一種l-苯丙氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率提高的谷氨酸棒桿菌重組菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種L-苯丙氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率提高的谷氨酸棒桿菌重組菌，屬于代謝 工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-苯丙氨酸（L-Phe)又稱為L(zhǎng)-苯基-α -氨基丙酸，其具有旋光性的芳香族氨基 酸，是人體必需氨基酸之一，是重要的醫(yī)藥和食品化學(xué)品中間體，具有巨大的市場(chǎng)空間。
[0003] L-Phe的生產(chǎn)技術(shù)主要包括天然蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵 法。其中天然蛋白質(zhì)水解法由于其生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以用于工業(yè)化生 產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法因其生產(chǎn)路線長(zhǎng)、副產(chǎn)物多且產(chǎn)物為消旋不宜推廣使用等缺點(diǎn)，因而逐漸被 淘汰。由于酶法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)物濃度高、純化步驟簡(jiǎn)單等特點(diǎn)是目前工業(yè)化L-Phe 的主要生產(chǎn)方式之一，微生物發(fā)酵法具有原料廉價(jià)易得、環(huán)境污染較小，產(chǎn)物濃度高等優(yōu)點(diǎn) 成為國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe的主要方法。
[0004] 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum，C. glutamicum)中 L-Phe 合成途 徑主要分為三個(gè)部分：1、中心碳源代謝途徑提供兩個(gè)前體物質(zhì)，來源于糖酵解途徑的磷酸 稀醇式丙酮酸（Phophoenol pyruvate, PEP)以及來源于磷酸戊糖途徑的4-磷酸-赤蘚糖 (Erythrose-4_phosphate，E4P) ;2、莽草酸途徑是芳香族氨基酸合成的共同代謝途徑；3、 分支酸路徑，以分支酸（Chorismate)為節(jié)點(diǎn)通過不同的酶作用分別流向三種不同的芳香 族氨基酸L-Phe，L-酪氨酸和L-色氨酸。
[0005] 雖然大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸能到很高的水平，但大腸桿菌由于其自身的 特點(diǎn)而在大工業(yè)化生產(chǎn)中受到了限制，尤其在制備食品級(jí)的大工業(yè)化生產(chǎn)中。這是因?yàn)榇?腸桿菌本身是一種條件致病菌，所生產(chǎn)的重組蛋白、有機(jī)酸等產(chǎn)物中殘留有大腸桿菌的相 關(guān)抗原，從而易引起人或其他動(dòng)物的免疫反應(yīng)，這是公眾衛(wèi)生所不能接受的；此外，大腸桿 菌是一種很好的噬菌體宿主菌，在大工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中極易遭受噬菌體的感染。
[0006] 谷氨酸棒桿菌是一種食品級(jí)的微生物，本發(fā)明旨在提供一種L-苯丙氨酸產(chǎn)量提 高的重組谷氨酸棒狀桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種L-苯丙氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率提高的谷氨酸棒桿菌重組菌，所述菌株 發(fā)酵能明顯提高L-Phe中間產(chǎn)物PEP積累量，L-Phe產(chǎn)量以及L-Phe對(duì)葡萄糖的糖酸轉(zhuǎn)化 率。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種谷氨酸棒桿菌重組菌株，其特征在于，所述菌株 是以谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)為出發(fā)菌株，缺失了 L-Phe吸收途徑 的基因 aroP、乙酸脫氫酶系I基因 aceE、乳酸脫氫酶基因 ldh、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS系統(tǒng)的基因 pstl，在原pstl位點(diǎn)整合了非依賴于PEP消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因 iolT2-ppgK，同時(shí)轉(zhuǎn)入了 含有L-Phe合成途徑八個(gè)關(guān)鍵酶的調(diào)控表達(dá)質(zhì)粒。
[0009] 所述 pstl、iolT2-ppgK、aroP、aceE、Idh 的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20 所示。
[0010] 所述出發(fā)菌株為 C. glutamicum ATCC 13032。
[0011] 所述的八個(gè)關(guān)鍵酶為編碼3-脫氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶的ar〇F fb\編碼莽 草酸脫氫酶的aroE，編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA、編碼轉(zhuǎn)酮酶的tktA、編碼分支 酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶的PheA fto、編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的 aroA、編碼氨基轉(zhuǎn)移酶的tyrB和編碼莽草酸激酶的aroL。
[0012] 所述的八個(gè)關(guān)鍵酶的核苷酸序列分別是：BroFfto(序列如SEQ ID NO. 17所示）、 pheAfbr(序列如SEQIDN0·18所示）、aroE(GeneID:3343183)、ppsA(GeneID:14791674)、 tktA(Gene ID:3343601)> aroA(Gene ID:3345010)> tyrB(Gene ID:12933673)> aroL(Gene ID:12930837)
