專利名稱:一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種丁酸梭狀芽孢桿菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，是梭狀芽孢桿菌屬的一個種，主要存在于奶酪、天然酸奶、動物的糞便、某些土壤等環(huán)境中。一直以來，丁酸梭菌作為具有強烈整腸作用的益生菌制劑，被廣泛用于以改善腹部癥狀為目的的醫(yī)藥品及飼料中。同時，由于丁酸梭菌能激活免疫系統(tǒng)，也有人將其作為抗腫瘤免疫激活劑使用。此外，丁酸梭菌還可以當(dāng)作微生物肥料使用，能起到促長、防病的作用。
作為微生態(tài)制劑，丁酸梭菌特點和作用機理是1)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進腸道內(nèi)有益菌群的增殖和發(fā)育，抑制有害菌的生長繁殖，降低有毒物質(zhì)在腸道內(nèi)的積累。2)丁酸梭菌能激活免疫系統(tǒng)，促進免疫功能，預(yù)防腫瘤的發(fā)生。3)在腸道內(nèi)產(chǎn)生多種有益產(chǎn)物，如維生素B、維生素K、淀粉酶等，具有良好的保健作用。主要代謝產(chǎn)物丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營養(yǎng)物質(zhì)。4)丁酸梭菌是厭氧芽孢桿菌，產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，能耐酸、耐熱、耐膽汁，耐多種抗牛素，在體內(nèi)不受胃酸、膽汁酸等影響，因而通過消化道不失活，在體外室溫下可穩(wěn)定保藏。
下述專利US5.292 523(1994)、US4.892 731(1990)、JP63-146825(1986)、JP61-6625(1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)、CN1144873C、CN1184308C涉及丁酸梭菌活菌劑的制備和用途，這些專利中存在下述狀況1、丁酸梭菌種的培養(yǎng)均是采用厭氧培養(yǎng)罐或通過持續(xù)通入二氧化碳或氮氣維持其厭氧環(huán)境來進行，原料不能重復(fù)使用，操作較復(fù)雜，成本較高；2、培養(yǎng)基主要采用的氮源為牛肉膏、蛋白胨、或酵母膏及其酶解產(chǎn)物，成本較高；3、所得到的發(fā)酵菌數(shù)為10-15×108cfu/ml菌液；4、培養(yǎng)物是以芽孢形成率為成熟指標(biāo)，而不是以更能反映產(chǎn)品質(zhì)量的芽孢形成率加上芽孢成熟脫落率為成熟指標(biāo)，使產(chǎn)品質(zhì)量受到一定影響。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服上述不足而提供一種生產(chǎn)成本低廉，操作簡單，活菌數(shù)較高，且產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定的丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是所述一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法，包括下述步驟1)、準(zhǔn)備培養(yǎng)基；2)、溶解上罐的培養(yǎng)基，裝上pH電極并調(diào)整pH值，然后將培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中；3)、對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌；4)、接種丁酸梭菌種子在發(fā)酵罐降溫后加入無機鹽溶液，然后加入液體石蠟及接入丁酸梭菌種子；5)、控溫發(fā)酵控制pH值，在保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵；6)、芽孢完全脫落后放罐并測定發(fā)酵液菌數(shù)；7)、用植物纖維粉吸附發(fā)酵液，經(jīng)干燥后粉碎，即獲得粉狀制劑。
本發(fā)明的技術(shù)效果是1、直接利用普通通氣和攪拌發(fā)酵罐即可進行生產(chǎn)，且操作簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、能耗小、成本低。
2、無需通入二氧化碳、氮氣等氣體隔絕空氣，用于隔絕空氣的液體石蠟等液體可以反復(fù)多次利用。其他專利要么用厭氧罐、要么通二氧化碳、氮氣等氣體隔絕空氣。
3、添加無機鹽，顯著提高芽孢成熟率，使芽孢成熟率接近100％，產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定?，F(xiàn)有技術(shù)僅指出以形成梭狀芽孢為特征的芽孢形成率高于90％，未指出芽孢是否完全成熟。
4、發(fā)酵液菌數(shù)達到15～20億個/ml菌液，而現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)酵液菌數(shù)約為10-15億個/ml菌液。
5、后處理過程中以植物纖維粉如玉米芯粉、麩皮粉、稻草粉等直接吸附菌液后晾干(發(fā)酵液粘性較強)，與現(xiàn)有技術(shù)所用離心機處理相比，本發(fā)明則降低了成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
本發(fā)明的更進一步的技術(shù)方案是上述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為100-121℃，時間為10-30分鐘；所述的接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至35-45℃后先加入無機鹽合計0.7-1.5g/1000ml基料，無機鹽選自MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O及CaCl2兩種或三種，為避免形成沉淀，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟厚度為1-2cm，接入丁酸梭菌液體種子為5-20ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45-70小時。
