具有抗腫瘤活性的厚殼貽貝多糖類化合物的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的厚殼貽貝中所含的多糖類化合物的制備方法，同時，還涉及該糖苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]貽貝是海產(chǎn)雙殼貝類，俗稱青口、海紅，其干制品統(tǒng)稱淡菜，除含有豐富的氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)及維生素外，還含有豐富的微量元素一硒。貝類提取物具有抗腫瘤，增加機體免疫功能，降血脂，抗衰老及抗病毒和抗菌功能；新近報道貽貝具有較高的修復DNA損傷的作用，故有望研制出抗腫瘤藥物新成分；貽貝足腺細胞分泌的粘液蛋白含有的貽貝粘著蛋白(屬糖蛋白類)為超強度粘液的研發(fā)等。貽貝不僅有很高的營養(yǎng)價值，還具有很好的藥用和食療功效，又是補腎良藥，藥效明顯。我國沿海所產(chǎn)的食用貽貝主要有紫貽貝、厚殼貽貝和翡翠貽貝等。目前國內(nèi)外研究對貽貝蛋白質(zhì)如過氧化物歧化酶、凝集素等的分離提純及功能進行了一定研究，但對于貽貝多糖的研究不多。
[0003]從東海厚殼貽貝中分離純化而來的貽貝多糖具有有明顯的增強機體免疫力作用及體內(nèi)抗腫瘤等作用。對腫瘤細胞H0-8910、MCF-7、K562及SMMC-7721均有顯著抑制增殖作用。徐紅麗等采用熱水提取我國東海厚殼貽貝粗多糖，DEAE-Sepharose、Sepharose CL-6B柱層析進一步分離純化得到貽貝多糖純品MP-1。用MTT法進行體外抗腫瘤活性的研究。結(jié)果表明貽貝多糖純品MP-1主要由葡萄糖組成，對體外多種腫瘤細胞均有不同程度抑制作用(參見文獻:徐紅麗，郭婷婷，郭一峰，張建鵬，馮偉華，焦炳華。貽貝水溶性多糖MP-1的分離純化及體外抗腫瘤活性研究[J].第二軍醫(yī)大學學報，2006，27 (9) =998-1001.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有多糖提取方法脂類干擾以及最終多糖得率不高的缺點，提供一種新的我國東海厚殼貽貝所含的多糖類化合物的制備方法；本發(fā)明的第二目的是提供依據(jù)上述方法制備得到的厚殼貽貝多糖類化合物；本發(fā)明的第三目的是提供該多糖類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了厚殼貽貝多糖類化合物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0007]A.粗制品制備
[0008]新鮮貽貝軟體組織勻漿，1%甲醇間歇攪拌浸泡24h去脂，離心取沉淀。加水煮沸5h，抽濾，殘渣重復加水煮沸3h，抽濾，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮濾液。0.5%活性炭脫色，離心去沉淀。加乙醇至終濃度75%，4°C靜置醇沉過夜。離心收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力攪拌，分液漏斗靜置分層，棄下層有機溶劑相。反復8次，至界面無白色沉淀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮上層水相，加三倍體積無水乙醇沉淀過夜，棄上清，冷凍干燥得粗多糖。
[0009]B.精制品制備
[0010]將粗多糖溶于蒸餾水，離心收集上清，不溶物再次熱水浴中溶于蒸餾水，離心棄沉淀，合并兩次上清液，終濃度約0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50離子交換制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液。苯酚-硫酸法(1:5)跟蹤檢測收集多糖組分，至無糖洗出為止(480nm處測定OD值，繪制洗脫曲線)。真空冷凍干燥濃縮多糖洗脫液，得到多糖提取物半純品。多糖提取物復溶于蒸懼水，離心棄沉淀，濃度約0.2g/ml,上SepharoseCL-6B凝膠制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液，苯酚-硫酸法跟蹤檢測收集多糖組分，至無糖洗出為止。重復上Sepharose CL-6B凝膠制備柱,至HPLC檢測呈單一對稱峰。真空冷凍干燥得到多糖精制品。
[0011 ] 除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。
[0012]本發(fā)明的第二方面，是提供了依據(jù)上述方法制備得到的厚殼貽貝多糖類化合物。
[0013]本發(fā)明的第三方面，是提供了上述的多糖類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞NF-κ B p65基因表達而起作用的。
[0015]本發(fā)明對所述的貽貝多糖進行了體內(nèi)外抗腫瘤活性的檢測，證明本發(fā)明化合物具有良好的抗腫瘤活性。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細描述。但下列實施例不應(yīng)看作對本發(fā)明范圍的限制。
[0017]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實施例中的生物材料和主要試劑購自國藥集團上海分公司。
[0019]實施例1:從厚殼貽貝中分離純化多糖類化合物
[0020]厚殼貽貝由浙江省嵊泗縣翔遠水產(chǎn)有限公司提供，采自浙江省嵊泗縣貽貝養(yǎng)殖水域。
[0021]取新鮮貽貝軟體組織700g，組織搗碎機勻漿，加1L1%甲醇間歇攪拌浸泡24h去脂，5000rpmX 1min離心取沉淀。加水5L,攪拌、煮沸5h,抽濾,殘洛重復加水煮沸3h,抽濾,合并兩次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮濾液。0.5%活性炭脫色，5000rpmX 1min離心去沉淀。加乙醇至終濃度75%，4°C靜置醇沉過夜。8000rpmX 1min離心收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于250ml水，Sevage法除蛋白(V樣品:V氯仿:V正丁醇=20:4:1)，混合液磁力攪拌0.5h，分液漏斗靜置分層，棄下層有機溶劑相(含大量蛋白)。反復4次，至界面無白色沉淀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮上層水相，加三倍體積無水乙醇沉淀過夜，棄上清，冷凍干燥得粗多糖。
[0022]將粗多糖溶于蒸餾水，8000rpmX 1min離心收集上清，不溶物再次熱水浴中溶于蒸餾水，離心棄沉淀，合并兩次上清液，終濃度約0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50離子交換制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液。苯酚-硫酸法(1:5)跟蹤檢測收集多糖組分