一種重組大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域,具體地說將參與2,3-丁二醇生物合成的三個 基因克隆并與大腸桿菌高拷貝載體PUC19連接,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,使用氨芐青 霉素作為篩選標(biāo)記,以加強(qiáng)這三個基因在大腸桿菌中的表達(dá)量,使2,3_ 丁二醇可以在大腸 桿菌中大量合成。
【背景技術(shù)】:
[0002] 2,3_ 丁二醇是重要的化工原料和液體燃料,廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航空航 天等領(lǐng)域,可以用于生產(chǎn)塑膠,制備防凍劑,并且是一種很好的溶劑,易于轉(zhuǎn)化為各種化合 物生產(chǎn)橡膠,調(diào)味品以及化妝品(Syu M J. 2001)。常溫下是一種無色無味的透明液體,相對 分子量為90. 12g/mol,其分子式如下所示。上世紀(jì)中期,2, 3-丁二醇的生物技術(shù)生產(chǎn)得到 了迅速的發(fā)展,由于更為廉價的化學(xué)合成法的出現(xiàn),使得生物技術(shù)生產(chǎn)2, 3-丁二醇陷入困 境。但是化學(xué)合成法使用石油作為原料生產(chǎn)2, 3-丁二醇。最近二十年來,上升的石油價格 導(dǎo)致化學(xué)合成法失去了優(yōu)勢,在能源需求不斷擴(kuò)大、化石能源日益短缺、石油資源供應(yīng)不穩(wěn) 定的情況下,以可再生的生物質(zhì)資源為原料,經(jīng)過生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)各種化學(xué)品、功能材 料和能源物質(zhì)的生物技術(shù)方法獲得了人們的青睞。目前,研究熱點都在于以糖質(zhì)作為原料 生產(chǎn)2, 3- 丁二醇,但是,糧食資源日益緊張的今天,開發(fā)以廉價的非糧糖質(zhì)為原料發(fā)酵生 產(chǎn)2,3_ 丁二醇具有很好的發(fā)展前景·(Xiu and Zeng2008)
【主權(quán)項】
1. 一株可利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的大腸桿菌8125141,質(zhì)粒?800,基因工程菌 BD016156和2, 3- 丁二醇合成相關(guān)酶的基因 alsS,alsD和bdh。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中,利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)大腸桿菌的方法,包括培養(yǎng)所需條件和培養(yǎng) 基配方。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的大腸桿菌基因工程菌的制備方 法,包括: a. 利用設(shè)計的引物擴(kuò)增得到三個相關(guān)合成酶的基因片段 b. 利用熱擊法將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的方法 c. 用氨芐青霉素篩選陽性克隆并用于生產(chǎn)的方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1中三個2, 3-丁二醇合成酶的相關(guān)基因設(shè)計的引物為:引物序列1, 2, 3,4, 5,6
5. 根據(jù)權(quán)利要求1中利用基因工程菌生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的發(fā)酵方法及培養(yǎng)基: LB 培養(yǎng)基(IL) :Tryptone (胰蛋白胨):10g,Yeast Extract (酵母提取物):5g, NaCl (氯化鈉):10g。若配制固體培養(yǎng)基,則再加入15g Agar (瓊脂)。 M9培養(yǎng)基(IL) :Na2HP04,7H20(七水合磷酸氫二鈉):12.8g,KH 2P04(磷酸二氫鉀):3g, NaCl (氯化鈉):0.5g,NH4Cl (氯化銨):lg,Glycerol (甘油):20g。Yeast Extract (酵母 提取物):5g,IM MgSO4 · 7H20(七水合硫酸鎂)1ML,0. IM CaCl (氯化鈣):1ML。 將所得基因工程菌在3ML含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C,250rpm培養(yǎng)12小時, 轉(zhuǎn)入M9培養(yǎng)基,M9培養(yǎng)基在使用前加入氨芐青霉素,37°C培養(yǎng)3小時,加入4 μ L濃度為 0. 5mM的IPTG誘導(dǎo),并轉(zhuǎn)入30°C,250rpm培養(yǎng)24-48小時。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中,利用基因工程菌大量發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇的擴(kuò)大培養(yǎng)方法,包 括分批補(bǔ)料,流加等發(fā)酵方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用重組大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法。具有如下步驟:1)克隆參與2,3-丁二醇生物合成的基因alsS,alsD和bdh,2)將這些基因與大腸桿菌高拷貝載體pUC19連接以構(gòu)建含有2,3-丁二醇生物合成所需蛋白的編碼基因的重組載體,3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25141中,通過氨芐青霉素的篩選標(biāo)記,從而獲得了大腸桿菌高產(chǎn)2,3-丁二醇的菌株,4)通過發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇,并從發(fā)酵液中回收2,3-丁二醇。該方法具有環(huán)保,高效,穩(wěn)定,價格低廉等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N1-21, C12P7-18, C12N15-70, C12R1-19
【公開號】CN104560843
【申請?zhí)枴緾N201310488514
【發(fā)明人】劉立棟
【申請人】常州邱鴻生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月18日