上述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為115℃，時間為20分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至38℃后先加入無機鹽合計1.1g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三種，然后加入液體石蠟厚度為1.5cm，接入丁酸梭菌液體種子為10ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.4，在38℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵60小時。
上述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為100℃，時間為30分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至35℃后先加入無機鹽合計0.7g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O和CaCl2兩種，然后加入液體石蠟厚度為1cm，接入丁酸梭菌液體種子為5ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.0，在30℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵70小時。
上述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為121℃，時間為10分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至45℃后先加入無機鹽合計1.5g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三種，然后加入液體石蠟厚度為2cm，接入丁酸梭菌液體種子為20ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值7.5，在42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45小時。
上述的用于吸附發(fā)酵液的植物纖維粉選自植物莖桿粉，或谷糠粉，麩皮，玉米芯粉，或其組合，優(yōu)選麩皮粉；所述的植物莖桿選自麥子、稻子、高梁、玉米莖桿，優(yōu)選稻桿。
本發(fā)明的發(fā)酵液其取樣計菌數(shù)為15-25億個/ml菌液。
為了進一步降低生產(chǎn)成本，以大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕作為主要氮源，比現(xiàn)有技術(shù)用大豆粉或其酶解產(chǎn)物作為主要氮源更經(jīng)濟，且是充分利用自然資源，因此，本發(fā)明方法中所用的培養(yǎng)基可以是常規(guī)的培養(yǎng)基，優(yōu)選的培養(yǎng)基所包括的原料及重量份為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3、K2HPO41-3，原料當(dāng)以克計、蒸餾水相應(yīng)以ml計的份數(shù)為800-1000。
上述培養(yǎng)基的原料及重量選為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕40g，玉米淀粉6g，葡萄糖18g，酵母浸膏粉1g，胰蛋白胨3g，牛肉浸膏0.3g，NaHCO31g、K2HPO41g，蒸餾水800ml。
上述培養(yǎng)基的原料及重量選為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g，K2HPO43g，蒸餾水1000ml。
上述培養(yǎng)基的優(yōu)選方案其原料及重量為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO31.5g，K2HPO42g，CaCl22克，蒸餾水900ml。
本發(fā)明丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法所述的在發(fā)酵罐中接入的丁酸梭菌菌種，可以是公知的任何丁酸梭菌菌種。
具體實施方式實施例1本發(fā)明一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法1、準(zhǔn)備培養(yǎng)基下述培養(yǎng)基為優(yōu)選的一種培養(yǎng)基，但不限于這種培養(yǎng)基，其原料及重量份為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3，K2HPO41-3，原料當(dāng)以克計、蒸餾水相應(yīng)以ml計的份數(shù)為800-1000；具體配料是大豆餅粉45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO31.5g，K2HPO42g，CaCO32g，蒸餾水900ml；2、按常規(guī)對培養(yǎng)罐及過濾器、取樣器等設(shè)備、工具進行消毒殺菌，校正pH電極，溶解上罐的培養(yǎng)基，裝上pH電極，調(diào)整pH值，然后將培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中；溶解過程中培養(yǎng)基的pH值在7.0-7.5范圍內(nèi)調(diào)整，本例調(diào)整pH值為7.2；3、對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌；滅菌的溫度在100-121℃、時間為10-30分鐘范圍內(nèi)調(diào)，本例培養(yǎng)基加溫到115℃滅菌，保持時間為20分鐘；
