:l中^^開序列的啟動(dòng)子多核普酸的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少100 個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少200個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少300個(gè)連續(xù)核苷酸、或 至少400個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。
或者，本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸包含分離的多核苷酸，所述分離的多 核苷酸在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO:l中公開序列的啟動(dòng)子多核苷酸 雜交，或與從具有SEQIDNO:l中公開序列的啟動(dòng)子多核苷酸獲得的最小 啟動(dòng)子多核苷酸片段雜交。本文使用的嚴(yán)格雜交條件是公知的，包括例如 400 mMNaCl、 40 mM PIPES pH 6.4、 1 mM EDTA、 60。C雜交12-16小 時(shí)；然后在約65。C下在0.1。/。SDS、 0.1% SSC中洗滌約15-60分鐘。
本發(fā)明還涉及下述分離的多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO:l公開序列的核苷酸476到1476的多核苷酸雜交，其中啟動(dòng)子多核苷 酸能夠驅(qū)動(dòng)第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，并且在植物根中 由植物寄生線蟲感染誘導(dǎo)。本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸還包含分離的啟動(dòng)子 多核苷酸，所述啟動(dòng)子多核苷酸與具有SEQIDNO;l中公開序列的多核苷 酸或從SEQ ID NO;l中公開序列獲得的最小啟動(dòng)子多核苷酸片段至少 50-60%、或至少60-70%、或至少70-80%、 80-85%、 85%、 68%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、或至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一，所述啟動(dòng)子多核苷酸能夠驅(qū)動(dòng)第二多核苷酸的根特異和/ 或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。多核苷酸序列比較的長度為至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸， 或至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸，或至少200個(gè)連續(xù)的核普酸，或至少500個(gè) 連續(xù)的核苷酸，長達(dá)序列的全長。在待比較的兩條序列不具有相同長度的 情況下，術(shù)語"序列的全長"是指較短序列的全長。
本文7^開的方法可用于分離SEQ ID NO:l的另外的最小啟動(dòng)子多核 苷酸片段，所述片段能夠介導(dǎo)第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導(dǎo)的表 達(dá)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的"變體"或"衍生物"。特異 啟動(dòng)子多核苷酸序列及其特異元件的衍生物可包括但不僅限于，序列的缺 失、單點(diǎn)或多點(diǎn)突變、具體限制性酶切位點(diǎn)的改變、功能元件的添加，或 分子修飾的其他手段。該修飾可以增強(qiáng)或不增強(qiáng)，或者可以改變或不改變所述啟動(dòng)子多核苷酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可限定啟動(dòng) 子多核苷酸內(nèi)的功能元件例如啟動(dòng)子元件(例如但不僅限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點(diǎn))，并缺失任何非必需的功能元件。可修飾或組合功能元件，以針對 任何具體的應(yīng)用提高本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的利用或表達(dá)水平。
如上所述，也可以隨機(jī)制備然后測定本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的缺失突 變體。根據(jù)該策略制備了一系列構(gòu)建體，每個(gè)構(gòu)建體含有啟動(dòng)子多核苷酸 的不同部分(亞克隆)，然后篩選這些構(gòu)建體的活性。篩選活性的一種合 適手段是將含有啟動(dòng)子多核苷酸片段的啟動(dòng)子多核苷酸構(gòu)建體與可選擇或 可篩選標(biāo)記物連接，并僅分離表達(dá)標(biāo)記物基因的細(xì)胞。藉此鑒定了大量不 同的、經(jīng)缺失的下述啟動(dòng)子多核苷酸構(gòu)建體，其仍然保留期望的活性或甚 至具有增強(qiáng)的活性。因此通過比較選擇的構(gòu)建體鑒定了活性必需的最小啟 動(dòng)子多核苷酸片段。該啟動(dòng)子多核苷酸片段隨后可用于構(gòu)建表達(dá)第二多核 普酸的載體，所述第二多核苷酸例如編碼外源基因。
在多核苷酸(例如啟動(dòng)子多核苷酸)中誘變或產(chǎn)生缺失的方法是本領(lǐng)
域技術(shù)人員熟知的并且在例如通過引用方式完整并入本文的US 6,583,338 中披露。調(diào)節(jié)性序列變體的一個(gè)實(shí)例是通過從較大啟動(dòng)子多核苷酸中的一 個(gè)缺失或多個(gè)缺失所形成的啟動(dòng)子多核苷酸。有時(shí)候可以缺失啟動(dòng)子多核 苷酸的5'部分直至接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的TATA盒而不消除啟動(dòng)子活 性，如Zhu等(1995) The Plant Cell 7:1681-1689描述。除去部分多核苷酸
單向嵌套缺失。用于此目的的商業(yè)試劑盒以商標(biāo)名Exo-Size.TM.(New England Biolabs， Beverly, Mass.)出售。生物活性變體也包括例如具有一個(gè) 或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入的本發(fā)明天然啟動(dòng)子多核苷酸。
衍生物和變體也包括來自其他物種(如但不限于細(xì)菌、真菌和植物)的 同源物、旁系同源物和直向同源物。"同源物"是本領(lǐng)域中用來表示與參考 序列具有高度序列相關(guān)性的多核苷酸或多肽序列的遺傳學(xué)術(shù)語。這種相關(guān) 性可以如前所述通過確定兩個(gè)序列之間同 一性和/或相似性的程度進(jìn)行量 化。屬于這個(gè)遺傳學(xué)術(shù)語的是術(shù)語"直向同源物"和"旁系同源物"。"旁系同源物"指在相同物種內(nèi)功能上相似的多核苷酸或多肽。"直向同源物"指作為 另 一個(gè)物種中與所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同 源基因優(yōu)選地意指編碼直向同源蛋白質(zhì)的基因。更具體地，術(shù)語"直向同源 物"指從一個(gè)物種中獲得的多肽或蛋白質(zhì)，其是來自不同物種的多肽或蛋白 質(zhì)的功能性對應(yīng)物。直向同源物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。
本文使用的術(shù)語"等位基因變體，，是指含有多態(tài)性的多核苷酸，所述 多態(tài)性導(dǎo)致多核苷酸的核苷酸中的改變并存在于自然種群(例如植物物種 或變種)中。術(shù)語"等位基因變體"還表示含有多態(tài)性的啟動(dòng)子多核苷酸，
群中。這類天然等位基因變體通?？蓪?dǎo)致多核苷酸中1-5%的差異，或編碼 的蛋白質(zhì)中1 -5%的差異。可通過對大量不同植物中的目的多核苷酸進(jìn)行測 序來鑒定等位基因變體，可通過使用例如雜交探針鑒定這些植物中相同的 啟動(dòng)子多核苷酸、基因或遺傳基因座完成所述測序。啟動(dòng)子多核苷酸中任 何和所有下述這類核酸變異旨在屬于本發(fā)明的范圍，所述核酸變異由天然 等位基因變異引起并且不改變啟動(dòng)子多核苷酸的功能活性?；虻牡任换?因變體可被用于克隆本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的變體。藉此獲得的本發(fā)明啟 動(dòng)子多核苷酸的變體可與SEQ ID NO: 1的序列或與SEQ ID NO: 1的核苷 酸476到1476的序列至少70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一，并與編碼下述多肽的基因天然相連，所述多肽與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所述序列至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同 一。天然相連表示兩條多核苷酸是(例如植物基因組中)自然存在的連續(xù) 多核苷酸的部分，其中連接兩條序列的多核苷酸片段不長于3000bp、 2000 bp、 1000 bp、 500 bp、 200 bp、 100 bp或50 bp。優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動(dòng) 子多核苷酸的變體在編碼下述多肽的直向同源基因上游區(qū)域中，所述多肽 與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所述序列有至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一性。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子多核苷酸可處于與第二多核苷酸 的有效連接中，用于植物中第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，從而改變該植物的表型。本文使用的術(shù)語"有效連接"、"有效地連接" 和"連接"是可以互換的，并且表示單個(gè)多核苷酸片段上啟動(dòng)子和第二多 核苷酸的下述方式的功能連接，所述方式使得第二多核苷酸的轉(zhuǎn)錄由該啟 動(dòng)子起始和介導(dǎo)。通常，有效連接的核酸是連續(xù)的。
