專利名稱：甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物抗病性鑒定領域，具體是一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備。
背景技術：
甘鹿黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea syd)引起的一種真菌性病害，自1877年在南非的納塔爾地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)至今在全國的各個植蔗區(qū)均有此病發(fā)生的報道。此病是一種氣傳性病害，能夠導致蔗莖產(chǎn)量和蔗糖分的嚴重損失，隨著宿根年限的增加發(fā)病越來越嚴重，發(fā)病嚴重的品種和地塊發(fā)病率達到60%，因此病而淘汰了一批豐產(chǎn)高糖的甘蔗優(yōu)良品種。防治此病最有效最經(jīng)濟的方法是培育優(yōu)良的甘蔗新品種，而抗病性的鑒定是抗病育種的基礎和關鍵，鑒定的準確性和效率直接影響到抗病育種的進程和效果。
目前，國內(nèi)外還主要是通過鑒別寄主法對甘蔗進行抗黑穗病性鑒定，此法周期長，工作量大，耗資高，通常由實生苗育成新甘蔗品種的概率為1/100000，因此此法與甘蔗育種的大群體要求不相適用。隨著免疫學技術的發(fā)展成熟及其在動植物病原菌檢測上的成功應用，使得應用此方法檢測甘蔗黑穗病成為可能。該方法具有操作簡單，可同時檢測多個樣品等優(yōu)點，符合甘蔗育種過程中大群體篩選的需求。但是，目前還未見有甘蔗黑穗病抗體制備的報道。因此，制備甘蔗黑穗病病原菌抗體并結合針刺接種技術，可在甘蔗實生苗期進行批量的篩選，提高篩選效率，縮短甘蔗抗黑穗病育種年限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了克服已有對甘蔗進行抗黑穗病性鑒定的鑒別寄主法的周期長，工作量大，耗資高，提供一種具有純度高，特異性好，效價高，保存長久，對甘蔗通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病和人工接種提高甘蔗抗黑穗病育種效率的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備。本發(fā)明通過下述的技術方案來實現(xiàn)一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制備抗原，將抗原在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得到多克隆抗體，主要包括以下步驟(I)抗原采集和制備在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制備抗原(真菌孢子，菌絲體胞外多糖或上清液)備用；(2)抗原免疫培養(yǎng)將獲得的抗原與等量的福氏完全佐劑混合，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；第15天，取Iml抗原加入等量福氏不完全佐劑，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；每隔2周，按照所述的劑量和方法多次免疫白兔，在第八周測定效價達到要求后，頸動脈取血備用；(3)分離純化將步驟(2)獲得的抗血清進行分離純化，獲得甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體。
以上所述的抗原采集和制備，主要步驟是(I)從甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，將白色薄膜去除后，將黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮紙袋中，然后于45°c中烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中備用；(2)將真菌孢子用無菌水按50-100個孢子/ml稀釋，涂布于含有50ng/ml鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，獲取單菌落后，挑取少許菌絲體到含有50ng/ml鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；(3)上清液抗原的制備量取適量步驟(2)的培養(yǎng)液，于冷凍離心機中4°C，4000r/min,5min離心，取上層清液作為抗原，放入_20°C冰箱中保存，備用；(4)菌絲體胞外多糖抗原的制備量取適量步驟(2)的培養(yǎng)液，于冷凍離心機中40C，4000r/min, 5min離心，吸取上清液，加入2倍體積的95%的乙醇，用滅菌的玻璃棒攪起絲狀沉淀物，再于冷凍離心機中4°C，4000r/min，IOmin離心，倒掉上清液后，用85%的乙醇 洗滌沉淀兩次，此沉淀物即為胞外多糖，室溫干燥乙醇揮發(fā)完全后，加入5ml的PBS后即為胞外多糖抗原，放入_20°C冰箱中保存，備用。以上所述的抗原免疫培養(yǎng)和分離純化，主要步驟是(I)用PBS將真菌孢子稀釋為2*108個/ml，分裝后凍存于_20°C冰箱；(2)第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐劑，乳化，將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點注射，免疫兩只新西蘭白兔；(3)兩周后，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑，乳化，將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點注射，免疫兩只新西蘭白兔；(4)每隔2周，按照步驟(3)所述的方法檢驗；( 5 )測定效價合格后，頸動脈取血；(6)兔血在4°C放置過夜，于4°C，10000rpmr/min冷凍離心機中離心30min，收集上清液。