4、接種丁酸梭菌種子在發(fā)酵罐降溫至35-45℃后，先加入滅菌無機鹽溶液合計0.7-1.5g/1000mL基料，無機鹽選自MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2兩種或三種；為避免形成沉淀，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟厚度為1-2cm，接入丁酸梭菌液體種子為5-20ml/1000ml；具體是在發(fā)酵罐降溫至38℃后，加入三種無機鹽合計1.1g/1000ml基料，加入秩序是先加入MgSO4·7H2O 0.7g/1000ml基料，MnSO4·H2O 0.2g/1000ml基料，攪均后再加入CaCl20.2g/1000ml基料，為避免形成沉淀，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟，厚度為1.5cm，再接入丁酸梭菌液體種子為10ml/1000ml基料，選用的丁酸梭菌菌種保藏編號為CCAM 080040，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，位于中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)，保藏時間為2005年9月20日，(相同的另一份丁酸梭菌保藏在同一城區(qū)的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室)，但不限于該保藏編號的丁酸梭菌菌種；5、控溫發(fā)酵控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45-70小時，具體控制pH值6.4，在38℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵60小時；6、芽孢完全脫落后放罐并測定發(fā)酵液菌數(shù)，取樣所測菌數(shù)能實現(xiàn)15-25億個/ml菌液，本例發(fā)酵液取樣計菌數(shù)為20億個/ml菌液；7、用植物纖維粉吸附發(fā)酵液，經(jīng)干燥后粉碎即獲得粉狀制劑；用于吸附發(fā)酵液的植物纖維粉選自植物莖桿粉，選自麥子、稻子、高梁、玉米莖桿粉，或谷糠粉，麩皮粉，玉米芯粉，或其組合；本例用于吸附發(fā)酵液的原料選自麥子的麩皮粉。
本實施例丁酸梭菌活菌劑芽孢形成率達到100％，芽孢成熟率接近100％。
實施例2與上述實施例1不同的是1、準(zhǔn)備培養(yǎng)基大豆餅粉40克，玉米淀粉6克，葡萄糖18克，酵母浸膏粉1克，胰蛋白胨3克，牛肉浸膏0.3克，NaHCO31克，K2HPO41克，蒸餾水800ml；2、溶解過程中培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.1；3、對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為100℃，時間為30分鐘；4、接種丁酸梭菌種子在發(fā)酵罐降溫至35℃后先加入無機鹽合計0.7g/1000mL基料，無機鹽選自MgSO4·7H2O及CaCl2兩種，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟厚度為1cm，接入丁酸梭菌液體種子為5ml/1000ml基料，選用的丁酸梭菌菌種保藏編號為CCAM 080039，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，位于中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)，保藏時間為2005年9月20日，但不限于該保藏編號的丁酸梭菌菌種；5、控溫發(fā)酵控制pH值6.0，在30℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵70小時；6、對發(fā)酵液取樣計菌數(shù)為15億個/ml菌液；7、用于吸附發(fā)酵液的原料選自稻草粉。
實施例3與上述實施例1不同的是1、準(zhǔn)備培養(yǎng)基大豆餅粉50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g，K2HPO43g，蒸餾水1000ml；2、溶解過程中培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.4；3、對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為121℃，時間為10分鐘；4、接種丁酸梭菌種子在發(fā)酵罐降溫至45℃后，先加入無機鹽合計1.5g/1000ml，無機鹽為MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三種，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟厚度為2.0cm，接入丁酸梭菌液體種子為20ml/1000ml，選用的丁酸梭菌菌種保藏編號為CCAM 080040，但不限于該保藏編號的丁酸梭菌菌種；5、控溫發(fā)酵控制pH值7.5，在42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45小時；6、對發(fā)酵液取樣計菌數(shù)為25億個/ml菌液；7、用于吸附發(fā)酵液的原料選自稻草粉。
上述實施例中的培養(yǎng)基若選為現(xiàn)有技術(shù)所用的大豆粉作主要原料，也是可行的，但效果沒有上述大豆餅粉好，且加大了原料成本。
本發(fā)明保護范圍不局限于上述實施例。
權(quán)利要求
1.一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于，它包括下述步驟1)、準(zhǔn)備培養(yǎng)基；2)、溶解上罐的培養(yǎng)基，裝上pH電極并調(diào)整pH值，然后將培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中；3)、對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌；4)、接種丁酸梭菌種子；在發(fā)酵罐降溫后加入無機鹽溶液，然后加入液體石蠟及接入丁酸梭菌種子；5)、控溫發(fā)酵控制pH值，在保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵；6)、芽孢完全脫落后放罐并測定發(fā)酵液菌數(shù)；7)、用植物纖維粉吸附發(fā)酵液，經(jīng)于燥后粉碎，即獲得粉狀制劑。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為100-121℃，時間為10-30分鐘；所述的接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至35-45℃后先加入無機鹽合計0.7-1.5g/1000ml基料，無機鹽選自MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O及CaCl2兩種或三種，為避免形成沉淀，在加入過程中攪拌均勻，然后加入液體石蠟厚度為2cm，接入丁酸梭菌液體種子為5-20ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.0-7.5，在30-42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45-70小時。