任何第二多核苷酸可處于與本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的有效連接中，以 達(dá)成第二多核苷酸的根特異或病原體誘導(dǎo)的表達(dá)。第二多核苷酸包括例如 可讀框、可讀框的部分、編碼融合蛋白的多核苷酸、反義序列、編碼雙鏈
RNA序列的序列、轉(zhuǎn)基因等等。第二多核苷酸可編碼昆蟲抗性基因，細(xì)菌 疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因，病毒疾病抗性基因，線蟲疾病抗性基 因，除草劑抗性基因，影響谷粒組成或品質(zhì)的基因，養(yǎng)分利用基因，真菌 毒素減少基因，雄性不育基因，可選擇標(biāo)記物基因，可篩選標(biāo)記物基因， 陰性可選擇標(biāo)記物基因，陽性可選擇標(biāo)記物基因，影響植物農(nóng)學(xué)特征(如 產(chǎn)率)的基因，環(huán)境脅迫抗性基因(例如賦予對干旱、熱、寒冷、冷凍、 過濕、鹽脅迫或氧化脅迫的抗性或耐性的基因)，改善淀粉特性或數(shù)量、 油數(shù)量和品質(zhì)、氨基酸或蛋白質(zhì)組成的基因等等。
優(yōu)選地，笫二多核苷酸編碼RNA，優(yōu)選地編碼雙鏈RNA (dsRNA)或 反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體等等。
優(yōu)選地，第二多核苷酸編碼RNA，優(yōu)選地編碼雙鏈RNA (dsRNA)， 其總體或部分與下述植物基因或植物啟動(dòng)子基本同一或同源，所述植物基 因或植物啟動(dòng)子是線蟲進(jìn)食位點(diǎn)的形成和維持所必需的，例如通過破壞或 妨礙合胞體或巨細(xì)胞的發(fā)育或完整性。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二多核香酸 編碼dsRNA、反義RNA、 siRNA、 miRNA，其與植物啟動(dòng)子互補(bǔ)并導(dǎo)致 植物啟動(dòng)子的下調(diào)。或者第二多核苷酸可編碼破壞或妨礙植物寄生線蟲生 長和/或生殖的物質(zhì)、賦予或改善對植物寄生線蟲的植物抗性的物質(zhì)，或?qū)?植物寄生線蟲有毒性的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、dsRNA、反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體，從而減少作物破壞。根據(jù)本發(fā)明可使用編碼下述物質(zhì)的 任何多核苷酸破壞植物寄生線蟲生長和/或生殖的物質(zhì)、賦予或改善對植 物寄生線蟲的植物抗性的物質(zhì)，或?qū)χ参锛纳€蟲有毒性的物質(zhì)。例如，第二多核苷酸可編碼下述雙鏈RNA，其與線蟲代謝、存活、變態(tài)或生殖必 需的寄生植物線蟲靶基因基本同一?；蛘?，第二多核苷酸可編碼下述雙鏈 RNA，其與植物根的進(jìn)食位點(diǎn)中線蟲存活、生長或生育力必需的植物基因 基本同一。
在本文中使用時(shí)，考慮比較RNA和DNA序列時(shí)尿嘧咬代替胸腺嘧，定， 術(shù)語"基本同一"和"對應(yīng)于"表示dsRNA —條鏈的核苷酸序列與靶基 因的20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約80%-90%同一，更優(yōu)選地，與耙基因 的20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約卯-95%同一，最優(yōu)選地，與靶基因的20 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約95-99%同一或完全同一。示范性的植物寄生線 蟲靶基因公開于例如共同轉(zhuǎn)讓的共同未決的美國專利申請公開號
No.2005/188438中，其并入本文作為參考。
或者，為了進(jìn)行線蟲控制，與本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸處于有效連接 中的第二多核苷酸可編碼可讀框，優(yōu)選地編碼蛋白質(zhì)編碼基因。例如，第 二多核苷酸可編碼來自任何物種的任何可讀框。非限制性的例子是來自大 豆屬、擬南芥屬、苜蓿屬(AfW/cflgo)、埃希氏菌屬(Esc/^Wc/^tf)、芽孢桿菌 屬CS"c"7/"s)、才艮瘤菌屬(/^/z。6f7i附)或酵母屬(5Vicc/^n7附j(luò);c"e"凈勿種。侈寸^(口， 第二核酸可編碼昆蟲抗性基因，細(xì)菌疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因， 病毒疾病抗性基因，線蟲疾病抗性基因，除草劑抗性基因，影響谷粒組成 或品質(zhì)的基因，養(yǎng)分利用基因，真菌毒素減少基因，雄性不育基因，可選 擇標(biāo)記物基因，可篩選標(biāo)記物基因，陰性可選擇標(biāo)記物基因，陽性可選擇 標(biāo)記物基因，影響植物農(nóng)學(xué)特征(如產(chǎn)率)的基因，環(huán)境脅迫抗性基因(例 如賦予對干旱、熱、寒冷、冷凍、過濕、鹽脅迫或氧化脅迫的抗性或耐性 的基因)，改善淀粉特性或數(shù)量、油數(shù)量和品質(zhì)、氨基酸或蛋白質(zhì)組成的 基因等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，可讀框編碼下述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在進(jìn) 食位點(diǎn)中過表達(dá)時(shí)導(dǎo)致提高的線蟲抗性。線蟲抗性的分子機(jī)制可大幅變化， 取決于具體的策略。例如，可通過過表達(dá)對線蟲有毒性的基因來達(dá)成提高 的線蟲抗性，所述基因破壞線蟲進(jìn)食位點(diǎn)的形成和/或維持，修飾對線蟲的 養(yǎng)分的可獲得性或遞送，提高植物防御應(yīng)答，或以任何方式對線蟲生殖有害。在另一實(shí)施方案中，基因編碼對線蟲有毒的蛋白質(zhì)。例如，編碼微生 物毒素或其片段的多核苷酸，來自昆蟲的毒素或其片段例如美國專利號
5,457,178; 5,695,954; 5,763,568; 5,959,182中所述的那些等等適用于本發(fā)明 的該實(shí)施方案。
作物植物和相應(yīng)的致病線蟲在《美國植物疾病索引》(美國農(nóng)業(yè)部手冊 第165號，1960);《北美洲植物寄生線蟲物種分布》(線蟲學(xué)家學(xué)會(huì)，1985)和 《美國植物及植物產(chǎn)品上的真菌》(美國植物病理學(xué)會(huì)，1989)中列出。例 如，本發(fā)明所針對的植物寄生線蟲包括而不限于，胞嚢線蟲和根癌線蟲。 本發(fā)明所靶向的具體植物寄生線蟲包括而不限于大豆異皮線蟲、甜菜異皮 線蟲(Heterodera schachtii)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)、水稻異皮 線蟲(Heterodera oryzae)、木豆異皮線蟲(Heterodera cajani)、車軸草異皮 線蟲(Heterodera trifolii)、馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)、馬鈴薯金線 蟲(G. rostochiensis)或煙草球異皮線蟲(Globodera tabacum)、南方根結(jié)線 蟲(Meloidogyne incognita)、花生才艮結(jié)線蟲(M. arenaria)、北方才艮結(jié)線蟲(M. hapla)、爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)、納西根結(jié)線蟲(M. naasi)、短小根結(jié) 線蟲(M.exigua)、起絨草莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、窄小莖線蟲 (Ditylenchus angustus)、相似穿孔線蟲(Radopholus simms)、柑橘穿孔線蟲 (Radopholus citrophilus)、多帶蟲累i走線蟲(Helicotylenchus multicinctus)、咖 啡短體線蟲(Pratylenchus coffeae)、 最短尾短體線蟲(Pratylenchus