獲得肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞獲得肽以用于其隨后分析的方法。
[0002] 這些肽的分析的確可以證明在大量應(yīng)用中，特別是在生物標(biāo)記物研宄或細(xì)菌肽分 析中有用，所述應(yīng)用例如在鑒別、分型、抗性標(biāo)記物和毒性標(biāo)記物檢測的應(yīng)用框架內(nèi)，并且 此框架在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域內(nèi)。
[0003] 技術(shù)現(xiàn)狀
[0004] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)提取并且純化肽的方案通常非常冗長。此外，這些方法通常手動(dòng)實(shí) 施并且復(fù)雜。
[0005] 國際申請WO 2006/031063描述了意圖水解多肽的組合物，此水解反應(yīng)通過使用 稱為"PCA"的溶液以化學(xué)方法獲得，所述PCA包括酸（比如純乙酸）、水易混合的有機(jī)溶劑 (比如乙腈）和還原劑（比如三（2-羧乙基）膦）。此化學(xué)消化在99. 9°C下進(jìn)行兩小時(shí)。 然而，可能為了增加蛋白水解的效率，WO 2006/031063任選地預(yù)先采取措施將化學(xué)消化這 步連接至之前的酶消化步驟。使用經(jīng)修飾的胰蛋白酶在37°C下進(jìn)行酶消化步驟12小時(shí)， 隨后熱變性步驟（90°C 20分鐘）。上述化學(xué)消化步驟在酶消化這步之后進(jìn)行（99. 9°C 2小 時(shí)）。蛋白質(zhì)樣品的總處理時(shí)間因此大于14小時(shí)，這表示了無以爭辯的主要缺點(diǎn)。此外， TO 2006/031063教導(dǎo)了比常規(guī)胰蛋白酶更貴的經(jīng)修飾的胰蛋白酶的用途。
[0006] 就其本身而言，國際申請WO2008/128029公開了蛋白質(zhì)或肽在溶液中片段化的 方法，所述方法包括：在酶消化或化學(xué)消化的初始步驟之后，一系列分離和片段化的另外步 驟。后者一方面有助于增加片段化方法的總時(shí)間，但另一方面需要多種操作，從而致使此方 法的自動(dòng)化極其困難。
[0007] 專利US7, 622, 273描述了意圖使經(jīng)翻譯后修飾的多肽或蛋白質(zhì)變性的方案，這 些肽和蛋白質(zhì)直接結(jié)合到蛋白質(zhì)微陣列，并且所述方案包括化學(xué)處理、酶消化或化學(xué)消化 的步驟以及隨后鑒別所述蛋白質(zhì)微陣列上蛋白質(zhì)的步驟?；瘜W(xué)處理步驟包括所述蛋白質(zhì)的 變性、還原和烷基化，而酶消化步驟包括所述蛋白質(zhì)的去糖基化和/或去磷酸化以及通過 化學(xué)蛋白水解或酶蛋白水解的所述蛋白質(zhì)的消化。所有的反應(yīng)在蛋白質(zhì)微陣列上按次序地 進(jìn)行。化學(xué)處理步驟持續(xù)至少3小時(shí)15分并且酶消化步驟持續(xù)兩小時(shí)（參見實(shí)例1)，即5 小時(shí)15分的最小持續(xù)時(shí)間。盡管這小于常規(guī)方法的持續(xù)時(shí)間一大約24小時(shí)一然而仍然不 令人滿意，特別考慮到臨床領(lǐng)域或藥學(xué)領(lǐng)域中固有的要求。更重要的是，復(fù)雜樣品（血漿、 尿、腦脊液等）在實(shí)施此專利公開的方案之前可能需要分級分離策略或消除策略，以使目 標(biāo)蛋白質(zhì)分離，這因此增加了所述樣品的總處理持續(xù)時(shí)間。
[0008] 國際申請WO 2011/130521描述了蛋白水解消化的方法，其使用一系列壓力循環(huán) (例如從5kpsi到35kpsi，即大約從344. 74巴到2413. 16巴），以便減少此方法的持續(xù)時(shí) 間。即使此持續(xù)時(shí)間似乎短于現(xiàn)有技術(shù)的方法，但依然，對應(yīng)于還原步驟（10mM的DTT在 37°C下1小時(shí)）和烷基化步驟（50mM的碘乙酰胺在環(huán)境溫度下在黑暗中45分鐘）的累積 時(shí)間不能小于1小時(shí)45分。如果這再加上微生物的裂解時(shí)間（3分鐘，以4500rpm)、還原步 驟之前裂解物的操作時(shí)間（未指明）以及在壓力之下酶消化步驟之前溶液稀釋所固有的時(shí) 間（也未指明），顯然為WO 2011/130521目的的方案的總持續(xù)時(shí)間不可能小于2小時(shí)，其仍 然不令人滿意。