絲瓜抗褐斑病基因片段或基因標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是利用抗病基因同源序列方法，克隆絲瓜抗褐斑病基因片段或者將其轉(zhuǎn)化 為分子標(biāo)記等，主要涉及絲瓜常規(guī)雜交育種，分子標(biāo)記輔助育種，抗褐斑病基因的定位和分 子作圖，抗褐斑病基因的克隆以及抗病基因的調(diào)控機(jī)理分析等方面，屬于植物生物技術(shù)科 學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐斑病是絲瓜生產(chǎn)上最重要的病害之一。主要為害葉片。病斑褐色至灰褐色，圓 形或長形至不規(guī)則形，直徑〇. 5?13毫米。病斑邊緣明顯或不明顯，有時(shí)現(xiàn)出褪綠至黃色 暈圈，霉少見。早晨日出或晚上日落時(shí)，病斑上可見銀灰色光澤，即病原體反射所致。褐斑 病嚴(yán)重影響了絲瓜植株的正常的生長發(fā)育過程，給生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。抗病基因的 利用及抗病育種是絲瓜病害防治最有效的方法。
[0003] 二十世紀(jì)四十年代，F(xiàn)lor提出了經(jīng)典的"基因?qū)?理論學(xué)說，即植物和病原 菌體內(nèi)各自存在一個(gè)顯性基因，植物抗病基因或病菌無毒性（Avr)基因的缺失或改變都能 引起病害的產(chǎn)生。這個(gè)模型適用于大多數(shù)活體營養(yǎng)型病原菌，包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲 類。"基因?qū)?抗病性一般是受體被作為模型：植物抗病蛋白能夠直接或間接的識(shí)別源 自病菌的Avr產(chǎn)物。一旦這種識(shí)別發(fā)生，就會(huì)引起防御反應(yīng)。大多數(shù)抗病基因 （Resistance gene ;R)觸發(fā)的抗性與快速防御反應(yīng)相關(guān)，稱為過敏性反應(yīng)（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多數(shù)抗病基因的產(chǎn)物都含有蛋白識(shí)別的結(jié)構(gòu)域，如富含亮氨酸的重復(fù)單位 (LRR)的結(jié)構(gòu)域或卷曲螺旋（CC)的結(jié)構(gòu)域；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)結(jié)構(gòu)域。一些抗病基因產(chǎn)物被預(yù)測為細(xì)胞質(zhì)蛋白，而另一些通過一個(gè)跨膜結(jié) 構(gòu)域（TM)貫穿細(xì)胞膜。這些結(jié)構(gòu)域組合能夠產(chǎn)生不同類型的R蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)的特性已 經(jīng)鑒定出至少六種不同類型的 R 基因：I) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6) PK-PK。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物體內(nèi)存在的最大一類抗病基因；這些抗病基因 在結(jié)構(gòu)上的保守性為我們利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因帶來了潛在 可能。在已知分離獲得的抗病基因中，小麥抗葉銹病基因 LrlO和馬鈴薯抗馬鈴薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的經(jīng)典例子，說明利用該法克隆抗病基 因是可行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問題
[0005] 本發(fā)明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鑒定絲瓜褐斑病基因片段或者將 其轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記及。結(jié)果一方面可用于絲瓜抗褐斑病分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面 也為抗褐斑病基因的克隆提供參考依據(jù)。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明前期對(duì)大量絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性篩選，在獲得高抗絲瓜褐斑病抗病種 質(zhì)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用抗病基因同源序列法克隆抗褐斑病基因片段，通過與已知抗病基因同源 性及序列比對(duì)分析等方法確認(rèn)；為開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記和利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲 得抗病基因的全長奠定基礎(chǔ)。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用抗病基因同源序列法對(duì)絲瓜抗褐斑病基因進(jìn)行克 隆，獲得了抗褐斑病基因片段或者基因標(biāo)記3個(gè)，片段大小分別為498bp、501bp和497bp。 以該基因片段序列為基礎(chǔ)，開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，可以進(jìn)行絲瓜抗褐斑病分子標(biāo)記輔助選 擇育種；同時(shí)利用基因片段或者基因標(biāo)記進(jìn)行新的種質(zhì)資源的創(chuàng)新；結(jié)合已有的分子標(biāo)記 可以實(shí)現(xiàn)絲瓜抗褐斑病基因的分子作圖；利用這些基因片段，通過設(shè)計(jì)基因特異引物，采用 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)分離絲瓜抗褐斑病基因，為通過基因工程改良絲瓜的抗病性奠定基 礎(chǔ)；也為最終解析絲瓜抗褐斑病基因的分子機(jī)理提供了基因資源。
[0009] 本發(fā)明的積極效果：
[0010] 1)有利于快速開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。通過鑒定的絲瓜褐斑病基 因，開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標(biāo)記輔 助選擇，準(zhǔn)確性高。
[0011] 2)縮短了絲瓜抗褐斑病基因的挖掘周期，有利于褐斑病基因的快速鑒定。采用常 規(guī)方法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時(shí)耗力、效率低，且難以成功。 本發(fā)明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘絲瓜抗褐斑病基因，不僅可以縮短時(shí)間，還可 以提高褐斑病基因鑒定效率。
[0012] 3)有利于多抗性育種材料的創(chuàng)制?；谛妈b定的褐斑病基因開發(fā)的功能性分子標(biāo) 記，結(jié)合已經(jīng)定位的其他抗病基因的分子標(biāo)記，進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種 年限，提1?育種效率。
[0013] 4)為闡述絲瓜抗褐斑病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。鑒定的絲瓜抗褐斑病基因，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)等研究 抗褐斑病的分子機(jī)制提供了基因資源，有利于快速闡述絲瓜抗病毒的作用機(jī)理。
【附圖說明】
[0014] 圖1是絲瓜L30抗褐斑病基因序列；
[0015] 圖2是絲瓜L62抗褐斑病基因序列；
[0016] 圖3是絲瓜L68抗褐斑病基因序列；
【具體實(shí)施方式】
[0017] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出絲瓜抗褐斑病基因。具體實(shí)施過程如下：
[0018] 1、DNA的提?。喝∵m量的絲瓜的幼嫩葉片硅膠干燥后研磨成粉狀，用CTAB法提取 總基因組DNA。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測，選取0D260 / 0D280值在1. 8?2. 0的 樣品于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 2、抗病基因同源片段的擴(kuò)增和克?。焊鶕?jù)已知的NBS-LRR型抗病基因的保守區(qū)的 氨基酸序列 GG(L / I / V / M / S)GKTT 和 G(L/N)PL(A / T / S) (L / V)，設(shè)計(jì)了 1 對(duì)簡并 引物：NBS15，-GKTT GGlGGiwSIGGIAARACIACG-Si 和 NBS25，-GCIGCIIARIGGRTTKXHV。 取絲瓜基因組DNA50ng為模板，按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94°C預(yù)變性3min ;94°C 30s， 55 °C 30s，72 °C 30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠電泳檢測，切 下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，用天根生物公司的膠回收試劑盒，按操作說明回收 純化目的DNA片段，回收產(chǎn)物用pMD-18T CloningKit (TAKARA公司）連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上（含100mg/LAMP)，37°C培 養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落，通過PCR檢測確定含有目的片段。篩選后隨機(jī)選取10個(gè)克隆進(jìn) 行測序（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。
[0020] 3、序列分析將測序結(jié)果去除PMD18-T載體序列，得到插入片段的DNA序列。用ORF finder分析這些序列的開放閱讀框，然后通過互聯(lián)網(wǎng)用BLAST軟件（網(wǎng)址：http : // www. n cbi. nlm. nih. gov)與GenBank中登記的序列進(jìn)行同源性比較，繼而推斷這些擴(kuò)增產(chǎn)物是 否與已知的抗病基因相關(guān)。：
[0021] 以下是發(fā)明人給出的實(shí)施范例，但不局限于這些范例。
[0022] 實(shí)施范例1 :