[0013] 所述谷氨酸棒桿菌重組菌株的表達(dá)質(zhì)粒，包括一個(gè)過表達(dá)aroFfto、aroE、ppsA、 tktA基因的質(zhì)粒，和一個(gè)過表達(dá)pheAfte、aroA、tyrB、aroL基因的質(zhì)粒。
[0014] 所述表達(dá)質(zhì)粒，其構(gòu)建方法，是aroE融合，ppsA與tktA融合，連接表達(dá) 載體 PEC-XK99E 后，在 aroF^-aroE、ppsA-tktA 前分別插入啟動(dòng)子 Ptac(SEQ ID NO. 15) 和 Plac(SEQ ID N0.16)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，即 pSUTL ;pheAfbI^ aroA 融合，tyrB 與 aroL 融合，連接表達(dá)載體 pXMJ19 后，在 pheA fto-aroA、 tyrB-aroL 前分別插入啟動(dòng)子 Ptac 和 Plac 構(gòu)建重組質(zhì)粒 pXMJ19-Ptac-pheAfbl-aroA_Plac -tyrB-aroL 即 pSDTL〇
[0015] 所述谷氨酸棒桿菌重組菌株命名為，命名為C. glutamicum AptsI: :iolT2_ppgKA aroP Δ aceE ΔIdh(pSUTL, pSDTL)〇
[0016] .本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述谷氨酸棒桿菌重組菌株的構(gòu)建方法，步驟 如下：
[0017] (1)根據(jù)目標(biāo)基因及其上下游序列，構(gòu)建目標(biāo)基因缺失的敲除框后與載體 pkl8mobSacB連接，構(gòu)建成1個(gè)pstl基因缺失且在原pstl基因處整合了 iolT2-ppgk基因 的敲入載體pK18mobSacB-iolT2_ppgk和3個(gè)分別缺失aroP、aceE、Idh基因的敲除載體 pK18mobSacB-aroP、pK18mobSacB_aceE、pK18mobSacB_ldh ;
[0018] (2)將4個(gè)載體轉(zhuǎn)化到C. glutamicum獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即C. glutamicum Δ ptsl:: iolT2-ppgK Δ aroP Δ aceE ΔIdh ；
[0019] (3)將過表達(dá) L-Phe 合成途徑八個(gè)關(guān)鍵酶 aroF^^aroE'ppsA'tktA'pheAf'aroA、 tyrB、aroL的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到步驟2得到的菌株中，即獲得谷氨酸棒桿菌重組菌株。
[0020] 所述構(gòu)建方法中的載體pkl8mobSacB還可以被載體pK19mobSacB替代。
[0021] 所述重組菌的構(gòu)建方法中，所述敲除載體的構(gòu)建方法是：通過融合PCR的方法 得到目標(biāo)基因缺失或者部分缺失的含有目標(biāo)基因上下游序列的片段，將該片段連接到 pK18mobSacB 載體上。
[0022] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高L-Phe糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，是使用谷氨酸棒 桿菌重組菌株進(jìn)行發(fā)酵。
[0023] 所述方法，其特征在于，所述重組菌株的發(fā)酵方法是：是將活化的種子接入發(fā)酵培 養(yǎng)基中，加入IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)重組酶，通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0024] 所述發(fā)酵方法中，接種量為8%至10%。
[0025] 所述發(fā)酵方法中，加入IPTG終濃度ImM。
[0026] 所述發(fā)酵方法中，IPTG的添加時(shí)機(jī)在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是接種時(shí)添加。
[0027] 所述發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為60_80h。
[0028] 所述種子液的種子培養(yǎng)基（g/L)為：葡萄糖25. 0,玉米漿固體干粉17. 5,硫酸銨 5. 0,硫酸鎂0· 5,磷酸二氫鉀L 0,尿素2. 0, pH 6. 8-7. 0。
[0029] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)為：葡萄糖100. 0,玉米漿固體干粉6. 0,硫酸銨25. 0,磷酸 二氫鉀L 〇,檸檬酸鈉2. 0,碳酸鈣20. 0, pH 6. 8-7. 0。
[0030] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括0. 5g/L的硫酸鎂。
[0031] 本發(fā)明對(duì)谷氨酸棒桿菌基因組進(jìn)行修飾，通過aroP、ldh、aceE基因的敲除分別 減少了 L-Phe的吸收、阻斷乳酸的形成途徑、阻斷乙酸的形成，敲除會(huì)阻斷依賴于PEP消耗 的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS系統(tǒng)的基因 ptsl的同時(shí)通過整合非依賴于PEP消耗的葡萄轉(zhuǎn)運(yùn)基因 iolT2-ppgK能夠回補(bǔ)菌體由于阻斷了依賴于PEP消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS系統(tǒng)造成的菌體 生長(zhǎng)的缺陷，構(gòu)建了重組菌 C. glutamicum Δ ptsl: : iolT2_ppgK Δ aroP Δ aceE Δ Idh (pSUTL, pSDTL)，其L-Phe對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率是出發(fā)菌株C. glutamicum ATCC13032的50. 9倍，其PEP 積累增加一倍，乙酸、乳酸積累量顯著降低。本發(fā)明的重組菌能夠明顯提高L-Phe中間產(chǎn)物 PEP積累量，L-Phe產(chǎn)量以及L-Phe對(duì)葡萄糖的糖酸轉(zhuǎn)化率，改變碳源流向降低或者阻斷副 產(chǎn)物積累，此代謝工程的手段能被應(yīng)用于以PEP為前體的其他代謝產(chǎn)物的合成。
【附圖說明】
[0032] 圖1 :含有不同基因