由于使用的高壓，則此方法需要能夠承受這些高壓的難以操作并且昂貴的 復(fù)雜裝置。更重要的是，為了不使實(shí)際使用的酶冒失活的風(fēng)險(xiǎn)，在酶消化步驟之前，所述方 法需要另外的過濾步驟，以便降低離液劑非常高的濃度（8M尿素），當(dāng)在高濃度（從1M起） 下使用時(shí)，在蛋白質(zhì)變性步驟使用的離液劑一比如尿素一也將使在酶蛋白水解步驟使用的 酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性，并且將具有完全或部分滅活此酶的后果。為了防止這，必需在酶蛋白 水解（酶消化）步驟之前進(jìn)行另外的稀釋和/或過濾步驟，這需要另外的時(shí)間間隔并且使 整個(gè)方法的自動(dòng)化更加復(fù)雜。備選方案在于使用能夠在高濃度離液劑存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)消 化的基因修飾的酶（例如經(jīng)修飾的胰蛋白酶）。然而，這些經(jīng)修飾的酶具有不如天然酶的作 用動(dòng)力學(xué)（action kinetics)快速的作用動(dòng)力學(xué)，并且具有比天然酶的采購成本更高的采 購成本。
[0009] 因此，存在開發(fā)允許從原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞獲得肽而解決上述問題的所有或 部分的方案的需要，所述方案即不需要不必要的稀釋步驟的有效、快速、可以容易自動(dòng)化的 方案。
[0010] 發(fā)明公開內(nèi)容
[0011] 因此，本發(fā)明的目的涉及從原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞獲得肽的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0012] a)裂解原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞并回收由此獲得的蛋白質(zhì)，
[0013] b)使用至少一種變性劑使所述蛋白質(zhì)變性，
[0014] c)使用至少一種烷基化劑使變性的蛋白質(zhì)烷基化，
[0015] d)使用至少一種蛋白水解酶將在步驟c)結(jié)束時(shí)獲得的蛋白質(zhì)酶促蛋白水解，
[0016] e)回收在酶促蛋白水解步驟d)結(jié)束時(shí)獲得的肽，
[0017] 其中步驟a)中原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞的裂解是在低濃度離液劑下的裂解。
[0018] 獲得肽的此方法（方案）適用于原核細(xì)胞（例如細(xì)菌）、真核細(xì)胞（人細(xì)胞、動(dòng)物 細(xì)胞、酵母細(xì)胞等）或原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的混合物。
[0019] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，將使用根據(jù)本發(fā)明的方法以便從原核細(xì)胞、優(yōu)選地從細(xì)菌 (革蘭氏+或革蘭氏-)獲得肽。
[0020] "變性劑"被理解為能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和多肽變性現(xiàn)象的物理的或化學(xué)的劑；蛋白質(zhì) 和多肽舍棄其天然狀態(tài)并且漸漸失去其二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。有時(shí)變性可以是 可逆的，返回到天然狀態(tài)是可能的并且蛋白質(zhì)的活性被恢復(fù)。
[0021] 蛋白質(zhì)的變性起因于蛋白質(zhì)依賴于其物理化學(xué)環(huán)境的敏感性。當(dāng)通過變性劑來破 壞殘基之間的相互作用時(shí)，蛋白質(zhì)被變性。多肽鏈中相鄰的氨基酸之間的共價(jià)鍵未斷裂。相 反地，變性的某些條件可以引起多肽鏈中非相鄰的半胱氨酸殘基之間提供蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu) 整體穩(wěn)定性的二硫鍵的斷裂。
[0022] 變性劑如以下來主要區(qū)分：