以上所述的多點注射是在頸背部皮下注射8-10點。以上所述的多克隆抗體應用于甘蔗抗黑穗病品種的育種。發(fā)明的優(yōu)點及其積極效果本發(fā)明首次提出了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其優(yōu)點在于特異性高，效價高，保存長久。應用此多克隆抗體結合針刺接種技術對甘蔗實生苗進行黑穗病抗性檢測較傳統(tǒng)的鑒別寄主法具有省時省力，節(jié)約物資，操作簡單及不受過多的外界環(huán)境干擾等優(yōu)點。對甘蔗科研中通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病具有重要意義，結合人工接種技術能提高甘蔗抗黑穗病育種效率，可在甘蔗五圃制選育程序的前期階段淘汰感病品系，提高抗黑穗病品系在所選育的甘蔗優(yōu)良品系中的比例，因此可用于甘蔗抗黑穗病品種的選育。
具體實施例方式通過下面的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。實施例一I、黑穗病病原菌的獲得和孢子抗原制備在黑穗病高發(fā)的7-8月份，從甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，將白色薄膜去除后，將黑穗病孢子粉收集到牛皮紙袋中，然后于45°C中烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中。將孢子用無菌水稀釋后(約50-100個孢子/ml)涂布于含有50ng/ml鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，獲取單菌落，將單菌落繼續(xù)培養(yǎng)獲取孢子粉，收集后于45°C烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中，此即黑穗病孢子抗原。2、多克隆抗體制備的免疫流程用PBS將真菌孢子稀釋為2*108個/ml，分裝后凍存于_20°C冰箱。第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐劑(Sigma公司，貨號F5881),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第15天,取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第29天，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506)，乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理 鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第43天,取取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第53天，測定效價合格后頸動脈取血。兔血在4°C放置過夜，于冷凍離心機中離心(4°C，10000r/min)30min，收集上清液，此即所獲得的以甘蔗黑穗病病原菌孢子為抗原的多克隆抗體。最終獲得多克隆抗體的量新西蘭白兔I為48ml ;新西蘭白兔2為45. 5ml。3、所獲得多克隆抗體免疫效果的Elisa檢查(I)孢子處理降黑穗病孢子用PBS (Ιχ,ρΗ 7. 2)緩沖液重懸，然后用超聲波儀進行超聲裂解。(2)包被超聲裂解的孢子用包被液(CBS, IX)稀釋成1*108個/ml，100 μ I/孔加至酶標板，于4°C冰箱中過夜。(注抗原包被液配制稱取Na2CO3 I. 59g, NaHCO3 2. 93g，滅菌的去離子水950ml，調(diào)節(jié)pH值至9. 6，加去離子水定容至1000ml，4°C保存)。(3)第二天用吹風機吹干后，每孔加入5%的戊二醛溶液lOOul，在室溫下固定60mino(4)封閉將固定液棄去，每孔加入200μ I封閉液(5g脫脂奶粉，溶解于100ml PBS中，混勻后于4°C中保存?zhèn)溆茫灰顺^3天)，37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置1.5h。(5)加入樣本棄去封閉液，將所獲得的多克隆抗體分別稀釋1250倍，2500倍，5000倍，10000倍，20000倍，40000倍和80000倍，以每個樣品100 μ I的量加入酶標板中，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中放置Ih。(6)洗滌用自來水沖洗10次，在吸水紙上拍干。(7)加入二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔用封閉液稀釋至工作濃度，每孔100 μ I加入酶標板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置30min。(8)洗滌用ddH20沖洗10次，在吸水紙上拍干。(9)加入TMB顯示底物每孔100 μ I加入酶標板,37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置15min。TMB顯色液的配置為①TMB儲存液稱取TMB粉末，用DMSO配成I. 5mg/ml的儲存液，_20°C分裝保存；