3.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為115℃，時間為20分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至38℃后先加入無機鹽合計1.1g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三種，然后加入液體石蠟厚度為1.5cm，接入丁酸梭菌液體種子為10ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.4，在38℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵60小時。
4.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為100℃，時間為30分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至35℃后先加入無機鹽合計0.7g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O和CaCl2兩種，然后加入液體石蠟厚度為1cm，接入丁酸梭菌液體種子為5ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值6.0，在30℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵70小時。
5.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌的溫度為121℃，時間為10分鐘；接種丁酸梭菌種子是在發(fā)酵罐降溫至45℃后先加入無機鹽合計1.5g/1000ml基料，無機鹽選為MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O及CaCl2共三種，然后加入液體石蠟厚度為2cm，接入丁酸梭菌液體種子為20ml/1000ml基料；所述的控溫發(fā)酵是控制pH值7.5，在42℃保溫的的狀態(tài)下發(fā)酵45小時。
6.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的用于吸附發(fā)酵液的植物纖維粉選自植物莖桿粉，或谷糠粉，麩皮粉，玉米芯粉，或其組合，優(yōu)選麩皮粉；所述的植物莖桿選自麥子、稻子、高梁、玉米莖桿。
7.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的丁酸梭菌的培養(yǎng)基包括的原料及重量份為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕40-50，玉米淀粉6-8，葡萄糖18-22，酵母浸膏粉1-3，胰蛋白胨3-6，牛肉浸膏0.3-1，NaHCO31-3，K2HPO41-3；原料當(dāng)以克計、蒸餾水相應(yīng)以ml計的份數(shù)為800-1000。
8.按照權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基的原料及重量選為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕40g，玉米淀粉6g，葡萄糖18g，酵母浸膏粉1g，胰蛋白胨3g，牛肉浸膏0.3g，NaHCO31g、 K2HPO41g，蒸餾水800ml。
9.按照權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基的原料及重量選為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕50g，玉米淀粉8g，葡萄糖22g，酵母浸膏粉3g，胰蛋白胨6g，牛肉浸膏1g，NaHCO33g ，K2HPO43g，蒸餾水1000ml。
10.按照權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，所包括的原料及重量為大豆餅粉、即發(fā)酵豆粕45g，玉米淀粉7g，葡萄糖20g，酵母浸膏粉2g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏0.5g，NaHCO3，1.5g，K2HPO42g，CaCl22克，蒸餾水900ml。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種丁酸梭菌活菌劑的生產(chǎn)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種丁酸梭狀芽孢桿菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法。它包括下述步驟準(zhǔn)備培養(yǎng)基；溶解上罐的培養(yǎng)基，調(diào)整pH值，裝入發(fā)酵罐中；對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加溫滅菌；接種丁酸梭菌種子；控溫發(fā)酵；放罐并測定發(fā)酵液菌數(shù)；用植物纖維粉吸附發(fā)酵液，經(jīng)干燥后粉碎，即獲得粉狀制劑。優(yōu)點是用普通發(fā)酵罐生產(chǎn)，操作簡單、效果穩(wěn)定、能耗??；芽孢成熟率高，產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定；不用離心機等處理，從而降低了成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號C12N1/20GK1995330SQ200610125586
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月26日
發(fā)明者謝樹貴, 趙述淼, 戴青, 梁運祥, 葛向陽, 陳正軍, 胡詠梅, 王績, 梅余霞, 田煥章 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan