一種動(dòng)物組織長(zhǎng)片段dna的提取方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA的提取領(lǐng)域，尤其涉及一種克服了物種和組織樣品局限性的動(dòng)物長(zhǎng)片段DNA的提取方法，還涉及一種動(dòng)物組織長(zhǎng)片段DNA的提取試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]B1Nano公司推出了 Irys系統(tǒng)用于長(zhǎng)鏈DNA的單分子成像。該系統(tǒng)利用單酶酶切和熒光標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)達(dá)幾百kb的單鏈DNA分子進(jìn)行成像，利用高質(zhì)量圖像使基因組結(jié)構(gòu)通過酶切圖譜的方式展現(xiàn)無遺。Irys特有的超長(zhǎng)序列讀長(zhǎng)能夠輕松跨越重復(fù)片段和一些包含復(fù)雜元件的區(qū)域，在大大簡(jiǎn)化基因組組裝的同時(shí)也讓困擾NGS技術(shù)的拼接缺口無處遁形。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外已有多種提取DNA的方法，如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、鹽酸胍裂解法、鹽洗法等，但片段長(zhǎng)度都不能Irys系統(tǒng)的要求，最近B1Nano公司推出了一種試劑盒，采用將動(dòng)物組織進(jìn)行研磨、處理后，作為樣品進(jìn)行DNA提取，此種方法可以使DNA長(zhǎng)度達(dá)到10kb以上，但是由于研磨過程，容易破壞DNA，且此方法在物種方面及組織樣品的局限性比較大，如對(duì)于一些組織，如神經(jīng)組織，則不易獲取DNA，限制了 Irys系統(tǒng)的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的DNA提取方法受物種及組織樣品的局限性較大，從而無法有效實(shí)現(xiàn)動(dòng)物組織長(zhǎng)片段DNA的提取的問題。
[0005]因此，本發(fā)明提供了一種動(dòng)物長(zhǎng)片段DNA的提取方法，包括以下步驟:
[0006]I)通過酶消化法對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行消化，制得細(xì)胞懸液；
[0007]2)通過瓊脂糖包埋所述細(xì)胞懸液中的細(xì)胞，制成膠塊，然后在膠塊中進(jìn)行蛋白酶K消化及RNase酶消化；
[0008]3)將消化后清洗好的膠塊進(jìn)行溶膠、透析，制得長(zhǎng)片段DNA。
[0009]在上述技術(shù)方案中，酶消化法，是通過酶消化液把已剪成小塊的組織進(jìn)一步松散，直接獲得細(xì)胞的方法，此方法的細(xì)胞產(chǎn)量高，便于后續(xù)的DNA提取，同時(shí)可以避免研磨造成細(xì)胞破碎，DNA提前釋放。通過將動(dòng)物組織利用酶處理技術(shù)消化成細(xì)胞，可克服物種及組織樣品的局限性，對(duì)于一些組織，如神經(jīng)組織，通過研磨不易獲取DNA，將組織消化成細(xì)胞可更好的獲取DNA ;后續(xù)對(duì)細(xì)胞利用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行包埋處理，減少了 DNA提取過程中的機(jī)械損傷，更好的保證了 DNA的完整。利用本發(fā)明的動(dòng)物組織長(zhǎng)片段DNA的提取方法提取的DNA長(zhǎng)度可達(dá)2MB以上，能夠很好地滿足Irys系統(tǒng)的要求。本發(fā)明中提到的“動(dòng)物”是一個(gè)廣泛的概念，既包括人，還包括其他動(dòng)物。
[0010]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟I)中:若所述動(dòng)物組織為肝組織，則通過胰酶對(duì)肝組織進(jìn)行消化；若所述動(dòng)物組織為非肝組織，則通過膠原酶I和膠原酶IV對(duì)非肝組織進(jìn)行消化。所述非肝組織即除肝組織以外的其他動(dòng)物組織，包括腦、肌肉等。
[0011]在上述技術(shù)方案中，膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。膠原酶分為多種類型，其中，膠原酶I用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。膠原酶IV包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不，它能消化多種組織。試驗(yàn)表明，膠原酶I和膠原酶IV結(jié)合使用，能夠消化動(dòng)物的多種組織，消化效果頗佳，解決了組織和酶的類別對(duì)細(xì)胞消化的限制，使得動(dòng)物組織消化更為簡(jiǎn)單、便捷。肝組織消化可采用多種酶，如胰酶、膠原酶IV等，由于胰酶對(duì)肝組織消化效果較好，在此對(duì)動(dòng)物肝臟組織進(jìn)行消化時(shí)，優(yōu)選胰酶。
[0012]作為對(duì)上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述胰酶的消化體積百分比濃度為0.125?0.25 %，所述膠原酶I的消化濃度為0.7?1.3mg/mL，所述膠原酶IV的消化濃度為
0.3?0.7mg/mL。此處的消化體積百分比濃度為酶的最終反應(yīng)體積百分比濃度，消化濃度是指酶的最終反應(yīng)濃度。
[0013]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟I)為:制備動(dòng)物組織勻漿；向所述組織勻漿中加入酶對(duì)組織進(jìn)行消化，直至組織塊變?yōu)槿彳浀男鯛?，鏡檢可觀察到較多的分散細(xì)胞；過濾消化好的組織勻漿，離心過濾液，棄上清液，洗滌沉淀，加入緩沖液制備細(xì)胞懸液。所述緩沖液優(yōu)選為PBS緩沖液。
[0014]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟I)的具體步驟如下:
[0015]al.將0.8?1.5g動(dòng)物組織在已消毒的培養(yǎng)皿中用剪刀充分剪碎，加入0.5?
1.5mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)一步剪碎；
[0016]a2.將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到15mL的離心管中，再向培養(yǎng)皿中加入0.5?1.5mL的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗剪刀及培養(yǎng)皿，并收入離心管中，用細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)充體積至原體積的4?5倍，上下顛倒混勻，制得組織勻漿；
[0017]a3.向制得的的組織勻漿中加入的膠原酶I至終濃度為0.7?1.3mg/mL及膠原酶IV至其終濃度為0.3?0.7mg/mL，若為肝組織，則僅需加入胰酶至其最終體積百分比濃度為0.125?0.25%，置于37°C溫度下，水平放置1.5?3h，直至組織塊變?yōu)槿彳浀男鯛睿?br>[0018]a4.取少量的組織消化液進(jìn)行鏡檢，可以看到較多的分散細(xì)胞；
[0019]a5.將消化好的組織勻漿過70 μm的過濾器，同時(shí)用注射器的活塞進(jìn)行輕微的研磨，過濾至培養(yǎng)皿中；
[0020]a6.將過濾液分裝到離心管中，500g離心5?lOmin，棄上清液，將沉淀用IxPBS懸浮，洗滌，500g離心5?lOmin，重復(fù)2?3次，加入適量PBS，制得細(xì)胞懸液，待包埋。
[0021]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)為:將低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠溶液與細(xì)胞懸液混合，并將制得的混合液加入成膠模具中進(jìn)行凝固，制得膠塊；將膠塊轉(zhuǎn)移至蛋白酶K消化液中，確保膠塊完全浸沒，45?55°C加熱1.5?3h，每隔一段時(shí)間混勻一次，然后清洗膠塊；將膠塊轉(zhuǎn)移至RNase酶消化液中，35?40°C消化I?2h，每隔一段時(shí)間混勻一次，然后清洗膠塊。
[0022]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)中:所述蛋白酶K消化是在蛋白酶K消化液中進(jìn)行的，所述RNase酶消化是在RNase酶消化液中進(jìn)行的，所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K與裂解緩沖液混合而成，其中，蛋白酶K的濃度為1.0?1.5mg/mL ；RNase酶消化液由RNase酶和TE緩沖液混合而成，其中，RNase酶的濃度為0.15?0.25mg/mL。
[0023]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)中:所述蛋白酶K消化的溫度為50°C，消化時(shí)間為1.5?3h ;所述RNase酶消化的溫度為37°C，消化時(shí)間為I?2h。
[0024]作為對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)的具體步驟如下:
[0025]bl.將450?550 μ L質(zhì)量百分比濃度為1.5?3%的低熔點(diǎn)瓊脂糖置于65?75°C的溫度下加熱，直到低熔點(diǎn)瓊脂糖完全融化，將溶解后的低熔點(diǎn)瓊脂糖轉(zhuǎn)移至40?45°C的溫度下平衡至少lOmin，將細(xì)胞懸液放置在40?45°C的溫度下加熱至多1min ；
[0026]b2.將40?50 μ L低熔點(diǎn)瓊脂糖快速加入到70?80 μ L的細(xì)胞懸浮液中，用槍頭快速吸取90%的體積進(jìn)行上下吹打，避免氣泡產(chǎn)生，吸取細(xì)胞與膠的混合物90?100 μ L，快速添滿成膠模具，接著將成膠模具置于冰上凝固，制得膠塊；
[0027]b3.轉(zhuǎn)移膠塊到含有蛋白酶K消化液的離心管中，確保膠塊完全浸沒，其中，蛋白酶K消化液由150?170 μ L的濃度為20mg/mL的蛋白酶K和2.0?3.0mL裂解緩沖液混合而成，50°C加熱1.5?2.5h ;
[0028]b4.棄掉蛋白酶K消化液，重復(fù)步驟b3 ；
[0029]b5.棄掉蛋白酶K消化液，用I XWashing buffer沖洗3?5次；
[0030]b6.用1mL的TE buffer快速?zèng)_洗膠塊兩次，放在搖床上180rpm搖晃10?20min，
重復(fù)二次；
[0031]bl.棄掉步驟b6中的TE Buffer，將管塞上的膠塊用下鏟子移置離心管底部，每個(gè)離心管中加入RNase酶消化液，在37°C水浴鍋中消化I?2h，其中，RNase消化液由40?60 μ L的濃度為10mg/mL的RNase酶和1.5?2.5mL的TE buffer混合而成；
[0032]b8.棄掉RNase酶消化液，用I Xwashing buffer快速?zèng)_洗膠塊三次，然后加入1ml I Xwashing buffer，放在搖床上180rpm搖晃15min，慢洗四次；
[0033]b9.棄