一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素，是酸性粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。近年來研宄證明肝素還有降血脂作用，多年來，國際市場(chǎng)對(duì)肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是從動(dòng)物內(nèi)臟中提取加工而得的，產(chǎn)量受到一定限制，時(shí)常滿足不了市場(chǎng)需求。自20世紀(jì)90年代后期開始，全球市場(chǎng)肝素需求大幅增加，我國肝素生產(chǎn)和出口連年均以較大幅度上升，出口量和出口金額呈快速增長態(tài)勢(shì)。中國已成為世界上首屈一指的肝素原料藥出口大國。2001年，全國肝素產(chǎn)品出口金額為4460萬美元。2002年，出口金額達(dá)5894萬美元，比上年增長了 32.17 %。肝素產(chǎn)品在我國醫(yī)藥類產(chǎn)品出口金額排序中已躋身前5位，僅次于維生素C、檸檬酸、維生素E和磺胺。
[0003]我國生產(chǎn)的肝素產(chǎn)品除滿足國內(nèi)市場(chǎng)外，還大量出口。長期以來，我國產(chǎn)品出口順暢，只要質(zhì)量達(dá)到要求，常常有多少就出口多少。與之形成對(duì)比的是，由于我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r和人民生活水平的限制，，對(duì)這種昂貴(注射用精品8?10美元/mega，口服用為7?8美元/mega)的抗凝血藥目前國內(nèi)消費(fèi)量極小，主要是創(chuàng)匯，銷往日本、美國、歐洲等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)。
[0004]目前，國內(nèi)生產(chǎn)肝素的方法，主要是鹽解法和酸解法，比如公開號(hào)為CN101735340A、CN101649008A、CN101519459A等等的中國發(fā)明申請(qǐng)，這兩種方法都是采用豬小腸粘膜為原料，在堿性條件下通過鹽解、酶解，出去部分蛋白質(zhì)后，通過三甲胺季銨性強(qiáng)堿性陽離子交換樹脂吸附劑洗脫，在洗脫液中加以乙醇沉淀既得肝素鈉初級(jí)原料出售，其缺點(diǎn)是生產(chǎn)周期長達(dá)48h，反應(yīng)溫度為95-100°C，能源消耗大，水解不完全，收率低，生產(chǎn)I億國際單位(IU)肝素粗品需2800-3000根豬小腸粘膜，所得產(chǎn)品純度低，粗品含肝素至多為80效價(jià)/毫克；并產(chǎn)生大量的肥腸渣和廢水，污染環(huán)境；且生產(chǎn)過程中樹脂再生困難，這種制備方法由于生產(chǎn)周期長，水解不完全、不徹底，制得的肝素鈉純度低、收率低、效價(jià)低，很難進(jìn)行規(guī)模性生產(chǎn)，且不能滿足市場(chǎng)的大量需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種產(chǎn)品生產(chǎn)周期短、純度高、效價(jià)高、雜質(zhì)少、綠色環(huán)保的利用豬肺提取肝素粗品的生產(chǎn)方法，本工藝采用生物酶解法從原材料易得的豬肺中提取肝素粗品。
[0006]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟如下:(1)預(yù)處理:將豬肺清洗，去除內(nèi)外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分?jǐn)嚢柘?，加入水?dāng)嚢璧玫截i肺混合液，其中豬肺和水的質(zhì)量比為1:3-4 ；(2)酶解:調(diào)豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復(fù)合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應(yīng)30?60min后，保持反應(yīng)液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續(xù)升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調(diào)濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時(shí)加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續(xù)升溫至90?95°C，保溫反應(yīng)2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進(jìn)行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應(yīng)8?12h過濾，得濾液，將濾液調(diào)pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；
[6]冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內(nèi)，設(shè)定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時(shí)間2?4h。
[0007]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復(fù)合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
[0008]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
[0009]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(5)調(diào)pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:1、本發(fā)明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術(shù)穩(wěn)定了產(chǎn)品的質(zhì)量以及提高收率，同時(shí)獲得的粗品雜質(zhì)少、效價(jià)高；2、本發(fā)明生產(chǎn)方法中采用澄清劑來替代乙醇反復(fù)醇沉來去除蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)工藝，具有去除率高，節(jié)約了大量乙醇的使用量，降低了生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明工藝設(shè)計(jì)合理，生產(chǎn)無毒、無害、生物綠色環(huán)保，豬肺原料來源易得，運(yùn)營生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]
實(shí)施例1:一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟如下:(1)預(yù)處理:將豬肺5kg清洗，去除內(nèi)外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分?jǐn)嚢柘拢尤?5kg水?dāng)嚢璧玫截i肺混合液；(2)酶解:用氫氧化鈉調(diào)豬肺混合液pH值為6.5，加入75g的硫酸軟骨素A和C，攪拌均勻，升溫至30°C，保溫反應(yīng)30min后，保持反應(yīng)液的pH值為7.0，加入12.5g胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2h，繼續(xù)升溫到90°C，保持5min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調(diào)濾液PH值為8.5，攪拌升溫到55°C時(shí)加入5g的澄清劑，繼續(xù)升溫至90°C，保溫反應(yīng)2h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μπι濾膜進(jìn)行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為ΙΟ/kg,常溫反應(yīng)8h過濾，得濾液，將濾液用冰醋酸調(diào)pH至4.5，加入20kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內(nèi)，設(shè)定溫度-20°C，真空度0.05Mpa，干燥時(shí)間2h，既得肝素粗品20 g，其效價(jià)為每毫克100單位。