[0023] 我們和國外農(nóng)業(yè)高校、科研院所合作，以優(yōu)良親本構(gòu)建了絲瓜的F2群體，含有118 個(gè)單株；以這些單株為試驗(yàn)材料提取DNA，根據(jù)獲得的抗褐斑病基因序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，根據(jù)特異DNA片段在群體單株中分離情況，依據(jù)絲瓜褐斑病抗病性鑒定結(jié)果， 獲得與絲瓜抗褐斑病緊密連鎖的DNA片段。
[0024] 實(shí)施范例2 :
[0025] 在種質(zhì)資源創(chuàng)制過程中，以感病親本和抗病親本雜交獲得的后代個(gè)體為對(duì)象，提 取各自的基因組DNA，根據(jù)實(shí)施范例1獲得的與褐斑病基因緊密連鎖的DNA片段設(shè)計(jì)引物， 對(duì)上述獲得的絲瓜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凡是擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)DNA特異片段的雜種材料， 抗褐斑病雜種植株，或者是抗褐斑病基因的攜帶者，這些材料科研進(jìn)一步用于抗病品種培 育的親本和育種種質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記輔助選擇。
[0026] 實(shí)施范例3 :
[0027] 我們采用人工接種和田間接種鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)上述的重組自交系群體進(jìn)行 接種鑒定，根據(jù)實(shí)施范例1獲得的與褐斑病緊密連鎖的DNA片段，設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)上述單 株個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；結(jié)合廣泛的分子標(biāo)記如AFLP、SRAP等，分析這些標(biāo)記在單株群體中的 分離情況，結(jié)合人工接種和田間接種鑒定結(jié)果，利用MAPMARKER軟件進(jìn)行絲瓜抗褐斑病基 因的分子作圖，獲得褐斑病抗病區(qū)段的遺傳圖譜，為后續(xù)克隆抗病基因奠定基礎(chǔ)。
[0028] 實(shí)施范例4 :
[0029] 應(yīng)用北京天根公司RNA提取試劑盒提取抗褐斑病親本葉片總RNA，利用cDNA合 成試劑盒合成cDNA第一鏈；將實(shí)施范例1獲得的絲瓜抗褐斑病基因片段DNA序列，設(shè)計(jì) 特異引物，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE技術(shù)）試劑盒所帶的引物相結(jié)合，分別進(jìn)行 5' RACE和3' RACE PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分別在1 %的瓊脂糖凝膠電泳獲得5' RACE和3' RACE 全長序列。分別回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行T克隆，獲得全長序列后進(jìn)行基因全長的連接；從而克 隆了絲瓜抗褐斑病基因全長，為通過基因工程改良絲瓜品種的抗病性提供了基因資源。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 絲瓜抗褐斑病基因片段或者基因標(biāo)記，其特征在于選自下列基因片段或者基因標(biāo)記 之一：
2. 權(quán)利要求1所述快速鑒定絲瓜褐斑病的應(yīng)用，包括： 1) 攜帶有上述3個(gè)基因的育種材料的創(chuàng)制或者新品種創(chuàng)制：利用權(quán)利1所給出的基因 源為親本材料，在雜交、回交后代中，可以獲得轉(zhuǎn)育有褐斑病抗性基因的育種材料。 2) 抗褐斑病基礎(chǔ)理論研究：對(duì)權(quán)利1的3個(gè)褐斑病基因進(jìn)行分子標(biāo)記分析；對(duì)該基因 進(jìn)行分子作圖或者基因定位；對(duì)該基因進(jìn)行克隆以及基因間互作分析。 3) 抗褐斑病轉(zhuǎn)基因研究：利用權(quán)利要求1所給出的3個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及到絲瓜抗褐斑病基因片段或基因標(biāo)記及應(yīng)用；主要是采用抗病基因同源序列法，快速分離絲瓜抗褐斑病基因片段或基因標(biāo)記3個(gè)，通過測序，這些基因片段或基因標(biāo)記的核苷酸長度分別為498bp、501bp和497bp。該發(fā)明有效的縮短了絲瓜抗褐斑病基因挖掘周期，有利于褐斑病基因的快速鑒定；通過鑒定的褐斑病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用于抗褐斑病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，準(zhǔn)確性高；結(jié)合其它抗病基因分子標(biāo)記可進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述絲瓜抗褐斑病基因分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104560963
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310517582
【發(fā)明人】錢孝英, 錢春桃
【申請(qǐng)人】南農(nóng)大(常熟)新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月28日