[0023] a)物理劑，比如溫度；溫度的增加的確引起分子中原子的熱攪動(dòng)；這引起像氫鍵 的弱相互作用的斷裂，所述氫鍵使空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；
[0024] b)化學(xué)劑，比如：
[0025] -酸和堿；通過改變環(huán)境pH，其引起由可電離基團(tuán)攜帶的電荷的改變，并因此破壞 穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的尚子鍵和氣鍵；
[0026] _離液劑，比如尿素、胍鹽（例如鹽酸胍或胍高氯酸鋰（guanidine hydrochloride or lithium perchlorate));在高濃度下使用，這些化合物大大削弱了蛋白質(zhì)的氫鍵（負(fù)責(zé) 維持蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)的主要的低能量鍵）；
[0027] -硫醇還原劑，比如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT);其允許裂解二硫橋，并從而 有助于削弱蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)或四級結(jié)構(gòu)；
[0028] _洗滌劑，其通過改變與水性溶劑之間的相互作用起作用（例如十二烷基硫酸 鈉一以首字母縮略詞"SDS"更為所知）。
[0029] 某些變性劑可以證明為不可逆的，比如重金屬（Pb、Hg等）和某些酸（例如HN03、 三氯乙酸等）。
[0030] 為了本發(fā)明的目的，將離液劑區(qū)分為所謂的"鹽"離液劑，比如胍的鹽（或胍鹽的 鹽）（salts of guanidine(or of guanidinium))，和所謂的"非鹽"離液劑，比如尿素。
[0031] "在低濃度"離液劑"下裂解"被理解為在小于或等于1M、優(yōu)選地小于或等于100mM 的離液劑濃度下裂解。
[0032] 實(shí)際上，在此濃度下，所謂的"離液"劑對蛋白質(zhì)和多肽不再行使變性活性，從而失 去其離液性質(zhì)。
[0033] 此技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)中所存在的常規(guī)方案形成對照，所述常規(guī)方案通常采用大 約6M的通常非常高的濃度的離液劑，并且更尤其是胍鹽（比如鹽酸胍、異硫氰酸胍等）。離 液劑并尤其是鹽（例如胍鹽）的這種濃度大大干擾了酶促蛋白水解，尤其當(dāng)使用絲氨酸蛋 白酶比如胰蛋白酶來進(jìn)行酶促蛋白水解時(shí)。在根據(jù)本發(fā)明獲得肽的方法框架之內(nèi)，在低濃 度離液劑下進(jìn)行裂解的事實(shí)不僅允許改進(jìn)蛋白水解步驟d)的效率，而且還防止在所述蛋 白水解步驟之前必須求助于另外的過濾/稀釋步驟。實(shí)現(xiàn)的時(shí)間節(jié)省允許獲得比現(xiàn)有技術(shù) 中所描述的方案明顯更快的方案，而其還更易于自動(dòng)化。
[0034] 此外，此低濃度的離液劑允許使用天然的蛋白水解酶，而不需要求助于基因修飾 的蛋白水解酶，所述基因修飾的蛋白水解酶具有不如天然酶的作用動(dòng)力學(xué)快速的作用動(dòng)力 學(xué)，并且具有比天然酶的采購成本更高的采購成本。
[0035] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，在低的鹽濃度下來實(shí)現(xiàn)裂解，這意指在小于或等于50mM、優(yōu) 選地小于或等于30mM的鹽濃度下進(jìn)行裂解。
[0036] 有利地，在非鹽離液劑比如尿素不存在下進(jìn)行低濃度離液劑下的裂解。實(shí)際上，根 據(jù)本發(fā)明的方法不需要使用此種非鹽離液劑。
[0037] 對于低濃度離液劑下的裂解，優(yōu)選使用國際申請W0 02/10333中描述的原核生物 和/或真核生物細(xì)胞裂解的通用方案，國際申請W0 02/10333的全部內(nèi)容通過引用并入本 專利申請。此通用方案包括原核生物和/或真核生物細(xì)胞裂解的方法或者原核生物和真核 生物同時(shí)細(xì)胞裂解的方法，其包括調(diào)整以下參數(shù)的至少三個(gè)：
[0038] -相對于大直徑的活潑珠（active beads)(裂解珠），小直徑的活潑珠（裂解珠） 的質(zhì)量百分比小于或等于50%，和/或
[0039] -相對于處理的生物樣品的總質(zhì)量，包括小直徑的珠和/或大直徑的珠的混合物 或者另外地小直徑的珠和/或大直徑的珠的裂解（活潑）珠的總質(zhì)量為50%和100%之間， 和/或