②NaAc緩沖液配制200mM的NaAc溶液，用HAc調(diào)節(jié)pH值至5. 3 ；③H2O2溶液配制O. 03%的H2O2溶液；④使用時按照TMB儲存液=NaAc緩沖液=H2O2溶液=1:4:5的比例配制顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用。(10)加入終止液每孔加入2M的H2SO4溶液50 μ I。(11)讀數(shù)在酶標儀上于450nm波長處測得其OD值。表I甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的Elisa檢測結果
權利要求
1.一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制備抗原，將抗原在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得到多克隆抗體，主要包括以下步驟 (1)抗原采集和制備在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制備抗原(真菌孢子，菌絲體胞外多糖或上清液)備用； (2)抗原免疫培養(yǎng)將獲得的抗原與等量的福氏完全佐劑混合，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；第15天，取I ml抗原加入等量福氏不完全佐劑，乳化，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫新西蘭白兔；每隔2周，按照所述的劑量和方法多次免疫白兔，在第八周測定效價達到要求后，頸動脈取血備用； (2)分離純化將步驟(2)獲得的抗血清進行分離純化，獲得目標多克隆抗體。
2.如權利要求I所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于所述的抗原采集和制備，主要步驟是 (1)從甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，將白色薄膜去除后，將黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮紙袋中，然后于45°C中烘干I h，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中備用； (2)將真菌孢子用無菌水按50-100個孢子/ml稀釋，涂布于含有50ng/ml鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，獲取單菌落后，挑取少許菌絲體到含有50 ng/ml鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天； (3)上清液抗原的制備量取適量步驟(2)的培養(yǎng)液，于冷凍離心機中4°C，4000r/min，5 min離心，取上層清液作為抗原，放入-20°C冰箱中保存，備用； (4)菌絲體胞外多糖抗原的制備量取適量步驟(2)的培養(yǎng)液，于冷凍離心機中4°C，4000 r/min，5 min離心，吸取上清液，加入2倍體積的95 %的乙醇，用滅菌的玻璃棒攪起絲狀沉淀物，再于冷凍離心機中4°C，4000 r/min, 10 min離心，倒掉上清液后，用85%的乙醇洗滌沉淀兩次，此沉淀物即為胞外多糖，室溫干燥乙醇揮發(fā)完全后，加入5 ml的PBS后即為胞外多糖抗原，放入_20°C冰箱中保存，備用。
3.如權利要求I所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于所述的抗原免疫培養(yǎng)和分離純化，主要步驟是 (1)用PBS將真菌孢子稀釋為2*108個/ml，分裝后凍存于_20°C冰箱； (2)第I天，取Iml抗原加入I ml福氏完全佐劑，乳化，將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔； (3)兩周后,取Iml抗原加入I ml福氏不完全佐劑,乳化,將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔； (4)每隔2周，按照步驟(3)所述的方法檢驗； (5)測定效價合格后，頸動脈取血； (6)兔血在4°C放置過夜，于4°C，10000r/min冷凍離心機中離心30 min，收集上清液。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，本發(fā)明采用的抗原為從甘蔗大田采集的成熟黑穗病病原菌孢子，經(jīng)處理后在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得，其步驟包括(1)黑穗病病原菌孢子的采集處理，制備抗原；(2)取等量抗原(真菌孢子、菌絲體胞外多糖或上清液)分別與福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑混合，乳化，頸背部皮下多點注射免疫新西蘭白兔；(3)每兩個星期免疫一次，共免疫四次，第八個星期后，頸動脈采血；(4)分離抗血清并純化，獲得目標多克隆抗體。本發(fā)明制備的多克隆抗體具有純度高，特異性好，效價高，保存長久等優(yōu)點，對甘蔗科研中通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病具有重要意義，結合人工接種技術能提高甘蔗抗黑穗病育種效率。
文檔編號C07K16/14GK102911269SQ20121047439
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權日2012年11月21日
發(fā)明者楊麗濤, 宋修鵬, 李楊瑞 申請人:廣西大學