brachyurus)、 傷殘短體線蟲(Pratylenchus vulnus)、 彎曲短體線蟲 (Paratylenchus curvitatus)、玉米短體線蟲(Paratylenchus zeae)、 腎形小盤 3走線蟲(Rotylenchulus reniformis)、 4艮蓮花才以毛刺線蟲(Paratrichodorus anemones)、 較小擬毛刺線蟲(Paratrichodorus minor)、 Paratrichodorus christid、 麥津立鰻線蟲(Anguina tritici)、 Bidera avenae、 小麥沖艮癭線蟲 (Subanguina radicicola)、 塞氏紐帶線蟲(Hoplolaimus seinhorsti)、哥倫比 亞紐帶線蟲(Hoplolaimus Columbus)、 帽狀紐帶線蟲(Hoplolaimus galeatus)、 半穿刺小墊刃線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、 花生鞘線蟲 (Hemicycliophora arenaria)、 椰子細(xì)桿刃線蟲(Rhadinaphelenchuscocophilus)、 7K平對刺線蟲(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺線蟲 (Trichodorus primitivus)、異常珍珠線蟲(Nacobbus aberrans)、 貝氏滑刃 線蟲(Aphelenchoides besseyi)、 卡納亞才以鞘'線蟲(Hemicriconemoides kanayaensis)、克萊頓矮^f匕線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、 美洲劍線蟲 (Xiphinema americanum)、 瘥疫壞死線蟲(Cacopaurus pestis)等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，被靶向的線蟲屬于誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線 蟲科。誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲屬于長針線蟲科(Longidoridae)、毛 刺線蟲科(Trichodoridae)、異皮線蟲科(Heterodidae)、根結(jié)線蟲科 (Meloidogynidae)、 短體線蟲科(Pratylenchidae)或小墊刃線蟲科 (Tylenchulidae)。尤其是異皮線蟲科和根結(jié)線蟲科。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)線蟲屬于選自由偽根瘤線蟲屬 (Naccobus)、 仙人掌胞嚢線蟲屬(Cactodera)、 長形胞囊線蟲屬 (Dolichodera)、球異皮線蟲屬(Globodera)、異皮線蟲屬(Heterodera)、 Punctodera 、長4十線蟲線蟲屬(Longidorus)或才艮結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)組 成的組中的一個(gè)或多個(gè)屬。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目標(biāo)線蟲屬于選自由偽 根瘤線蟲屬(Naccobus)、仙人掌胞嚢線蟲屬、長形胞嚢線蟲屬、球異皮線 蟲屬、異皮線蟲屬、Punctodera或根結(jié)線蟲屬組成的組中的一個(gè)或多個(gè)屬。 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，目標(biāo)線蟲屬于選自由球異皮線蟲屬、異皮線蟲屬 或根結(jié)線蟲屬組成的組中的一個(gè)或多個(gè)屬。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，目 的線蟲屬于選自由球異皮線蟲屬或異皮線蟲屬組成的組中的一個(gè)或兩個(gè) 屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)線蟲屬于根結(jié)線蟲屬。
當(dāng)靶向的線蟲是球形胞嚢線蟲屬(G7o^&m)時(shí)，靶向的物種可選自 蕃草屬球異皮線蟲(G". flc/^7/e"e)、蒿球異皮線蟲(( . a,tew/w'ffC 、 G".
(7.脂7/e/o/仏蘋果球異皮線蟲(G*.附fl//,、馬鈴 薯白線蟲((7./m/"由)、馬鈴薯金線蟲(G. m"oc/^附的、煙草異皮線蟲(G. ra6acM附)和G. Wrg/m'"e。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，革巴向的球形胞嚢線蟲 屬(G7M^/em)線蟲包括至少物種馬鈴薯白線蟲(G". /m//^i)、煙草異皮線蟲 (G". r"6flcw附)或馬鈴薯金線蟲((7. mstoc/^'e"s/"之一 。當(dāng)乾向的線蟲是胞嚢線蟲屬(77etefw/c")時(shí)，物種可選自燕麥異皮線蟲(H. avenae)、胡蘿卜異皮 線蟲(H. carotae)、鷹嘴豆異皮線蟲(H. ciceri)、十字花科異皮線蟲(H. cruciferae)、 H. delvii、褐藻異皮線蟲(H. dachista)、菲力普異皮線蟲(H. filipjevi)、 H. gambiensis、大豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲(H. goettingiana)、 蕎麥異皮線蟲(H. gradimi)、蛇麻異皮線蟲(H. humuli)、大麥異皮線蟲(H. hordecalis)、小麥異皮線蟲(H. latipons)、燕麥異皮線蟲(H. major)、苜蓿 異皮線蟲(H. medicaginis)、水稻異皮線蟲(H. oryzicola)、巴基斯坦異皮線 蟲(H. pakistanensis)、酸模異皮線蟲(H. rosii)、甘蔗異皮線蟲(H. sacchari)、 甜菜異皮線蟲、高粱異皮線蟲(H. sorghi)、車軸草異皮線蟲、蕁麻異皮線 蟲(H. urticae)、豇豆異皮線蟲(H. vigni)和玉米異皮線蟲(H. zeae)。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶向的胞嚢線蟲屬線蟲包括至少物種大豆異皮線蟲、 燕麥異皮線蟲、木豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲、車軸草異皮線蟲、玉米異 皮線蟲或甜菜異皮線蟲之一。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶向的線蟲包 括至少物種大豆異皮線蟲或甜菜異皮線蟲之一。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案 中，靶向的線蟲是物種大豆異皮線蟲。
當(dāng)靶向的線蟲是根結(jié)線蟲屬(Afe/wVfesj"e)時(shí)，耙向的線蟲可選自高粱 才艮結(jié)線蟲(M. acronea)、 M. arabica、花生才艮結(jié)線蟲(M. arenaria)、甘藍(lán)才艮 結(jié)線蟲(M. artiellia )、短尾根結(jié)線蟲(M. brevicauda)、山茶根結(jié)線蟲(M. camelliae)、哥倫比亞才艮結(jié)線蟲(M. chitwoodi)、咖啡才艮結(jié)線蟲(M. cofeicola)、 短小根結(jié)線蟲(M. esigua)、禾草根結(jié)線蟲(M. graminicola)、北方根結(jié)線蟲 (M. hapla)、南方根結(jié)線蟲、印度根結(jié)線蟲(M. indica)、海濱根結(jié)線蟲(M. inornata)、爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)、林氏根結(jié)線蟲(M. lini)、蘋果根結(jié) 線蟲(M. mali)、小頭根結(jié)線蟲(M. microcephala)、小突根結(jié)線蟲(M. microtyla)、納西根結(jié)線蟲(M. naasi)、薩拉斯根結(jié)線蟲(M. salasi)和泰晤士 根結(jié)線蟲(M.thamesi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靼向的線蟲包括至少爪 哇根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲或哥倫比亞根 結(jié)線蟲。
可用本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸轉(zhuǎn)化任何植物物種。例如，可用含本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物包括但不僅限于來自以下屬的
植物，所述屬選自苜蓿屬(Medicago)、番茄屬(Lycopersicon)、蕓苔屬 (Brassica)、香瓜屬(Cucumis)、癡屬(Solanum)、核杉^屬(Juglans)、沖帛屬 (Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金魚草屬(Antirrhinum)、 楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬、云杉屬(Picea)、辣椒屬 (Capsicum)、 藜屬(Chenopodium)、 菊屬(Dendranthema)、 牽牛屬 (Pharbitis)、木厶屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea)、 小麥屬(Triticum)、小黑麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(Lolium)、 大麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬(Pseudotsuga)、伽藍(lán)菜屬 (Kalanchoe)、甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nicotiaim)、 南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬、 驢食草屬(Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆 屬(Vigna)、橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬 (Manihot)、胡聲巴屬(Daucus)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛 茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、煙草屬、碧冬 茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、 Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、萵 苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬、萱草 屬(Heterocallis)、 水仙屬(Nemesis)、 天竺葵屬(Pelargonium)、 稷屬 (Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、 毛蒗屬(Ranunculus)、千里光屬 (Senecio)、 喇叭舌屬(Salpiglossis)、藍(lán)英花屬(Browaalia)、 菜豆屬 (Phaseolus)、 燕麥屬(Avena)和蔥屬(Alli腿)。
枝、科、屬或植物種中。可以從一個(gè)植物物種中分離的所述啟動(dòng)子多核苷 酸的衍生物和變體優(yōu)選地用在這樣的植物中，其中所述的植物與用于分離 所述啟動(dòng)子多核苷酸的衍生物和變體的植物屬于相同的進(jìn)化枝、科、屬或 種。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物，優(yōu)選是禾本科 (Poaceae)、 芭蕉科(Musaceae)、 百合科(Liliaceae)或鳳梨科(Bromeliaceae) 植物，優(yōu)選是禾本科植物。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍?qū)佟⑿←湆佟⒌緦?、大麥屬、黑麥屬、燕麥屬、甘蔗?Saccharum)、 高粱屬(Sorghum)、狼尾草屬、狗尾草屬(Setaria)、稷屬、蟋蟀草屬 (EIeusine)、芒屬(Miscanthus)、短柄草屬(Brachypodhim)、羊茅屬(Festuca) 或黑麥草屬植物。當(dāng)植物是玉蜀黍?qū)?Zefl)時(shí)，優(yōu)選的物種是玉米(Z. w"w)。 當(dāng)植物是小麥屬(7W"'CM附)時(shí)，優(yōu)選的物種是普通小麥(r. aeWvw附)、斯佩 爾特小麥(r.s戸/toe)或硬粒小麥(r. d r"w)。當(dāng)植物是稻屬(0^;w)時(shí)，優(yōu)選 的物種是稻(O. MftV")。當(dāng)植物是大麥屬(/^^Y/eM/W)時(shí)，優(yōu)選的物種是大麥 (7/.vw/g re)。當(dāng)植物是黑麥屬(&c"/e)時(shí)，優(yōu)選的物種是黑麥(51. ""fl/e)。 當(dāng)植物是燕麥屬(^vwfl)時(shí)，優(yōu)選的物種是燕麥(A:ya"vfl)。當(dāng)植物是甘蔗屬 (SflCC/m/WM)時(shí)，優(yōu)選的物種是甘蔗(義^^",'"w"w)。當(dāng)植物是高梁屬 (^SW^A"/M)時(shí)，優(yōu)選的物種是蜀黍(51. v"/g"")、兩色蜀黍(51. 6/co/w)或蘇丹 草(S. sM^me"^)。當(dāng)植物是狼尾草屬(尸e/m/se似附)時(shí)，優(yōu)選的物種是御谷(尸. g/flwc /w)。當(dāng)植物是狗尾草屬(&似〃'《)時(shí)，優(yōu)選的物種是谷子(51. /似/Zca)。 當(dāng)植物是黍?qū)?尸"w/cw/M)時(shí)，優(yōu)選的物種是野生稷(尸.抓'//"""附)或柳枝稷(尸. v/rgfl《"附)。當(dāng)4直物是糝屬(E7e"w'"e)時(shí)，優(yōu)選的物種是糝子(E cw"cflwff)。 當(dāng)植物是芒屬(7kfecfl/i^附)時(shí)，優(yōu)選的物種是芒(Af. w'we附/s)。當(dāng)植物是短 柄草屬OBmd^;/wrf/"w)時(shí)，優(yōu)選的物種是二穂短柄草(及《fc似d^wi)。當(dāng)植 物是羊茅屬(Fe""c")時(shí)，優(yōu)選的物種是葦狀羊茅(F. arM"^mi/7W、紫羊茅 (F. r"Am)或草甸羊茅(F./7mte"^)。當(dāng)植物是黑麥草屬(Z^/,'"附)時(shí)，優(yōu)選的 物種是多年生黑麥草(丄./;e""we)或多花黑麥草(丄.ww似yZof"附)。或者植物 可以是小黑麥屬(7Wric0seca/e)。
或者在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是雙子葉植物，優(yōu)選地是豆科 (/^flcefle)、 癡科(So/fl冊ce"e)、 蕓繭科(i mw/caceae)、 藜科 (CTiewo/^/aceae)、 菊科、 錦蔡科(Affl/mce"e)、 亞麻科 (丄,Vi"mie)、 大戟科(￡""/ /i0/^'flmjre)、 旋花科(Cbww/v /"mie)、 蕃蔽科 (/ o5Yice"e)、葫,科(CwcM由',amie)、山茶科(rAeacefle)、萏草科(J w6Zamie)、 梧桐科(5紐""http://7|""^)或柑橘(0附)科的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是 豆考牛(Ffl6"ce"e)、 癡科(Xo/flWflceae)或蕓苫科CBm5"5iaicefle)的才直物。因jt匕，在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是豆科(尸"6fl"^)，優(yōu)選地是大豆屬(G(v"Vie)、豌 豆屬(尸&"附)、落花生屬(Jnic/^)、鷹嘴豆屬(C/cw)、蠶豆屬(KZd")、菜豆 屬(/^as^o/ws1)、羽扇豆屬(1—ww)、苜蓿屬(A/eWcflgo)或兵豆屬(Lens)。優(yōu) 選的豆科(F"6""fle)物種是截形苜蓿(7kf. ^wiai似/tf)、紫苜蓿(Af. sW/v")、大 豆(G".附"jc)、婉豆(尸.s",/vw附)、花生(A /ij^^1)、鷹嘴豆(C flwW/"w附)、 蠶豆()K /"6fl)、 菜豆(尸.y"/ga尸/s)、 白羽扇豆(丄w/;/"附"幼"5)、 黃羽扇豆 (X"/ /鼎s /她ms1)、 狹葉羽扇豆(Lupimis angustifolius)或兵豆 (^//""r&)。更優(yōu)選的是大豆(G.附紅)和花生(A/13;/70ge")、紫苜蓿(iV/.sariva) 物種。最優(yōu)選的是大豆(G.附ax)。當(dāng)植物是茄科(So/tfmic^^)時(shí)，優(yōu)選的屬 是癡屬(5W做m附)、番癡屬(Z^co/ 、 煙草屬(7V/cWa聽)或辣椒屬 (Cfl/w/cw附)。優(yōu)選的癡科物種是馬鈴薯()S".似Ae,05n附)、番癡(丄.e5xr"/e"似柳)、 煙草(7V: to6a"w附)或黃燈籠辣椒(C W/"e"w)。更優(yōu)選的是馬鈴薯(X ,w^^w"附)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是十字花科(5mw/cac^ie)， ^尤選的是4以南芥屬(^/Yi6,V/o/^is)、 蕓莒(5r"sw'ca)或蘿卜屬(及a/;/i"""s)。 優(yōu) 選的十字花科(i m^Zcfl"M)物種是擬南芥(A 、歐洲油菜(5.
m"/7附)、甘藍(lán)^6. 0/emcea)、芥菜C6.y朋cefl)或充青C6. r"戸)物種。更優(yōu)選的
是歐洲油菜(及fl"/7附)物種。當(dāng)植物是藜科(C^wo/w力'fl"fle)時(shí)，優(yōu)選的屬
是甜菜屬Ce^")，優(yōu)選的物種是甜菜(B. vM/g"Ws)。當(dāng)植物是菊科(/4stemce"e) 時(shí)，優(yōu)選的屬是向日葵屬(7^//朋溈""，優(yōu)選的物種是向日葵(/T.朋fi""s)。 當(dāng)植物是錦葵科(M"/v"ce"e)時(shí)，優(yōu)選的屬是棉屬(Gm^/^"附)或秋葵屬 (J^/附mcA附)。當(dāng)屬是棉屬((7仍5"j^"w)時(shí)，優(yōu)選的物種是陸地棉(G. /^>^|似柳)或海島棉((7. ^frA^jfe"")，最優(yōu)選的物種是陸地棉(G. A/ra"似附)。 秋葵屬(J^/附^c^附)的優(yōu)選的物種是咖啡黃葵C4. "c"/ew似s)。當(dāng)植物是亞 麻科(丄/聽"fl"時(shí)，優(yōu)選的屬是亞麻屬(丄/""附)，優(yōu)選的物種是亞麻(丄.
W5i'似,kS7'附"附)。當(dāng)植物是大戟科(五m/7Ac6/tfCeffe)時(shí)，優(yōu)選的屬是木薯屬
(Af"w幼W)、麻風(fēng)樹屬(/fl^ /7")或蓖麻屬(/W"Vi"s)，優(yōu)選的物種是木薯(Af. cscm/cm似)、麻風(fēng)樹(/ c"rcfl^或蓖麻co附""/s)。 當(dāng)才直物是牙走花科 (G wvo/vw/"ce"e)時(shí)，優(yōu)選的屬是番薯屬(/po附e")，優(yōu)選的物種是/. 6atoto 。當(dāng)植物是薔薇科(及WflCMe)時(shí)，優(yōu)選的屬是薔薇屬(/^^1)、蘋果屬(Affl/附)、 梨屬(/^T附)、李屬(尸/wi"S)、懸鉤子屬(及"6附)、茶薦子屬(W幼M)、越橘屬
(Fflc"'"/"附)或草莓屬(Fnigw,Vi),優(yōu)選的物種是雜種荷蘭草莓CFmgfl〃Vi ;c flw"/io^ff)。 當(dāng)植物是葫,科(Cwcw^/似feM)時(shí)，優(yōu)選的屬是黃瓜屬 (C"(7ww's)、西瓜屬(Ow〃"s)或南瓜屬(C"cwr6/似)，優(yōu)選的物種是黃瓜 (Ozc'w附/s 5^,/v"51)、 西瓜(C7,w〃fi51 /fl聽f""或西葫聲(C"cwr6/f" p印o)。 當(dāng)植 物是山茶科(77^flce"e)時(shí)，優(yōu)選的屬是山茶屬(G/附e肌")，優(yōu)選的物種是茶 (C"附e〃/fl w'"e附/s)。
當(dāng)植物是萏草科(/ w6/""fl^)時(shí)，優(yōu)選的屬是咖啡屬
(Coj5^")，優(yōu)選的物種是小果咖啡(c. w"6/c")或中果咖啡(c: c""印/^/yi)。當(dāng)
植物是梧桐科(Ste/r"/,ViceM)時(shí)，優(yōu)選的屬是可可樹屬(77i 6fwii")，優(yōu)選 的物種是可可樹(r. MCflo)。當(dāng)植物是柑橘屬(07r附)時(shí)，優(yōu)選的物種是甜橙 (C s7"ms/51)、梓樣(C /Z附ow)、桔(C rC'cw/"似)、柚(C.附ox/附fl)和村橘物種
的雜種等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在暴露于線蟲刺激的植物根中誘導(dǎo)啟動(dòng)子多核 苷酸。植物被植物寄生線蟲感染或處于被植物寄生線蟲感染過程中時(shí)，可 存在線蟲刺激。介導(dǎo)應(yīng)答線蟲刺激的表達(dá)的啟動(dòng)子多核苷酸也可以稱作線 蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子多核苷酸。涉及本發(fā)明的啟動(dòng)子、啟動(dòng)子多核苷酸、分離 的核酸或多核苷酸的術(shù)語"根優(yōu)選的表達(dá)"表示主要在根組織中、尤其是 在根維管組織中表達(dá)。主要在根組織中表達(dá)表示，與相同量其他組織(例 如葉、莖或花組織)中產(chǎn)生的mRNA量相比時(shí)，特定量的根組織中在本發(fā) 明的啟動(dòng)子多核苷酸控制下產(chǎn)生的mRNA量至少高10倍、50倍、100倍 或200倍。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的表達(dá)盒。該語境中"表達(dá) 盒"應(yīng)當(dāng)被廣義地理解為包含盒中含有的所有下述序列，所述序列可影響 目的核酸的轉(zhuǎn)錄和如果適用的話影響其翻譯。除了本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷 酸外，本發(fā)明的表達(dá)盒還可包含促進(jìn)啟動(dòng)子多核苷酸功能的調(diào)節(jié)元件， 或允許在原核生物和/或真核生物中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的遺傳元件，和下游(在 3'-方向中)調(diào)節(jié)元件，例如轉(zhuǎn)錄終止序列和多聚腺苷酸化序列。本發(fā)明表達(dá)盒的多種組件順序并有效地連接在一起。
因此，本發(fā)明的表達(dá)盒可包含能夠介導(dǎo)根優(yōu)選和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)的 啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包含啟動(dòng)子多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子多核苷酸選自
以下多核苷酸a)具有SEQ ID NO:l中公開的序列的多核苷酸；b)包含 下述多核苷酸的核苷酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列；c)與a)或b)的多核苷酸具有至少70%同一性的多核 苷酸；d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和e)包含 下述多核苷酸的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少100個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少 200個(gè)連續(xù)核苷酸片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQIDNO:l中公 開的序列。在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子在被植物寄生線蟲感染的植物根中 被誘導(dǎo)。
可以任選地在本發(fā)明表達(dá)盒中包括的具體遺傳元件包括而不限于允許 在細(xì)菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，例如來自pBR322或P15A ori的ORI區(qū)；或 土壤桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的元件例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界。 本發(fā)明表達(dá)盒的其他成分可以包括而不限于，額外的調(diào)節(jié)元件，例如增強(qiáng) 子、內(nèi)含子、多接頭、多克隆位點(diǎn)、操縱基因、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合位點(diǎn)等。示例性增強(qiáng)子包括來自CaMV35S啟動(dòng)子、章魚堿合酶基 因(Ellis等，1987)、稻肌動(dòng)蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因(Callis， 1987)、 玉米矮縮I基因(Vasil 1989)、 TMV ft元件(Gallie, 1989)和非植物性真核 生物(例如酵母；Ma 1988)的啟動(dòng)子的元件。示例性行植物內(nèi)含子序列包括 來自Adhl、 bronze 1、肌動(dòng)蛋白1、肌動(dòng)蛋白2(WO 00/760067)的內(nèi)含子 或蔗糖合酶內(nèi)含子；見The Maize Handbook,第116章，F(xiàn)reeling和 Walbot編輯，Springer, New York(1994)。
病毒前導(dǎo)序列也可以增強(qiáng)本發(fā)明表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄目的核酸。例如，來自煙 草花葉病毒(TMV)、玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的 前導(dǎo)序列已經(jīng)證明有效增強(qiáng)表達(dá)。本領(lǐng)域已知的其他前導(dǎo)序列包括，但不 限于小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如腦脊髓炎病毒(EMCV)前導(dǎo)序列；馬鈴 薯Y病毒屬前導(dǎo)序列、煙草蝕紋病毒(TEV)前導(dǎo)序列；MDMV(玉米矮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)序列、來自苜?；?br>葉病毒衣殼蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻譯前導(dǎo)序列。
本發(fā)明的表達(dá)盒也包含轉(zhuǎn)錄終止元件或多聚腺苷酸化信號，示例性轉(zhuǎn) 錄終止元件包括來自根瘤土壤桿菌胭脂堿合酶基因的那些轉(zhuǎn)錄終止元件 (Bevan， 1983)、來自根瘤土壤桿菌章魚堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄物的終止子 以及來自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3'末端。
將要被轉(zhuǎn)錄成RNA并任選地表達(dá)為蛋白質(zhì)的第二多核苷酸插入本發(fā) 明的表達(dá)盒中，用于轉(zhuǎn)化進(jìn)生物中。根據(jù)本發(fā)明，第二多核苷酸序列被置 于本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的下游(即3'-方向上)和轉(zhuǎn)錄終止元件的上游， 與其共價(jià)連接。優(yōu)選地，第二多核苷酸序列和本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸之 間的距離不超過200堿基對，更優(yōu)選地不超過IOO堿基對，最優(yōu)選地不超 過50堿基對。
也可通過將本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸插入植物基因組中，來裝配本發(fā) 明的表達(dá)盒。這類插入可導(dǎo)致與基因組固有的目的核酸序列的有效連接。 作為本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性的結(jié)果，這類插入允許目的核
酸在被線蟲誘導(dǎo)后優(yōu)先在根組織中表達(dá)或過表達(dá)。插入可以是定向的或隨 機(jī)的。優(yōu)選地，插入是定向的并通過例如同源重組實(shí)現(xiàn)。通過該步驟，可 以用本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸完全或部分地替換天然的啟動(dòng)子，從而修飾 內(nèi)源基因的表達(dá)譜。
本發(fā)明的表達(dá)盒可被插入重組載體、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染 色體)、BAC (細(xì)菌人工染色體)或適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何其他載 體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲(chǔ)存多核苷酸或用 于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如但不僅限于大腸桿菌(J^c/ien'c/i紐c o/i)、 根瘤土i裏桿菌(j. rw附e/iic/e附)和毛根土壤桿菌(/1. M/wg^iM)細(xì)胞和植物 細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)盒或載體可被插入被轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞的基因組中?；蛘撸磉_(dá)盒或載體可保持在染色體外。本發(fā)明的表達(dá)盒 或載體可存在于植物細(xì)胞的核、葉綠體、線粒體和/或質(zhì)體中。優(yōu)選地，本
發(fā)明的表達(dá)盒或栽體被插入植物細(xì)胞核的染色體DNA中。本發(fā)明的表達(dá)盒可被轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物 包含與本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸有效連接的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。該實(shí)施
方案的轉(zhuǎn)基因植物包含下述啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包含如SEQIDNO:l中公 開的啟動(dòng)子多核苷酸序列或SEQ ID NO:l的最小啟動(dòng)子多核苷酸片段?；?者，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含能夠介導(dǎo)根優(yōu)選和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)的啟動(dòng) 子多核苷酸，所述啟動(dòng)子多核苷酸在嚴(yán)格條件下與下述啟動(dòng)子多核苷酸雜 交，所述啟動(dòng)子多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列或SEQ ID NO:l 的最小啟動(dòng)子多核苷酸片段。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含能夠介導(dǎo)根 優(yōu)選和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)的啟動(dòng)子多核苷酸，所述啟動(dòng)子多核苷酸與下述 啟動(dòng)子多核苷酸具有至少70%的序列同一性，所述啟動(dòng)子多核苷酸具有 SEQ ID NO:l中7>開的序列或SEQ ID NO:l的最小啟動(dòng)子多核苷酸片段。 如本文中所用，術(shù)語"植物，，根據(jù)上下文可以理解為意指完整植林、植 物細(xì)胞、植物器官、收獲的種子及其子代。詞匯"植物"也指任一植物，尤 其種子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分或植物器官包 括，但不限于莖、根、嫩枝、果實(shí)、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區(qū)、 愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、微孢子、下胚軸、子葉、花藥、萼片、 花粉、非收獲的種子等。收獲的種子是指從生產(chǎn)種子的植物上取下的種子， 而非收獲的種子是指仍然與生產(chǎn)種子的植物相連的種子，例如其處于生長 或成熟階段。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。所述植物可以源于選 自由玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥、稻、甘蔗、柑桔樹、菠蘿、 椰子、香蕉、咖啡、茶、煙草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、芽 菜、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、茄子、胡椒、油菜(oilseedrape)、蕓莒、 甜菜、巻心菜、花椰菜、緣花椰菜、萵苣、百樂M艮屬物種(Lotussp.)、蒺藜 苜覆(Medicagotruncatula)、多年生草、黑麥草和擬南芥組成的組中的屬。
制備。任何方法可被用于將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的合適方法可見 于例如WO2006/024509 (PCT/EP2005/009366; USSN60/6060789)和上文Sambrook " a/.中，以及其他實(shí)驗(yàn)室手冊例如Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44，々/^6""m'M附protocols, Ed: Gartland and Davey， Humana Press, Totowa， New Jersey中。轉(zhuǎn)化雙子葉植物的通用方法也公開 于例如美國專利號4，940，838; 5,464,763等等中。用于轉(zhuǎn)化特定雙子葉植物 例如棉花的方法公開于美國專利號5,004,863; 5，159，135和5,846,797中。大 豆轉(zhuǎn)化方法公開于美國專利號4,992,375; 5,416,011; 5，569，834; 5,824,877; 6,384,301和EP 0301749B1中。其他植物轉(zhuǎn)化方法公開于例如美國專利號 4,945,050; 5,188,958; 5，596，131; 5，981，840等等中。
轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二 醇誘導(dǎo)的DNA攝入、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US 4,536,475)、使用基因槍的生 物射彈方法(Fromm ME W Bio/Technology. 8(9):833-9， 1990; Gordon-Kamm "fl/. Plant Cell 2:603， 19卯)、電穿孔、在含DNA的溶液中 溫育干胚，以及顯孩i注射。在這些直接轉(zhuǎn)化方法的情況下，使用的質(zhì)粒不 需要滿足任何具體的要求?？墒褂脝我毁|(zhì)粒，例如pUC系列、pBR322、 M13mp系列、pACYC184的質(zhì)粒等等。如果要從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整 的植物，則另外的可選擇標(biāo)記物基因優(yōu)選地位于質(zhì)粒上。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)同 樣適用于雙子葉和單子葉植物?？梢酝ㄟ^借助于土壤桿菌的細(xì)菌感染(例 如EP 0 116 718 )、借助于病毒載體的病毒干擾(EP 0 067 553; US 4，407，956; WO 95/34668; WO 93/03161)或借助于花粉(EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4，684，611)完成轉(zhuǎn)化?；谕寥罈U菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)(特別是對于雙子葉植 物而言)是本領(lǐng)域公知的。土壤桿菌菌林(例如根瘤土壤桿菌或毛根土壤 桿菌)包含質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和T-DNA元件，所述質(zhì)粒和元件在用土 壤桿菌轉(zhuǎn)染后被轉(zhuǎn)移至植物。T-DNA (轉(zhuǎn)化DNA )被整合進(jìn)植物細(xì)胞的基 因組中。T-DNA可位于Ri-質(zhì)?；騎i-質(zhì)粒上，或獨(dú)立地包含在所謂的雙元 載體中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法描述于例如Horsch RB C a/. (1985) Science 225:1229中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適合雙子葉^t物，但是也適合 單子葉植物。土壤桿菌對植物的轉(zhuǎn)化描述于例如White FF， Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants，第1巻，Engineeringand Utilization, S.D. Kung和R， Wu編輯，Academic Press, 1993， pp. 15畫 38; Jenes B Cfl/. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants，第1巻， Engineering and Utilization, S.D. Kung和R. Wu編輯，Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) A國Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225中。轉(zhuǎn)化可導(dǎo)致瞬時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。盡管本發(fā)明的
其尤其適用于作物植物細(xì)胞。
可使用已知的植物育種方法，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物與以下雜交制備 種子類似的轉(zhuǎn)基因植物，或缺少與本發(fā)明啟動(dòng)子多核苷酸有效連接的基 因的轉(zhuǎn)基因植物，或非轉(zhuǎn)基因植物。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包括下 述另一轉(zhuǎn)基因植物和/或與之雜交從而在植物和/或其后代中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因"垛 疊"，所述另一轉(zhuǎn)基因植物包含與本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸或另一啟動(dòng)子 有效連接的一個(gè)或多個(gè)不同基因。然后種植種子，獲得雜交的能育轉(zhuǎn)基因 植物，其包含目的核酸和本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸。雜交的能育轉(zhuǎn)基因植 物可具有通過母本或通過父本遺傳的具體表達(dá)盒。第二種植物可以是近交 的植物。雜交的能育轉(zhuǎn)基因植物可以是雜種。還包括在本發(fā)明中的是任何 這些雜交的能育轉(zhuǎn)基因植物的種子。本發(fā)明的種子可從能育的轉(zhuǎn)基因植物 收獲并用于栽培本發(fā)明的被轉(zhuǎn)化植物的后代，包括包含所述DNA構(gòu)建體 的雜種植物4朱系。
也可以如下實(shí)現(xiàn)"基因垛疊"通過植物轉(zhuǎn)化將兩個(gè)或更多多核普酸 轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核中。在該語境中，"基因"表示編碼全長蛋白質(zhì)的多核苷酸 以及編碼RNAi構(gòu)建體或全長蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。在轉(zhuǎn)化期間， 可順序地或同時(shí)將多個(gè)多核苷酸引入細(xì)胞核中。多個(gè)植物基因或目標(biāo)病原 體基因可以通過使用靶定多個(gè)連接的部分目的序列的單個(gè)轉(zhuǎn)基因借助沉默 機(jī)制、尤其RNAi進(jìn)行下調(diào)。在各自啟動(dòng)子控制下的多個(gè)垛疊基因也可以 過量表達(dá)以獲得想要的單個(gè)或多個(gè)表型。也可以將含有過量表達(dá)基因和受 沉默靶標(biāo)的基因垛疊的構(gòu)建體導(dǎo)入植物，從而產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)農(nóng)學(xué)重要的 表型。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列可以與目的多核苷酸序列的任一組合垛疊以產(chǎn)生所需表型。所述組合可以產(chǎn)生具有多種性狀組合的植 物，所述性狀組合包括，但不限于抗病性、除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、耐 寒性和耐旱性。這些垛疊的組合可以由任一方法產(chǎn)生，所述的任一方法包 括，但不限于通過常規(guī)方法或通過遺傳方法對植物進(jìn)行雜交育種。若性狀 通過遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行堆疊，則目的多核苷酸序列可以按照任一順序依次或同 時(shí)組合。例如，若欲導(dǎo)入兩個(gè)基因，則這兩個(gè)序列可以包含在獨(dú)立的轉(zhuǎn)化 盒內(nèi)或位于相同的轉(zhuǎn)化盒上。所述序列的表達(dá)可以由相同或不同的啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)。
本發(fā)明還包括作物，所述的作物包括在農(nóng)田中 一起栽種的多種本發(fā)明 轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以用于控制作物中植物寄生線蟲侵染的方法
內(nèi)，所述方包括以下步驟從包含表達(dá)盒的種子培育出所述作物，其中所 述的表達(dá)盒包含與編碼物質(zhì)的第二核酸有效連接的本發(fā)明植物啟動(dòng)子多核 苷酸，所述的物質(zhì)^s皮壞所述植物寄生線蟲的代謝、生長和/或繁殖，改善植 物對所述植物寄生線蟲的耐受性或?qū)λ鲋参锛纳€蟲有毒，其中所述表 達(dá)盒穩(wěn)定整合至植物細(xì)胞、植物和/或種子的基因組內(nèi)。此類物質(zhì)包括而不 限于，與對于線蟲存活、變態(tài)或繁殖必需的植物寄生線蟲的靶基因基本上 同一的雙鏈RNA;與維持線蟲采食部位所需的植物基因基本上同一的雙 鏈RNA;反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體、干擾所述線蟲代謝、存 活、變態(tài)或繁殖的蛋白質(zhì)，微生物毒素、來自昆蟲的毒素或干擾所述線蟲 代謝、存活、變態(tài)或繁殖的任一毒素等。
以下實(shí)例不意圖限制本發(fā)明權(quán)利要求
書的范圍，而是意圖作為某些實(shí) 施方案的示例。所例舉方法中技術(shù)人員想到的任一變化將屬于本發(fā)明的范 圍。
實(shí)施例l:從擬南芥克隆SCN-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
提取擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)基因組DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方 案，克隆對應(yīng)于擬南芥基因座標(biāo)記At5gl2170的、包含5，-非翻譯區(qū)的、ATG密碼子緊鄰上游的1,476 bp (SEQ ID NO :l)基因組DNA區(qū)(推定的 啟動(dòng)子序列)。對應(yīng)于At5gl2170啟動(dòng)子區(qū)的1,476 bp DNA片段顯示為 SEQ ID NO:l。 PLACE (National Institute of Agrobiological Sciences, Ibaraki， Japan)分析結(jié)果指出，在SEQ ID NO:l中啟動(dòng)子序列3，端上游300 bp區(qū)域中不存在TATA框。
實(shí)施例2:從大豆克隆At5gl2170-樣基因
使大豆栽培種Williams 82在瓊脂平板上萌發(fā)三天，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)袋 中。 一天后，用大豆異皮線蟲3號小種的第二階段幼蟲(J2)孵育每個(gè)幼苗。 接種后六天，使用已知方法將新的根組織切成1 cm長的段、固定、包埋在 cryomold中并切片。通過擴(kuò)大的細(xì)胞尺寸、增厚的細(xì)胞壁和稠密的細(xì)胞質(zhì) 的特有形態(tài)識別合胞體細(xì)胞，并使用PALM顯微鏡(P.A丄.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried,德國)解剖入RNA提取緩沖液中。
使用已知方法提取總細(xì)胞RNA、擴(kuò)增并用熒光標(biāo)記。作為對照，從"非 -合胞體"和未經(jīng)處理的對照根分離總RNA并進(jìn)行相同的RNA擴(kuò)增過程。 將擴(kuò)增的RNA與專有的大豆cDNA陣列雜交。圖4中的表格總結(jié)了通過 cDNA微陣列測量的表達(dá)數(shù)據(jù)，所述cDNA微陣列針對所有三種細(xì)胞/組織 樣品(合胞體、SCN感染的非-合胞體和未經(jīng)處理的對照根組織)中的基因 進(jìn)行分析?；虮磉_(dá)的相對水平顯示為歸一化的信號強(qiáng)度(士標(biāo)準(zhǔn)差)。如 圖4中所述，大豆cDNA克隆GM50657480被鑒定為在SCN-感染的大豆 根的合胞體中^C上調(diào)。圖3描繪了大豆cDNA克隆GM50657480的氨基酸 序列(SEQ ID NO:3)。 GM50657480 cDNA序列(SEQ ID NO:2)被確定為不 是全長的，因?yàn)椴淮嬖贏TG啟始密碼子并且根據(jù)圖6中所示GM50657480 的氨基餅列(SEQ ID NO: 3)與At5gl2170的氨基瞎列(SEQ ID NO:4) 的比對確定。
實(shí)施例3:全長啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)基因發(fā)根測定
為了評價(jià)克隆的啟動(dòng)子的表達(dá)活性，將SEQ ID NO:l的核苷酸1-1476克隆在GUS報(bào)告基因(細(xì)菌p-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson (1987) EMBO J. 6， 3卯1-3907))上游，產(chǎn)生雙元載體"pAW280"。雙元栽體中的 植物可選擇標(biāo)記物是由天然擬南芥AHAS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的來自擬南芥的乙酰 羥酸合酶(AHAS)基因的除草劑抗性形式(Sathasivan et al.， Plant Phys. 97:1044-50,1991)。
通過電穿孔(Cho et al" (1998) Plant Sci. 138， 53-65)將雙元載體 pAW280轉(zhuǎn)化進(jìn)毛根土壤桿菌(A W/zo^wm) K599菌株中。在接種毛根土 壤桿菌之前，使來自大豆Williams 82 ( SCN易感)的種子萌發(fā)，切除子葉 并數(shù)次對近軸側(cè)造成創(chuàng)傷。將毛根土壤桿菌懸浮液接種在創(chuàng)傷表面上，并 在25。C、 16小時(shí)/天光照下，將接種過的子葉近軸側(cè)向上醉育三天。然后 將子葉轉(zhuǎn)移至MS平板上，所述平板含有羧芐青霉素(為了阻抑毛根土壤 桿菌生長)和l ARSENAL (滅草煙(imazapyr)， BASF Corporation, Florham Park, NJ )作為選擇劑。兩周后從受傷側(cè)i秀導(dǎo)出發(fā)# 。收集抗 ARSENAL并在選擇培養(yǎng)基上生長的根，將其轉(zhuǎn)移至相同組成的新鮮選擇 培養(yǎng)基上，并在25。C下黑暗中培養(yǎng)。收獲發(fā)根并將它們在選擇培養(yǎng)基上培 養(yǎng)兩周后，將發(fā)根在含羧節(jié)青霉素但是不含ARSENAL的MS培養(yǎng)基上傳 代培養(yǎng)。
通過用pAW280轉(zhuǎn)化產(chǎn)生若干種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因發(fā)才艮林系。傳代培養(yǎng)后 約三周，用大豆異皮線蟲3號小種J2接種轉(zhuǎn)基因發(fā)根林系。大豆異皮線蟲 接種后十二天(DAI)，收獲發(fā)根并使用5-溴-4-氯-3-P引咮基-p-D-葡糖醛酸 (x-Gluc)測定GUS基因的p-葡糖醛酸糖苷酶活性。在接種后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)， 也在GUS染色溶液中染色來自每個(gè)林系的未經(jīng)接種的對照平板。然后在顯 微鏡下觀察根，以檢測GUS表達(dá)。對于每個(gè)轉(zhuǎn)基因抹系而言，觀察10個(gè) 隨機(jī)挑取的合胞體并記錄GUS表達(dá)強(qiáng)度。使用以下的評分指標(biāo)"-，，表示 無染色，"+"表示弱染色，"++"表示強(qiáng)染色。使用10個(gè)計(jì)數(shù)的上舍入均值 (round-up average)確定林系合胞體中的GUS表達(dá)水平。另夕卜，也使用相 同的GUS評分指標(biāo)記錄相同林系中其它根組織(例如愈傷組織、根尖、維 管系統(tǒng)、皮層和原基(primordial))的GUS表達(dá)水平"-"表示無染色，"-/+，，表示存在約25%的測試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管 GUS染色，"+"表示弱染色，"++"表示強(qiáng)染色。用pAW280轉(zhuǎn)化的林系的 結(jié)果在圖7中展示。GUS染色的結(jié)果指出對測試的大部分抹系而言， pAW280中的啟動(dòng)子片段在12 DAI時(shí)在合胞體中顯示強(qiáng)GUS表達(dá)。相反， 其它根部分例如根尖、維管組織和根皮層中的GUS表達(dá)未被檢出、在林系 間高度可變或較弱。
實(shí)施例4:最小啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因發(fā)根測定