[0040] -裂解的持續(xù)時(shí)間為10分鐘和20分鐘之間，和/或
[0041] -用于驅(qū)動(dòng)裂解（活潑）珠的非裂解玻璃珠的數(shù)目小于七（7)，和/或-用于驅(qū)動(dòng) 裂解（活潑）珠的非裂解鐵珠的數(shù)目為五（5)和十五（15)之間，這取決于使用的技術(shù)：
[0042] -聲處理，
[0043] -機(jī)械渦旋，或
[0044] -磁渦旋。
[0045] 優(yōu)選地，小直徑的裂解（活潑）珠具有在90 ym和150 ym之間、且優(yōu)選地大約 100 ym的直徑，且大直徑的裂解（活潑）珠具有在400 ym和600 ym之間、且優(yōu)選地大約 500 y m的直徑。
[0046] 還優(yōu)選地，裂解（活潑）珠由玻璃制成。
[0047] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，還比如申請WO02/10333中指示的，如果使用機(jī)械渦旋技 術(shù)，此方法包括根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行裂解：
[0048] -裂解持續(xù)時(shí)間為11分鐘到20分鐘、優(yōu)選地為15分鐘到20分鐘、且還更優(yōu)選地 為20分鐘，
[0049]-100ym直徑的珠的百分比為小于50 %、優(yōu)選地小于30 %、且還更優(yōu)選地為20 %，
[0050] -裂解（活潑）珠的總質(zhì)量大于處理的生物樣品的總質(zhì)量的60%、優(yōu)選地大于其 80%、且還更優(yōu)選地為其100%，并且
[0051] _玻璃珠的數(shù)目小于七（7)、優(yōu)選地等于一（1)。
[0052] 如果使用磁渦旋技術(shù)，優(yōu)選地，此方法包括根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行裂解：
[0053] -裂解持續(xù)時(shí)間為12分鐘到20分鐘、優(yōu)選地為15分鐘到20分鐘、且還更優(yōu)選地 為20分鐘，
[0054] -100ym的裂解（活潑）珠的總質(zhì)量大于處理的生物樣品的總質(zhì)量的80%、且優(yōu) 選地為其1〇〇%，
[0055] -鐵珠的數(shù)目在五（5)到十五（15)個(gè)珠之間、優(yōu)選地為十（10)個(gè)鐵珠。
[0056] 通常，為了本發(fā)明的目的，以低濃度離液劑使用任何裂解技術(shù)而不需要依賴大約 幾百巴或甚至數(shù)千巴的高壓。實(shí)際上，本發(fā)明的目的之一是詳盡闡述有效、快速并且可以借 助于標(biāo)準(zhǔn)裝置來實(shí)施，而不需要使用特別改造的裝置以承受高壓或甚至非常高的壓力的用 于獲得肽的方案，所述特別改造的裝置是使用復(fù)雜并且極其昂貴的裝置。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明獲得肽的方法在從大氣壓力到大約一百巴的壓力的壓力下實(shí)施。優(yōu)選 地，所述方法在1〇〇巴、優(yōu)選地小于50巴、有利地小于10巴的壓力下實(shí)施。根據(jù)優(yōu)選的實(shí) 施方案，根據(jù)本發(fā)明的方法在大氣壓力下進(jìn)行。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，在低濃度離液劑下的裂解是通過借助于超聲波探頭 實(shí)現(xiàn)的聲處理的裂解。優(yōu)選地，通過聲處理的此裂解在1000 y m玻璃珠和100 y m鋯珠的混 合物的存在下，借助于所述超聲波探頭來實(shí)現(xiàn)。
[0059] 在通過聲處理的裂解框架之內(nèi)，優(yōu)選地，將方案應(yīng)用于通過比如國際申請WO 02/10333 (第3頁第18-26行）中描述的聲處理的裂解，S卩，使用以下參數(shù)：
[0060] -裂解持續(xù)時(shí)間為9分鐘到20分鐘、優(yōu)選地為12分鐘到18分鐘、且還更優(yōu)選地為 15分鐘，
[0061] -100 ym直徑的珠的百分比在10%到50%之間、優(yōu)選地在20%和30%之間、且還 更優(yōu)選地為20%，并且
[0062] -裂解（活潑）珠的總質(zhì)量為處理的生物樣品的總質(zhì)量的50%到100%之間、優(yōu)選 地為其75%和90%之間、且優(yōu)選地為其80%和85%之間。
[0063] 關(guān)于用于通過聲處理裂解的方案的裝置和方法學(xué)本身，在有利的方式中，使用 外部超聲波發(fā)生器，比如由Hielscher公司銷售的小瓶高音超聲波發(fā)生器（VialTweeter sonotrode)。此探頭包括以孔穿透的振動(dòng)塊，在所述孔中可以插入小瓶，比如1. 5ml體積 的Eppendorf小瓶，在該小瓶中引入在3mM硼酸鹽的pH 8的緩沖液中懸浮裂解的細(xì)胞以及 1mm玻璃珠和100 ym錯(cuò)珠（每個(gè)50mg)。關(guān)閉小瓶，并且然后以額定振幅（對于每個(gè)小瓶， 取決于其在塊中的位置，在5瓦特和10瓦特之間）的50%和100%之間、優(yōu)選地為100%的 振幅以及在40 %到60 %、優(yōu)選地為50 %的循環(huán)比率下，啟動(dòng)超聲波發(fā)生器持續(xù)5分鐘到15 分鐘，優(yōu)選地10分鐘。
[0064] 通過聲處理裂解的方案的選擇并非在任何情況下的隨意的選擇。常常與此相反， 申請人已經(jīng)以驚人的方式發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解步驟a)為通過聲處理的裂解步驟時(shí)，根據(jù)本發(fā)明獲 得肽的方法的收率更好。
[0065] 此外，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，預(yù)熱超聲波探頭步驟（持續(xù)lh的探頭的激活，其將整個(gè)振 動(dòng)系統(tǒng)的溫度提升到95°C)的省略不削弱所述方法的效率。這被證明是完全有利的特征， 因?yàn)槌暡ㄌ筋^的此預(yù)熱步驟減少了其壽命并且需要另外的能量貢獻(xiàn)。
[0066] 因此，在優(yōu)選的方式中，超聲波探頭在通過聲處理裂解之前不經(jīng)受預(yù)熱步驟。
[0067] 關(guān)于酶促蛋白水解步驟d)，此步驟通過蛋白水解酶的作用來進(jìn)行，所述蛋白水解 酶優(yōu)選地為絲氨酸蛋白酶，其有利地選自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶組成的 組。優(yōu)選地，所述蛋白水解酶為胰蛋白酶。
[0068] 此酶促蛋白水解相對于物理-化學(xué)處理（用過氧化氫、溴化氰、三氟乙酸的處理） 而言是特別優(yōu)選的，因?yàn)槠涓蟪潭鹊乇４娴鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，其證明更易于控制并且在特定 位點(diǎn)（在胰蛋白酶情況下在賴氨酸殘基和精氨酸殘基的C-端處）裂解肽鏈。"酶促蛋白水 解"被理解為在合適的反應(yīng)條件下一種或更多種酶的單作用或聯(lián)合作用。進(jìn)行蛋白水解的 酶被稱為蛋白酶，以位點(diǎn)特異的方式裂解蛋白質(zhì)。實(shí)際上，每種蛋白酶通常識(shí)別特定的氨基 酸序列，在所述特定的氨基酸序列中此蛋白酶總是進(jìn)行相同的裂解。某些蛋白酶識(shí)別單一 的氨基酸或兩個(gè)氨基酸的序列，它們在所述兩個(gè)氨基酸之間進(jìn)行裂解，其他蛋白酶識(shí)別更 長的氨基酸序列。這些蛋白酶可以是內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶。尤其可以引用已知蛋白酶， 如文件W0 2005/098071中描述的：
[0069] -特異性酶，比如：胰蛋白酶，其分裂Arg殘基和Lys殘基的羧基處的肽鍵；內(nèi)溶 素，其裂解賴氨酸的-C0基團(tuán)的肽鍵；胰凝乳蛋白酶，其水解芳香族殘基（Phe、Tyr和Trp) 的羧基處的肽鍵；胃蛋白酶，其在芳香族殘基（Phe、Tyr和Trp)的NH 2基團(tuán)處切割；金黃色 葡萄球菌的V8菌株的V8蛋白酶，其裂解Glu殘基的羧基處的肽鍵；
[0070] -非特異性酶，比如：源自Bacillus thermoproteolyticus的嗜熱菌蛋白酶，其水 解疏水氨基酸（Xaa-Leu，Xaa-Ile，Xaa-Phe)的NH 2基團(tuán)的肽鍵；為細(xì)菌蛋白酶的枯草桿菌 蛋白酶和鏈霉蛋白酶，其幾乎水解所有的鍵并且可以在控制的反應(yīng)條件（酶濃度和反應(yīng)持 續(xù)時(shí)間）下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成寡肽。
[0071] 如果幾種蛋白酶的作用模式兼容，則它們可以以同時(shí)的方式來使用，或者它們可 以被相繼使用。在本發(fā)明的框架之內(nèi)，樣品的消