[0012]實(shí)施例2:—種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟如下:(1)預(yù)處理:將10kg豬肺清洗，去除內(nèi)外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分?jǐn)嚢柘?，加?50kg水?dāng)嚢璧玫截i肺混合液(2)酶解:用氫氧化鈉調(diào)豬肺混合液pH值為7.0，加入豬肺重量的2kg的硫酸軟骨素A和B，攪拌均勻，升溫至40°C，保溫反應(yīng)45min后，保持反應(yīng)液的pH值為7.0，加入0.3kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫3h，繼續(xù)升溫到95°C，保持7min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調(diào)濾液pH值為9.0，攪拌升溫到60°C時(shí)加入0.2kg的澄清劑，繼續(xù)升溫至93°C，保溫反應(yīng)3h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μ m濾膜進(jìn)行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為20g/kg，常溫反應(yīng)1h過濾，得濾液，將濾液用草酸調(diào)pH至5.0，加入350kg無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內(nèi)，設(shè)定溫度-10°C，真空度0.07Mpa，干燥時(shí)間3h，既得肝素粗品0.5kg,其效價(jià)為每毫克90單位。
[0013]實(shí)施例3:—種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟如下:(1)預(yù)處理:將100kg豬肺清洗，去除內(nèi)外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分?jǐn)嚢柘?，加?000kg水?dāng)嚢璧玫截i肺混合液(2)酶解:調(diào)豬肺混合液pH值為8.0，加入豬肺重量的25kg的硫酸軟骨素B和C，攪拌均勻，升溫至45°C，保溫反應(yīng)60min后，保持反應(yīng)液的pH值為7.5，加入5kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫4h，繼續(xù)升溫到100°C，保持lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調(diào)濾液pH值為10.5，攪拌升溫到65°C時(shí)加入4kg的澄清劑，繼續(xù)升溫至95°C，保溫反應(yīng)4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.4 μ m濾膜進(jìn)行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為30g/kg，常溫反應(yīng)12h過濾，得濾液，將濾液用檸檬酸調(diào)pH至5.5，加入4000kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內(nèi)，設(shè)定溫度0°c，真空度0.0SMpa,干燥時(shí)間4h，既得肝素粗品4.8kg，其效價(jià)為每毫克100單位。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟如下:(I)預(yù)處理:將豬肺清洗，去除內(nèi)外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分?jǐn)嚢柘拢尤胨當(dāng)嚢璧玫截i肺混合液，其中豬肺和水的質(zhì)量比為1:3-4 ；(2)酶解:調(diào)豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復(fù)合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應(yīng)30?60min后，保持反應(yīng)液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續(xù)升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調(diào)濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時(shí)加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續(xù)升溫至90?95°C，保溫反應(yīng)2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進(jìn)行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應(yīng)8?12h過濾，得濾液，將濾液調(diào)pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內(nèi)，設(shè)定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時(shí)間2?4h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復(fù)合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(5)調(diào)pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
【專利摘要】一種從豬肺中提取肝素的生產(chǎn)方法，步驟如下：將新鮮豬肺絞碎成漿液、漿液保溫酶解、酶解液過濾收集濾液、對(duì)濾液進(jìn)行除蛋白處理、超濾、氧化沉淀、冷凍干燥得肝素粗品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：1、本發(fā)明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術(shù)穩(wěn)定了產(chǎn)品的質(zhì)量以及提高收率，同時(shí)獲得的粗品雜質(zhì)少、效價(jià)高；2、本發(fā)明生產(chǎn)方法中采用澄清劑來替代乙醇反復(fù)醇沉來去除蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)工藝，具有去除率高，節(jié)約了大量乙醇的使用量，降低了生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明工藝設(shè)計(jì)合理，生產(chǎn)無毒、無害、生物綠色環(huán)保，豬肺原料來源易得，運(yùn)營生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號(hào)】CN104530262
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510036218
【發(fā)明人】郭慶, 徐賓朋, 趙厚發(fā)
【申請(qǐng)人】安徽科寶生物工程有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月26日