使用基于SEQIDNO:l的引物和標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方案，從pAW280擴(kuò) 增SEQ ID NO:l的堿基476到1476所代表的1001 bp啟動(dòng)子缺失片段和 SEQ ID NO:l的堿基977到1476所代表的500 bp啟動(dòng)子缺失片段。通過 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證每種PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增DNA片段大小，并通過 Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen， Hilden,德國)提取DNA。將來自SEQ ID NO:l的啟動(dòng)子缺失克隆至GUS報(bào)告基因上游，分別產(chǎn)生雙元栽體 "RTJ119，，和"RTJ120"。雙元載體中的植物選擇標(biāo)記物是由實(shí)施例3中所 述擬南芥AHAS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的突變的AHAS基因。如實(shí)施例3中所述，將 雙元載體pAW280、RTJ119和RTJ120轉(zhuǎn)化進(jìn)毛根土壤桿菌K599菌林中， 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因發(fā)根。用大豆異皮線蟲SCN3號小種J2接種轉(zhuǎn)基因發(fā)根林系， 并如實(shí)施例3中所述測定GUS表達(dá)。
用pAW280、 RTJ119和RTJ120轉(zhuǎn)化的林系的結(jié)果列于圖8中。 RTJ119包含的SEQ ID NO:l的1001 bp最小啟動(dòng)子片段賦予了合胞體中 線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。RTJ119中的合胞體染色強(qiáng)度不如在pAW280中觀察到 的強(qiáng)。RTJ120包含的SEQ ID NO:l的500 bp片段不賦予合胞體中線蟲誘 導(dǎo)的表達(dá)。
實(shí)施例5:全才直林GUS染色
通過轉(zhuǎn)化代表性構(gòu)建體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆全植林，以表征整個(gè)植物生活 周期中根和全植林組織中響應(yīng)線蟲感染的啟動(dòng)子表達(dá)，所述轉(zhuǎn)基因大豆全植林包含與GUS報(bào)告基因有效連接的SEQ ID NO:l表示的啟動(dòng)子序列或 其變體。大豆全植林中啟動(dòng)子表征的代表性方法包括但不限于以下描述。 測試轉(zhuǎn)基因大豆Tl種子的接合性(zygosity)，并使單拷貝事件萌發(fā)、在溫 室條件下培養(yǎng)，并針對葉、莖、花、胚和種皮組織中不同發(fā)育階段的GUS 表達(dá)進(jìn)行取樣。另外，在接種和未接種的對照根中，在SCN感染之前和之 后的不同時(shí)間收獲根組織。針對每個(gè)事件測試多種植物，以測定GUS染色 分析中的一致趨勢。將收獲的樣品從植物切下并如實(shí)施例3中所述測定 GUS表達(dá)。然后觀察組織并對GUS染色的強(qiáng)度評分。
權(quán)利要求
1.包含分離的啟動(dòng)子多核苷酸的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠介導(dǎo)根優(yōu)選的和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，所述啟動(dòng)子多核苷酸選自如下多核苷酸
a)具有包含SEQ ID NO1的核苷酸1到1476的序列的多核苷酸；
b)多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO1中公開的序列的多核苷酸的核苷酸476到1476；
c)與a)或b)的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和
e)包含SEQ ID NO1的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少100個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的多核苷酸。
2. 權(quán)利要求
1的啟動(dòng)子，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸具有包含 SEQ ID NO:l的核苷酸1到1476的序列。
3. 權(quán)利要求
l的啟動(dòng)子，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸包含SEQID NO:l的核苷酸476到1476。
4. 權(quán)利要求
l的啟動(dòng)子，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸與以下多核 苷酸有至少70%的序列同一性a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸；b) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
5. 權(quán)利要求
l的啟動(dòng)子，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸與以下多核 苷酸雜交a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸；b) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
6. 包含權(quán)利要求
1的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
7. 權(quán)利要求
6的表達(dá)盒，其中所述第二多核苷酸賦予植物選自以下的 性狀提高的產(chǎn)量、在脅迫條件下提高的存活、提高的營養(yǎng)品質(zhì)、對植物 寄生線蟲的提高的抗性、改良的蛋白質(zhì)含量和改良的油含量。
8. 權(quán)利要求
7的表達(dá)盒，其中所述第二多核苷酸通過編碼如下物質(zhì)而賦予對植物寄生線蟲的提高的抗性a) 破壞植物寄生線蟲代謝、生長或生殖的物質(zhì)，b) 對植物寄生線蟲有毒的物質(zhì)。
9. 用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)盒包含與第二多核苷酸有效 連接的分離的啟動(dòng)子多核苷酸，其中a) 分離的啟動(dòng)子多核苷酸選自i) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸1到1476的多核苷酸；ii) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸；iii) 與i)或ii)的多核苷酸有至少70%序列同一性的多核苷酸；iv) 在嚴(yán)格條件下與i)或ii)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和v) 包含SEQ ID NO:l的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、或至少100個(gè)連續(xù)核 苷酸、或至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的多核苷酸；并且b) 分離的啟動(dòng)子多肽能夠介導(dǎo)根優(yōu)選的或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。
10. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述植物是單子葉植物。
11. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
12. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述植物選自玉米、小麥、大麥、高粱、 黑麥、黑小麥、稻、甘蔗、柑桔樹、菠蘿、椰子、香蕉、咖啡、茶、煙草、 向曰葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、芹菜、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、 茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、蕓苔、甜菜、巻心菜、花椰菜、綠花椰 菜、萵苣、百樂財(cái)艮屬物種(Lotussp.)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、多 年生草、黑麥草和擬南芥。
13. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸包含SEQID N():l的核苷酸l到1476。
14. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸包含SEQID NO:l的核苷酸476到1476。
15. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸與以下多核 苷酸有至少70%的序列同一性a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸，或b) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
16. 權(quán)利要求
9的植物，其中所述分離的啟動(dòng)子多核苷酸與以下多核 苷酸雜交a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸，或b) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
17. 賦予或提高植物中線蟲抗性的方法，其包括步驟a) 制備如權(quán)利要求
6所述的表達(dá)盒；b) 用步驟a)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；c) 再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，和d) 選擇與不含有所述表達(dá)盒的具有相同基因型的植物相比具有提高 的線蟲抗性的;f直物。
18. 權(quán)利要求
17的方法，其中所述有效連接的第二多核苷酸通過編碼 如下物質(zhì)而提高植物對植物寄生線蟲的抗性a) 破壞植物寄生線蟲的代謝、生長或生殖的物質(zhì)，b) 對植物寄生線蟲有毒的物質(zhì)。
專利摘要
本發(fā)明提供了根特異和/或由寄生線蟲誘導(dǎo)的啟動(dòng)子多核苷酸。本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于控制植物根中目的核酸的表達(dá)。
文檔編號C12N15/29GKCN101589144SQ200880002577
公開日2009年11月25日 申請日期2008年2月4日
發(fā)明者A·威格, R·阿申齊, R-G·甄, S·喬杜里, Y·韓, 翔 黃 申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan