專利名稱：用于確定腎中毒的標記基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腎疾患(即，腎疾病、腎損傷或腎中毒)的監(jiān)測、預后、診斷和/或治療方法，還涉及診斷腎中毒的試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及利用基因表達分析來檢測腎疾患和/或幫助選擇或監(jiān)測各種腎疾患療法的效力。
背景技術：
研究個體在應答外源化合物或藥物時所涉及的DNA/RNA水平的遺傳和基因組因子，將允許選擇安全的藥劑(如，藥物)用于預防性或治療性治療中?？梢栽趥€體內監(jiān)測對本發(fā)明標記的表達有刺激或抑制作用的因子或調制劑來評估在患者中的腎毒性。治療物代謝的差異可通過改變藥用活性藥物的劑量和血液濃度之間的關系導致嚴重毒性或治療失敗。這樣的藥物基因組學可進一步用于確定合適的劑量和治療方案。因此，可以測定個體中本發(fā)明標記的表達水平從而選擇適當?shù)陌踩巹┯糜趯€體進行治療性或預防性處理。
藥理遺傳學(pharmacogenetic)涉及由個體體內的藥物處置和作用的差異而造成的藥物效力或毒性在臨床上的顯著不同。參閱，如，LinderMW，Clin Chem 1997，卷43(2)254-266。通常，可以區(qū)分兩種類型的藥理遺傳學狀態(tài)。以改變藥物對身體的作用途徑的單一因子形式傳遞的遺傳狀態(tài)被稱為“改變的藥物作用”。以改變身體對藥物的作用途徑的單一因子形式傳遞的遺傳狀態(tài)被稱為“改變的藥物代謝”。這些藥理遺傳狀態(tài)可以作為稀有的缺陷或常見的多態(tài)性發(fā)生。
可以測定個體中標記的表達水平或功能水平從而選擇適當?shù)乃巹┯糜趯€體進行治療或預防。將此知識用于劑量或藥物選擇時可避免不利的反應或治療失敗，由此增強用調制標記物表達的調制劑治療時的治療或預防效力。
鈣結合蛋白D-28k(calbindin D-28k)是EF-手大家族的鈣結合蛋白質成員。它存在于所有類型的脊椎動物中和各種組織中。鈣結合蛋白D-28k被推測具有鈣轉運分子的功能，該分子可以促進鈣通過細胞擴散并可以充當細胞內鈣緩沖劑以維持低于毒性水平的離子化鈣(Feher JJ，AmJ Physiol 1983，卷44C303-C307)。
許多研究者已證明了在腎中最高的鈣結合蛋白D-28k量出現(xiàn)在遠端小管，這與遠端小管作為鈣吸收位點的作用相關(Rhoten WB，等，Anat Rec1990，卷227145-151；Borke JL，等，Am J Physiol(Renal FluidElectrolyte Physiol)1989，卷257F842-F849 26)。此外，已證明的還有，隨年齡增長鈣結合蛋白D-28k表達的降低可以促成腸和腎中與年齡相關的Ca++轉運的減少(Armbrecht HJ，等，Endocrinology 1989，卷1252950-2956)。據(jù)文獻中報道，環(huán)孢菌素A-誘導的大鼠腎中鈣結合蛋白-D28k蛋白質的減少是其mRNA減少的結果(Grenet O，等，BiochemPharmacol 1998，卷55(7)1131-1133；Grenet O等，Biochem Pharmacol2000，卷59(3)267-272)。這意味著可通過PCR監(jiān)測鈣結合蛋白-D28k mRNA的水平，以反應蛋白質的水平(Steiner S等，BiochemPharmacol 1996，卷51(3)253-258)。這些發(fā)現(xiàn)證實了鈣結合蛋白D-28k在腎臟的再吸收過程中具有重要作用這一假設。
腎臟損傷分子-1(kidney injury molecular-1，KIM-1)是含有胞外6個半胱氨酸的免疫球蛋白結構域的1型膜蛋白。KIM-1 mRNA和蛋白質在正常腎中以低水平表達，但在缺血后的腎中卻顯著增加。KIM-1定位于再生的去分化近端小管上皮細胞，且在間質細胞中缺乏。缺血后腎的形態(tài)完整性和功能的恢復涉及KIM-1(Ichimura T等，J Biol Chem 1998，卷2734135-4142)。
骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，也稱作分泌的磷蛋白1(SPP1)，是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)細胞粘附基元的分泌的、高酸性且糖基化的磷蛋白。OPN最初在成骨細胞中鑒定且被證實具有結合羥磷灰石的能力且在骨吸收、礦化和鈣化中起主要作用(Reinholt FP，等，Proc NatlAcad Sci USA 1990，卷874473-4475)。隨后證實了它還定位于鈣化的動脈粥樣硬化傷口處并被認為參與抑制平滑肌細胞的鈣沉積(Wada T等，Circ Res 1999，卷84166-178)。此外，還證實高OPN表達受活性形式的維生素D3調控(Noda M等，Proc Natl Acad Sci USA 1990，卷879995-9999)并且已在高細胞更新率的組織中發(fā)現(xiàn)OPN。OPN的上調已在數(shù)種腎損傷模型中被證實，提示它有可能在組織重塑和修復中起作用(Persy VP等，Kidney Int 1999，卷56(2)601-611)。還發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白是草酸鈣尿石的主要成分(Kohri K等，Biochem Biophys Res Commun 1992，卷184859-864)。此外，OPN高表達于傾向于形成尿石的大鼠的遠端小管細胞中(Kohri K等，J Biol Chem 1993，卷26815180-15184)。從這些數(shù)據(jù)中形成這樣一種假設，即，尿石的形成中涉及骨橋蛋白(Kohri K等，J BiolChem 1993，卷26815180-15184)。
表皮生長因子(EGF)是一種小的多肽，它屬于可介導細胞生長、分化和急性期反應的一類分子。EGF mRNA主要在唾液腺和腎細胞中轉錄。在各種實驗誘導形式的急性腎衰竭中，腎EGF的mRNA和蛋白質水平顯著下降并在長時期內保持低水平(Price PM等，Am J Physiol 1995，卷268(4pt2)F664-670)。EGF是重要的上皮促細胞分裂劑。此外，已知EGF受體水平在正常大鼠腎成纖維細胞的密度依賴型生長調控中起重要作用(Lahaye DH等，F(xiàn)EBS Lett 1999，卷446(2-3)256-260)。EGF涉及急性腎損傷之后的內源性組織修復。當從外部施用給患實驗性急性腎衰竭的實驗室動物時，此生長因子加速了腎功能的恢復和解剖學上小管完整性的修復(Wang S和Hirschberg R，Nephrol Dial Transplant 1997，卷12(8)1560-1563)。而且，EGF還被認為在腎缺血性損傷后腎小管的再生中(Di Paolo S，等，Nephrol Dial Transplant 1997，卷122687-2693)和藥物誘導的腎中毒后腎組織的修復中(Morin NJ等，Am JPhysiol 1992，卷263F806-F811)起主要作用。EGF表達水平已顯示出在有慢性排斥反應或藥物誘導的腎中毒的腎移植患者中顯著下降(Di Paolo S等，NephrolDial Transplant 1997，卷122687-2693)。此外，還報道了在環(huán)孢菌素A(CsA)處理后腎中EGF表達減少(Deng JT等，Transplant Proc 1994，卷26(5)2842-2844；Yang CW等，Kindey Int 2001，卷60847-857)。
Clusterin，也稱為睪酮-抑制型前列腺信使2(TRPM-2)，是組織損傷和/或重塑時在包括腎在內的許多器官中誘導的、普遍存在的一種分泌性糖蛋白，已發(fā)現(xiàn)存在于腎小管的上皮管管腔中(Jenne DE和Tschopp J，Trends Biochem Sci 1992，卷14154-159)。它被認為涉及精子成熟、脂質轉運(通過與載脂蛋白A-I形成高密度脂蛋白復合物而參與)、膜重塑、補體級聯(lián)反應的抑制、神經變性和凋亡(Han B.H.等，Nat Med 2001，卷7338-343；Wong P等，J Biol Chem 1993，卷268，5021-5031；Wong P等，Eur J Biochem 1994，卷331917-925)。Clusterin是結合C5b-7并抑制膜攻擊復合物C5b-9產生的可溶性補體調控蛋白質。在與C5b-9和免疫沉積物相關的人和實驗性膜性腎病中已觀察到Clusterin的腎小球沉積(Yamada K等，Kidney Int 2001，卷59(1)137-146)。據(jù)推測Clusterin對于受到腎損傷干擾的細胞相互作用具有保持作用(Silkensen JR，等，JAm Soc Nephrol 1997，卷8(2)302-305)。此外，據(jù)報道CsA提高大鼠腎中Clusterin mRNA的水平(Darby IA等，Exp Nephrol 1995，卷3(4)234-239)。
α-2u球蛋白相關蛋白質(α-2u)，在人中也稱為Lipocalin2(LCN2)或嗜中性粒細胞明膠酶相關Lipocalin(NGAL)，其儲存于嗜中性粒細胞的顆粒中且與嗜中性粒細胞明膠酶相關(Kjeldsen L等，JBiol Chem 1993，卷26810425-10432)。它與小的親脂性物質結合并被認為在炎癥和胚胎發(fā)生中起作用(Bundgaard JR等，Biochem Biophys Res Commun 1994，卷2021468-1475；Cowland JB和Borregaard N，Genomics 1997，卷4517-23；Zerega B等，Eur J Cell Biol 2000，卷79，165-172)。
補體成分4(C4)由腎小管上皮細胞組成型表達且參與間質炎癥的調節(jié)(Welch TR等，Clin Immunol 2001，卷101，366-370)。其表達的下降與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中腎病活性的提高相關(Ho A等，Arthritis Rheum2001，卷442350-2357)。
血管內皮生長因子(VEGF)已知促進血管發(fā)生、增加血管的通透性，可以用作單核細胞的趨化因子，并且在糖尿病、傷口愈合、炎性反應和組織重塑中發(fā)揮作用(Benjamin LE，Am JPathol 2001，卷1581181-1184)。
腎特異的有機陰離子轉運蛋白-K1(organic anion transporter-k1，OAT-K1)，也稱為溶質載體家族21成員a4(SLC21A4)，與人的溶質載體家族21成員a3(SLC21A3)同源。OAT-K1表達于腎小管的基底外側膜并參與腎臟將藥物從血液中清除(Saito H等，JBiol Chem 1996，卷27120719-20725)。
醛縮酶A催化果糖-1，6-二磷酸轉變成甘油醛3-磷酸和二羥丙酮磷酸。它已被發(fā)現(xiàn)存在于發(fā)育的胚胎和成年肌肉中，并在成年肝、腎和腸中被抑制。醛縮酶A缺乏與肌病和溶血性貧血相關(Kishi H等，Proc Natl AcadSci U.S.A.1987，卷848623-8627；Kreuder J等，N Engl J Med 1996，卷3341100-1104)。
醛縮酶B具有與醛縮酶A相似的功能，且二者是由不同基因編碼的同工酶。不過，與醛縮酶A不同的是，醛縮酶B表達于成年肝、腎和腸中。醛縮酶B的缺乏與腎小管酸中毒和遺傳性果糖不耐癥相關(Cross NC等，Cell1988，卷53881-885；Kranhold JF等，Science 1969，卷165402-403；Mass RE等，Am J Med Sci 1966，卷251516-523)，表明醛縮酶B可能在腎中毒中起作用。
Podocin，也稱為PDCN、SRN1、nephrosis 2(特發(fā)的)，是表達于腎足細胞中的一種蛋白質，在腎小球通透性的調控中發(fā)揮作用，并可能作為質膜和細胞骨架之間的連接物。它幾乎只表達于胎兒和成年腎小球的足細胞中。諸如podocin等足細胞蛋白質的突變會導致先天性病灶性節(jié)段腎小球硬化癥(Komatsuda A等，Ren Fail.2003，卷25(1)87-93)且主要涉及類固醇抗性的腎病綜合癥。
盡管上述一些標記據(jù)推測與腎病相關，但是這些標記實際上從未單獨或聯(lián)合用作診斷劑，用于選擇劑量或藥物或確定腎病，且它們的表達水平也從未與各種腎疾患狀況聯(lián)系在一起。
然而，在腎病領域內，需要能夠選擇適當?shù)闹委熁蝾A防性藥劑、預測個體的藥物反應性表型以及為了避免副反應或治療失敗而進行劑量或藥物的選擇。
環(huán)孢菌素A(CsA；Neoral)是過去15年在器官移植中用于預防移植排斥的一種特征性免疫抑制劑。不過，CsA已顯示出會誘導腎中毒，從而導致腎移植患者中慢性的同種異體移植腎病?，F(xiàn)認為CsA-誘導的腎中毒是由以下事件聯(lián)合引起的腎臟內腎素濃度的增高(Masson J等，Kidney IntSuppl 1991，卷32，S28-S32)、TGFβ在遠曲小管上皮中的表達(LanghamRG等，Transplantation 2001，卷721826-1829)、血管平滑肌細胞中胞內鈣的增加(Masson J等，Kidney Int Suppl 1991，卷32，S28-S32)、前列環(huán)素釋放的增加(Oriji GK，Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids1999，卷61，119-123)以及腎臟內血栓烷產量的提高(Gonzalez-CorreaJA等，Thromb Res 1996，卷81367-381)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及確定個體腎中毒的方法，包括以下步驟(a)從個體采集身體樣品，(b)測定身體樣品中相應于選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、α-2u、C4、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和Podocin的一種或多種基因的基因表達水平，獲取第一套數(shù)值，和(c)將第一套數(shù)值與第二套數(shù)值進行比較，所述第二套數(shù)值相應于在與步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的基因表達水平，其中對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值低于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體正患有或正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值，指示所述個體正患有或正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，個體在接受諸如環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類或三甲雙酮等細胞毒性劑的處理。
本發(fā)明還包括用于確定個體中的腎中毒是否對治療產生反應的檢測法，包括步驟從接受藥用可接受藥劑治療腎中毒的個體獲得身體樣品，對樣品實施本發(fā)明的a)、b)和c)步驟并確定個體對藥物治療的反應性。
本發(fā)明還涵蓋了用于確定個體中的腎中毒對于治療性處理是否產生反應的另一檢測法，包括步驟從接受藥用可接受藥劑治療腎中毒的個體獲得身體樣品，進行本發(fā)明的a)、b)和c)步驟并確定個體對藥物治療的反應性。
另一方面，本發(fā)明涵蓋了治療個體腎中毒的方法，包括對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，其中所述化合物在腎臟中調節(jié)鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和/或C4中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使腎中毒的至少一種癥狀得到改善。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，個體在接受諸如環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類或三甲雙酮等細胞毒性劑的處理。
在另一方面，本發(fā)明涵蓋了鑒定用于治療腎中毒的候選藥劑的方法，包括步驟(a)使中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，(b)測定此腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值，以及(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未接受候選藥劑誘導的中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值實質性地高于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀，和/或其中對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質性地低于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀。
在另一方面，本發(fā)明涵蓋了用于鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，包括以下步驟(a)使未中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，(b)測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值，以及(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未中毒的腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值等于或大于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒，和/或其中對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值等于或小于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒。
另一方面，本發(fā)明涵蓋了比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法，包括步驟(a)將未中毒的腎組織的樣品與第一候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值，(b)將未中毒的腎組織的樣品與第二候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第二套數(shù)值，以及(c)比較第一套數(shù)值和第二套數(shù)值，其中若對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值實質性地大于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第一候選藥物對腎的細胞毒性小，和/或其中若對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質性地小于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第一候選藥物對腎的細胞毒性小。
在另一方面，本發(fā)明提供了基因多態(tài)性在腎中毒診斷中的用途，其中的基因選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4。
在另一方面，本發(fā)明包括用于診斷個體中腎中毒的試劑盒，其包含用于測定相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種標記基因的基因表達水平的手段。
在本發(fā)明的其它方面，個體在接受細胞毒性劑的處理。
本發(fā)明的最后一方面涵蓋了用于鑒定與包括腎功能、腎中毒和/或腎疾患在內的生物學過程相關的候選基因的方法，包括a)用至少一種選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的標記基因的表達水平作為輸入值進行運算以得到至少一個數(shù)值I；和b)將a)中所獲得的至少一個數(shù)值I與針對候選基因獲得的數(shù)值II進行比較。
附圖簡述

圖1描述了與腎病理學狀態(tài)相關的基因標記表達變化的進程。病理學記分定義如下1＝最小，非常少；2＝輕微的，少的；3＝中等的，中等數(shù)目的；4＝顯著的，許多的；5＝嚴重的，大數(shù)目的。
圖2描述了與經典生化終點(肌酸酐水平)相對比，腎基因表達變化的發(fā)生。病理學記分定義如下1＝最小，非常少；2＝輕微的，少的；3＝中等的，中等數(shù)目的；4＝顯著的，許多的；5＝嚴重的，大數(shù)目的。
圖3描述了用兩種待測化合物(TC1和TC2)和環(huán)孢菌素(CsA)處理的大鼠腎中相對的標記基因表達變化倍數(shù)。A.U.任意單位。
發(fā)明詳述用于本文時，詞組“腎中毒(renal toxicity)”或“腎損傷”或相似地“腎疾患”應都指突然的(急性的)或隨時間緩慢衰退的(慢性的)腎或腎臟衰竭或功能失調，它可以由許多疾病或病癥過程引發(fā)，包括(但不局限于)，對于腎中毒而言膿毒癥(感染)、休克、創(chuàng)傷、腎結石、腎感染、藥物毒性、毒藥或毒素，或注射碘化對照染料(contrast dye)后(副作用)；以及對于慢性腎中毒而言長期存在的高血壓、糖尿病、充血性心力衰竭、狼瘡或鐮狀細胞性貧血。兩種形式的腎衰竭都導致威脅生命的代謝紊亂。
詞組“身體樣品”應包括但不局限于，活組織檢查物(優(yōu)選腎臟的)和諸如血液、血漿、血清、淋巴、腦脊髓液、膽囊液(cystic fluid)、腹水、尿液、糞便和膽汁等體液。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是標記物可以在諸如血漿等體液中得到尤其好的監(jiān)測。例如，可以特別好地在血漿中測定clusterin的表達水平。
用于本文時，術語“個體”應指人、動物個體或個體群或集合。
用于本文時，術語“候選藥劑”或“候選藥物”可以是天然的或合成的分子，諸如蛋白質或其片段、抗體、小分子抑制劑或激動劑、核酸分子(如反義核苷酸)、核酶、雙鏈RNA、有機和無機化合物等等。
以絕對值表示的mRNA表達水平是按標準曲線計算的給定基因的分子數(shù)。為了進行定量測定，在各實驗中包含了cDNA(標準)的系列稀釋物，以便制備準確定量mRNA所必需的標準曲線。從標準曲線外推后得到絕對值(分子數(shù))。
用于本文時，被稱為“鈣結合蛋白-D28k”、“KIM-1”、“OPN”、“EGF”、“Clusterin”、“VEGF”、“OAT-K1”、“醛縮酶A”、“醛縮酶B”、“Podocin”、“α-2u”或“C4”的各標記物包括與下表1中所標識的標記物基本上相似的基因或基因產物(包括mRNA和蛋白質)。
術語“基本上相似”在本文中就核苷酸序列而言，最廣義地指參照核苷酸序列的對應核苷酸序列，其中該對應序列編碼的多肽具有與參照核苷酸序列所編碼的多肽基本上相同的結構和功能，例如，其中只存在不影響多肽功能的氨基酸改變。理想的情況是基本上相似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列所編碼的多肽?；旧舷嗨频暮塑账嵝蛄泻蛥⒄蘸塑账嵝蛄兄g的同一性百分率理想的狀況是至少80％，更理想的是至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，還更優(yōu)選至少99％。序列比較用Smith-Waterman序列比對運算法則進行(參閱，例如，Waterman，M.S.計算生物學入門圖譜、序列和基因組。Chapman&Hall.倫敦1995.ISBN 0-412-99391-0)。將以下參數(shù)用于1.16版本的localS程序中匹配1，錯配罰分0.33，開放缺口罰分2，延長缺口罰分2。
與參照核苷酸序列“基本上相似的”核苷酸序列還可以與參照核苷酸序列于如下條件下雜交于50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中雜交，在50℃于2XSSC、0.1％SDS中漂洗；更理想的是于50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，在50℃于1XSSC、0.1％SDS中漂洗；還更理想的是于50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，在50℃于0.5XSSC、0.1％SDS中漂洗；優(yōu)選于50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，在50℃于0.1XSSC、0.1％SDS中漂洗；更優(yōu)選于50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，在65℃于0.1XSSC、0.1％SDS中漂洗，并且仍然編碼功能上等價的基因產物。
本發(fā)明提供了一起或單獨用作或可以用作腎中毒標記的多種標記物(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)。在特別有用的實施方案中，可選擇多個這些標記并同時監(jiān)測它們的mRNA表達以提供可用于各方面的表達譜。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案中，選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2或3種，或至少5或7種，或至少9、10、11或12種標記可用于確定它們的基因表達譜。
由于每一標記可能與不同的腎病理學發(fā)現(xiàn)相關，所以可以測定與腎病理學具體相關的這些標記的基因表達譜。例如，鈣結合蛋白-D28k mRNA水平可以用作預測礦化中鈣失調的早期標志。KIM-1 mRNA水平是一般性腎損傷的標志。OPN mRNA水平是常常與腎中毒相關的巨噬細胞浸潤的早期標志和腎損傷后組織重塑的標志。EGF mRNA水平是一般性腎中毒的早期標志。Clusterin mRNA水平是免疫介導的腎中毒的早期標志。
在本發(fā)明方法更優(yōu)選的實施方案中，用以下技術評估身體樣品或腎組織中mRNA的表達RNA印跡分析、逆轉錄PCR、實時定量PCR、NASBA、TMA或任何其它可獲得的擴增技術。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，可替代地通過檢測相應于基因表達產物的蛋白質的存在評估基因表達的水平。
必須注意的是，本發(fā)明中(見下文)以絕對值表示的鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4 mRNA表達水平通常存在于大多數(shù)群體類型或物種中。不過這些數(shù)值也可能會隨各群體類型或物種而變化。因此可能必需再次測定未患腎中毒的靶群體類型或物種中各標記物的標準基因表達水平，在此水平之上或之下，適當?shù)那闆r下，可以發(fā)現(xiàn)腎中毒的癥狀。
本發(fā)明的第一個具體方面是提供確定個體腎中毒的方法，其步驟包括(a)從個體采集身體樣品，(b)測定身體樣品中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，獲取第一套數(shù)值，和(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值小于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值大于第二套數(shù)值，指示個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
本發(fā)明的另一方面提供確定個體腎中毒的方法，其步驟包括(a)從個體采集身體樣品，(b)測定身體樣品中相應于α-2u球蛋白相關蛋白質(α-2u)、補體成分4(C4)、血管內皮生長因子(VEGF)、腎特異性有機陰離子轉運蛋白-K1(OAT-K1)、醛縮酶A、醛縮酶B和Podocin中一種或多種基因的基因表達水平，以獲取第一套數(shù)值，和(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值小于第二套數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值，指示個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
本發(fā)明的再一方面提供在接受細胞毒性劑處理的個體中確定腎中毒的方法，其包括步驟(a)從所述個體采集身體樣品，(b)測定身體樣品中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterinα-2u、C4、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和Podocin中一種或多種基因的基因表達水平，以獲取第一套數(shù)值，和(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28K、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值小于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值，指示個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。所說的細胞毒性劑可以是已知對腎具有毒性的任何分子，且可以有利地選自許多例子，包括環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、氨基糖苷類、磺胺類、藤霉素、三甲雙酮，等等。如WO99/18120和WO03/033527中所述，環(huán)孢菌素可以是諸如環(huán)孢菌素A或ISAtx247等免疫抑制性環(huán)孢菌素。
對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin而言，以絕對值測定的mRNA表達水平可能低于1.0E+06，對于KIM-1、骨橋蛋白、Clusterin、α-2u和/或C4而言，它可能高于1.0E+06。對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin而言表達水平可能低于1.0E+07或低于1.0E+08，和/或對于KIM-1、骨橋蛋白、Clusterin、α-2u和/或C4而言可能高于1.0E+07或高于1.0E+08。這些數(shù)值對于某些標記基因而言可能也取決于群體類型或物種，mRNA表達水平高于或低于1.0E+09。
在此類方法的優(yōu)選實施方案中，步驟a)的個體身體樣品中mRNA表達水平如下時鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平低于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平高于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平低于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平高于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達水平高于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達水平低于3.00E+06，表明該個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，其中mRNA的表達以絕對值測定。不過這些數(shù)值可能隨各群體類型或物種而變化。因此可能必需再次測定未患腎中毒的靶群體類型或物種中各標記物的標準基因表達水平，在此水平之上或之下，適當情況下，可以發(fā)現(xiàn)腎中毒的癥狀。
也可以以相對值的形式測定鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的mRNA表達水平。不過這些數(shù)值可能隨各群體類型或物種而變化。因此可能必需再次測定未患腎中毒的靶群體類型或物種中各標記物的標準基因表達水平。當EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin的mRNA表達值至少低2倍，和/或KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4的mRNA表達值至少高2倍時，個體可能患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。與未患腎中毒的個體身體樣品中的表達相比較，EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin的表達可以低5倍和/或KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4的表達可以高5倍，表達還可以分別低或高10、20、30、40、50或60倍。
在該方法的優(yōu)選實施方案中，與第二數(shù)值相比，EGF的第一數(shù)值至少低4倍、VEGF的第一數(shù)值至少低2倍、OAT-K1的第一數(shù)值至少低2倍、醛縮酶A的第一數(shù)值至少低20倍和/或醛縮酶B的第一數(shù)值至少低2倍，和/或KIM-1的第一數(shù)值至少高20倍、OPN的第一數(shù)值至少高3倍、Clusterin的第一數(shù)值至少高7倍、α-2u的第一數(shù)值至少高50倍和/或C4的第一數(shù)值至少高3倍，說明該個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，與第二數(shù)值相比，EGF的第一數(shù)值至少低4.5倍、VEGF的第一數(shù)值至少低2.6倍、OAT-K1的第一數(shù)值至少低2.3倍、醛縮酶A的第一數(shù)值至少低26倍和/或醛縮酶B的第一數(shù)值至少低2.1倍，和/或KIM-1的第一數(shù)值至少高26倍、OPN的第一數(shù)值至少高3.9倍、Clusterin的第一數(shù)值至少高7.6倍、α-2u的第一數(shù)值至少高60倍和/或C4的第一數(shù)值至少高3.3倍，說明該個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
在本發(fā)明的另一具體方面，這些標記基因中一種或多種的表達譜可以提供有價值的分子手段用于檢測腎中毒中藥物反應性的分子基礎以及用于評估治療腎中毒的藥物的效力或它們對腎的副作用。當將細胞暴露于各種修飾條件下，諸如與藥物或其它活性分子接觸時，表達譜相對于基線譜的變化可用作這些作用的一個指征。
因此，本發(fā)明提供可用于確定個體中的腎中毒對于療法是否有反應的檢測法，包括步驟從接受藥用可接受制劑治療腎中毒的個體和未患腎中毒的個體分別獲取身體樣品，針對這些樣品進行上述方法的a)、b)和c)步驟和確定對藥物治療的反應性。
監(jiān)測藥劑(如，藥物化合物)對本發(fā)明標記物表達水平的影響可方便的應用于臨床試驗中。例如，可在接受腎病或腎中毒治療的個體的臨床試驗中監(jiān)測藥劑影響標記物表達的效力。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)測藥劑(如，興奮劑、拮抗劑、擬肽(peptidomimetic)、蛋白質、肽、核酸、小分子或其它候選藥物)治療個體的效力的方法，包括以下步驟(i)在施用該藥劑前從個體采集給藥前的樣品；(ii)檢測給藥前樣品中一種或多種選定的本發(fā)明標記物的表達水平；(iii)從個體采集一個或多個給藥后的樣品；(iv)檢測給藥后樣品中標記物的表達水平；(v)將給藥前樣品中的標記物表達水平與給藥后樣品(一個或多個)中標記物的表達水平相比較；和(vi)據(jù)此改變該藥劑施用于個體的方案。例如，可能期望修改藥劑的施用法以將標記物的表達增加至高于所檢測到的水平，即，提高該藥劑的效力?；蛘?，可能期望增加/減少該藥劑的施用以分別提高/降低該藥劑的效力。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了預防性和治療性方法用于治療患有或有危險患有腎病或腎中毒的個體?？稍谀I病的特征性癥狀顯露前施用預防性藥劑，從而阻止腎病的發(fā)生或延緩腎病的進程。適宜的治療劑例子包括，但不局限于，反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA、配體、小分子和拮抗劑。(下文有更詳細的描述)。
在特定的實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防個體腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟中鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和/或Clusterin中的一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使至少一種腎中毒癥狀得以改善。
另一方面，本發(fā)明提供了治療個體腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟中VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和/或C4中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使至少一種腎中毒癥狀得以改善。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在接受細胞毒性劑處理的個體中治療腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟中鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和/或C4中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使至少一種腎中毒癥狀得以改善。細胞毒性劑優(yōu)選選自環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類和三甲雙酮。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，用調制化合物處理后個體身體樣品中基因的mRNA表達如下時鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達高于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達低于1.50E+07、EGF的mRNA表達高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達低于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達低于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達高于3.00E+06，表明腎中毒的至少一種癥狀有所改善，其中基因的mRNA表達以絕對值測定。不過這些值可能隨各群體類型或物種而變化。
在另一具體的實施方案中，用調制化合物處理后個體身體樣品中檢測到小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或用調制化合物處理后個體身體樣品中檢測到小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，表明腎中毒的至少一種癥狀有所改善。不過這些值可能隨各群體類型或物種而變化。
在本發(fā)明的另一具體方面，借助于標記物的差異表達，可以利用這些標記物來增加對具體藥物療法在患者中的腎毒性預測的確定性。因此，本發(fā)明提供了鑒定用于治療腎中毒的候選藥劑的方法，包括以下步驟a)將中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸；b)測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，以得到第一套數(shù)值；和c)將第一套數(shù)值與和在步驟b)相同的條件下對未受候選藥劑誘導的中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)據(jù)實質上等于或大于第二數(shù)據(jù)，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)據(jù)實質上等于或小于第二數(shù)據(jù)，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了用于鑒定腎中毒治療中可用的候選藥劑的方法，包括以下步驟(a)將中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸；(b)測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，以得到第一套數(shù)值；和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未受候選藥劑誘導的中毒腎組織中相同基因進行評估得到的且相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值實質上大于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質上小于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀。
在優(yōu)選的實施方案中，中毒腎組織中鈣結合蛋白-D28k的mRNA基因表達高于5.30E+08、KIM-1的mRNA基因表達低于1.50E+07、EGF的mRNA基因表達高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA基因表達低于1.40E+08、Clusterin的mRNA基因表達低于1.90E+09和/或Podocin的mRNA基因表達高于3.00E+06，是候選藥劑改善腎中毒的一個指征，其中mRNA基因表達以絕對值測定。不過這些數(shù)值可能隨各群體類型或物種而變化。
在另一優(yōu)選實施方案中，小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，是候選藥劑改善腎中毒的一個指征。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，包括步驟a)使未中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸；b)測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未中毒的腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值實質上等于或大于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值實質上等于或小于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，包括步驟a)使未中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸；b)測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和(c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未中毒的腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值等于或大于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值等于或小于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒。
在優(yōu)選的實施方案中，在未中毒腎組織中測定到鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平高于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平低于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平低于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達水平低于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達水平高于3.00E+06，是候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒的一個指征，其中mRNA的表達以絕對值測定。不過這些數(shù)值可能可以隨各群體類型或物種而變化。
按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，與第二數(shù)值相比，小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，是候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒的一個指征。這些數(shù)值也可能隨各群體類型或物種而變化。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法，包括a)將未中毒的腎組織的樣品與第一候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一數(shù)值；和b)將未中毒的腎組織的樣品與第二候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第二數(shù)據(jù)；以及c)比較第一數(shù)值和第二數(shù)值，其中若對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值實質上小于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎的細胞毒性較小，和/或其中若對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值實質上大于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎的細胞毒性較小。
在本發(fā)明的另一具體方面，提供了比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法，包括a)將未中毒的腎組織的樣品與第一候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和b)將未中毒的腎組織的樣品與第二候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第二套數(shù)值；以及c)比較第一套數(shù)值和第二套數(shù)值，其中若對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值實質上小于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎的細胞毒性較小，和/或其中若對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質上大于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎的細胞毒性較小。
對于以上方法，即，(i)用于鑒定候選藥劑的方法，(ii)用于比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法和(iii)用于鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，一個特別優(yōu)勢是它們可以體外實行。所用的腎組織優(yōu)選從已與細胞毒性劑接觸過的培養(yǎng)腎組織或細胞獲得。腎組織還可以是患腎中毒的個體的腎樣本，但這可能限制了此類方法的廣泛的體外應用。
培養(yǎng)的腎組織或細胞可以有利地以模擬人細胞和組織病癥(優(yōu)選腎的的體內動物模型為基礎。它還可以是諸如人腎上皮293T細胞或人胚胎腎細胞系等單腎細胞或腎細胞集合。細胞毒性劑可以是已知對腎具有毒性的任何分子，且可以有利地從包括如下的許多實例中選擇環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、氨基糖苷類、磺胺類、藤霉素、三甲雙酮，等等。由于腎臟的功能特性，它對藥物的腎毒性作用特別敏感，其中所述功能特性包括a)大量的腎血流，這帶來了大量的毒素；b)在腎小球或小管上皮中大面積地接觸藥物，這使得可以實現(xiàn)對毒素的相互作用或攝??；c)腎轉移活性物質的能力，這提供了可以介導細胞攝取的特殊轉移機制；d)藥物分解，這可以發(fā)生于腎小管內并導致從非毒性母體物質形成毒性代謝物；e)腎的濃縮機制，這可以增高未被吸收產物在尿和間質中的濃度；f)正常功能所需的小管細胞的高代謝率，而這容易受到干擾。
在體外研究中，環(huán)孢菌素(如，Neoral)的濃度可在10E-11至10E-5M之間變動。不過這些值可能隨各群體的細胞類型或培養(yǎng)條件變化。
本發(fā)明再一具體的方面提供了用于診斷個體腎中毒的試劑盒，包括用于測定相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種標記基因的基因表達水平的手段。
優(yōu)選的實施方案提供了用于診斷接受細胞毒性劑處理的個體中的腎中毒的試劑盒。環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類和/或三甲雙酮是優(yōu)選的細胞毒性性劑。
在本發(fā)明一個具體的實施方案中提供了一種試劑盒，其中可以測定鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中至少2種或3種基因的基因表達水平。
在優(yōu)選的實施方案中，用于測定基因表達水平的手段包括特異于標記基因的寡核苷酸。尤其優(yōu)選以下方法RNA印跡分析、逆轉錄PCR或實時定量PCR、分支DNA、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增、核糖核酸酶保護試驗和微陣列。
另一具體的實施方案提供了一試劑盒，其中用于測定基因表達水平的手段包括至少一種對選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的標記基因所編碼的蛋白質具有特異性的抗體。抗體優(yōu)選選自多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體以及足以結合標記物的生物學功能性抗體片段。尤其優(yōu)選用于測定基因表達水平的免疫測定法。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中提供了還包括獲取個體身體樣品的手段的試劑盒。特別優(yōu)選的實施方案還包括適于容納測定基因表達水平的手段和個體的身體樣品的容器。在另一優(yōu)選的實施方案中，試劑盒還包含使用和解釋試劑盒結果的說明書。
檢測方法對于檢測從標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)獲得的mRNA轉錄物的水平，尤其有用的方法包括標記的mRNA與寡核苷酸有序陣列的雜交。這些方法使得可以同時測定多種基因的轉錄水平以產生基因表達譜或模式。在另一實施方案中?？梢詫€體樣品的基因表達譜與未患病個體的樣品的基因表達譜進行比較，從而確定個體是否患有或有危險發(fā)生腎病或腎中毒。
標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)的基因表達可以優(yōu)選以試劑盒的形式用RT-PCR(一種高流通量技術)進行評價。眾所周知的技術RT-PCR反應在PCR過程中利用AmpliTaq Gold DNA聚合酶的5’核酸酶活性切割TaqMan探針。探針由帶有5’-報道染料和3’-猝滅染料的寡核苷酸(通常約為20mer)組成。將諸如FAM(6-羧基熒光素)等熒光報道染料與寡核苷酸的5’末端共價連接。該報道分子被位于3’末端通過連接臂附著的TAMRA(6-羧基-N，N，N’，N’-四甲基羅丹明)淬滅。
用于各標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)的寡核苷酸探針應基于標記基因的核苷酸序列產生，對于本領域技術人員而言，適當?shù)墓押塑账嵝蛄械倪x擇目前是一種標準的常規(guī)技術。下表1給出了人類、大鼠和/或小鼠中標記基因序列的Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號。表1標記基因的序列
還可分析由正常細胞和疾病細胞分泌的標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)表達的蛋白質，這對于本發(fā)明的方法而言是有價值的。可分離上清液且可用MWT-CO濾器簡化蛋白質混合物。然后可用胰蛋白酶消化蛋白質。再然后用微毛細管HPLC柱分離上樣的胰蛋白酶消化的肽，直接將其洗脫入離子阱質譜儀，通過定制的電噴射離子化源。在整個梯度中，可通過對柱上洗脫下來的四種最強的離子(肽)進行片段化獲取序列數(shù)據(jù)，而從動力學上排除那些早已經片段化的肽。以這種方式，可以從多次掃描中獲取序列數(shù)據(jù)，相應于樣品中約50-200種不同蛋白質。用諸如MS-Tag等相關性分析工具在數(shù)據(jù)庫中搜索這些數(shù)據(jù)，從而鑒定上清液中標記基因的蛋白質表達。
還可通過可檢測標記的探針或可隨后標記的探針檢測標記基因所編碼的蛋白質的表達。一般而言，探針是識別表達的蛋白質的抗體。
用于此處時，術語抗體包括，但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體和足以結合蛋白質的生物學功能性抗體片段。
然后可以通過利用上述抗體的免疫測定法測定樣品中已知蛋白質的表達程度。這樣的免疫測定法包括，但不局限于點印跡、蛋白質印跡、競爭性和非競爭性蛋白質結合試驗、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫組織化學、熒光激活細胞分揀術(FACS)以及其它通常使用且在科學和專利文獻中被廣泛描述的方法，還有許多商品化應用的方法。
或者，可通過雙向凝膠電泳系統(tǒng)分離標記蛋白質(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)。雙向凝膠電泳是本領域眾所周知的的，通常包括沿著第一向進行等電聚焦隨后沿著第二向進行SDS-PAGE電泳?？捎枚喾N技術分析產生的電泳圖譜，包括質譜分析技術、蛋白質印跡以及利用多克隆和單克隆抗體進行的免疫印跡分析，還有內部和N-末端的微測序。
藥物篩選方法除了上述藥物篩選方法之外，還可用無細胞試驗鑒定能與標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)所編碼的蛋白質相互作用從而改變蛋白質或其結合配偶體活性的化合物。無細胞試驗還可用于鑒定調制編碼蛋白質和其結合配偶體(諸如靶肽)間相互作用的化合物。
在一個實施方案中，用于鑒定所說化合物的無細胞試驗包括反應混合物，其中，在存在或缺乏結合配偶體(如生物學失活的靶肽)或小分子的情況下，混合物中含有標記蛋白質(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)和待測化合物或待測化合物文庫。還可通過使用檢測表面等離子體共振(一種光學現(xiàn)象)的實時BIA(生物分子相互作用分析，PharmaciaBiosensor(AB))對分子間的相互作用進行評估?？赏ㄟ^利用可檢測標記的蛋白質諸如放射標記、熒光標記或酶標記的蛋白質或其結合配偶體，用免疫測定法或色譜檢測法檢測蛋白質和其結合配偶體之間復合物的形成。
轉錄物陣列在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中使用了“寡核苷酸陣列”(本文也稱“微陣列”)。微陣列可用于分析細胞中的轉錄情況，尤其是用于測量腎細胞的轉錄情況。
在一個實施方案中，通過將代表細胞中所存在的mRNA轉錄物的可檢測標記的多核苷酸(如，合成自全細胞mRNA的熒光標記cDNA或標記的cRNA)與微陣列雜交，產生轉錄物陣列。本發(fā)明的微陣列是具有有序排列的結合(如，雜交)位點的表面，所述位點針對至少一種標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)的產物?？梢杂枚喾N方式制備微陣列。不管用何種方式制備，微陣列共有某些特征微陣列是可復制的，從而可以制備多拷貝的給定陣列并容易進行相互間的比較。優(yōu)選小的微陣列，通常小于5cm.sup.2，且它們制備自在結合(如，核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料。微陣列中給定的結合位點或獨一無二的一套結合位點將特異結合細胞中單一基因的產物。盡管每個特定mRNA可能具有一個以上的物理結合位點(下文中的“位點”)，但為了清楚，以下的討論假設只有單一的位點。在一個特別的實施方案中，使用在各位置含有固定的已知序列核酸的可尋址定位的陣列。
應當理解，當與細胞RNA互補的cDNA被制備好并在合適的雜交條件下與微陣列雜交時，與陣列中相應于任何特定基因的位點雜交的水平將反映轉錄自此基因的mRNA在細胞中的豐度。例如，當互補于總細胞mRNA的可檢測標記(如，帶有熒光團)的cDNA或cRNA與微陣列雜交時，陣列中相應于細胞內不轉錄的基因的位點(所謂“相應于”即位點能特異結合基因的產物)將具有微弱的信號或無信號(如，熒光信號)，而相應于所編碼mRNA在細胞中豐富的基因的位點將具有相對較強的信號。
數(shù)據(jù)庫本發(fā)明還提供了建立數(shù)據(jù)庫的方法，所述數(shù)據(jù)庫中包含至少一種本發(fā)明中提及的標記物(表1)的基因表達譜。例如，各標記物的基因表達譜可存儲于數(shù)據(jù)儲存介質中，從而編譯出可以標準化表示如下標記基因譜的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，該標記基因譜單獨或聯(lián)合地鑒定特定腎病或毒性細胞。
執(zhí)行本發(fā)明分析法的可選擇使用的計算機系統(tǒng)和方法對于本領域技術人員來說是顯而易見的并旨在包括于后附權利要求中。具體而言，所附權利要求旨在包括對于本領域技術人員顯而易見的可用于實施本發(fā)明方法的可選程序結構。
本發(fā)明的一方面提供了鑒定與腎功能、腎中毒和/或腎疾患等生物學過程相關的候選基因的方法，包括a)以鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中至少一種標記基因的基因表達水平作為輸入值進行運算得到至少一個數(shù)值I；和b)將a中獲得的至少一個數(shù)值I與針對候選基因獲得的數(shù)值II進行比較。優(yōu)選的，此方法進一步包括步驟c)，其中如果步驟b中獲得的數(shù)值I以預定的關系與數(shù)值II相關，則候選基因是與生物學過程相關的。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，預定的關系是1或更大。在此方法的另一實施方案中，此預定關系是1或更小。
按照另一具體的實施方案，鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中至少一種標記基因的基因表達水平是從諸如腎組織、血液或尿液等至少一種個體身體樣品或腎細胞系獲得的。所述至少一種身體樣品在優(yōu)選的實施方案中是兩種或兩種以上不同的身體樣品，諸如腎組織和血液。在一個具體的優(yōu)選實施方案中，身體樣品或細胞系已與細胞毒性劑接觸。優(yōu)選細胞毒性劑選自環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類和三甲雙酮。
在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所說的方法是計算機可執(zhí)行的方法。
反義分子在另一實施方案中，靶RNA(優(yōu)選mRNA)種類的活性，尤其是它的翻譯速率可以通過反義核酸的可控性應用而被可控地抑制。用于本文中的“反義”核酸是指，憑借與編碼和/或非編碼區(qū)互補的一些序列，能與靶RNA的序列特異(如，非-polyA)部分(例如其翻譯起始區(qū))雜交的核酸。本發(fā)明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈、RNA或DNA的寡核苷酸或其修飾分子或衍生物，它們可以直接以可控形式施用于細胞或可以通過以足以干擾靶RNA翻譯的可控量轉錄引入的外源序列而在細胞內產生。
優(yōu)選的，反義核酸有至少6個核苷酸且優(yōu)選是寡核苷酸(6至約200個寡核苷酸)。
如上所述，可以通過各種技術將反義核苷酸投遞至體內表達所述基因的細胞中，如，直接注射入腎組織部位、在脂質體中捕獲反義核苷酸、通過將反義核苷酸與特異結合細胞表面所表達的受體或抗原的肽或抗體連接來施用定向于腎細胞的已修飾反義核苷酸。
不過，利用上文提及的遞送方法，可能難以達到足以抑制內源mRNA翻譯的細胞內濃度。因此，在替代實施方案中，將含反義核苷酸序列的核酸置于啟動子(即，起始特定基因轉錄所需的DNA序列)的轉錄控制下，從而形成表達構建體。本發(fā)明的反義核酸通過從外源序列轉錄可控地在細胞內表達。如果表達被控制在高水平，就會造成飽合的干擾或改變。
總之，可以按常規(guī)設計反義核酸，以靶向包括本文所列標記基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)在內的幾乎任何mRNA序列，而且細胞可以用編碼所說反義序列的核酸進行常規(guī)轉化或暴露于此核酸，從而表達可控有效量的或飽和量的反義核酸。這樣細胞中幾乎任何RNA的翻譯都可被改變或干擾。
小分子藥物或配體此外，通過暴露于外源藥物或配體，標記蛋白質(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)的活性也可以以可控或飽和方式被修飾或干擾。由于本發(fā)明的方法常用于測試或驗證各種藥物治療腎疾患的有效性，所以藥物暴露是修飾/干擾細胞組分(mRNA和表達的蛋白質二者)的一種重要方法。
優(yōu)選地，已知藥物只與細胞中的一種標記蛋白質相互作用且只改變那種標記蛋白質的活性，使活性增高或降低。這樣，將細胞分級暴露于不同濃度的該藥物可以造成以此標記蛋白質為輸入值的分級干擾網(wǎng)絡模型。而飽和暴露引起飽和修飾/干擾。
抗體和拮抗劑術語“拮抗劑”指在結合基因編碼的蛋白質時抑制其活性的分子。拮抗劑可以包括，但不局限于肽、蛋白質、碳水化合物和小分子。
在一個具體有用的實施方案中，拮抗劑是特異于標記物(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4)的抗體。抗體可以單獨用作治療的效應物或可以募集其它細胞以實際實施細胞殺死作用。
治療方式在用反義核苷酸治療時，所說的方法包括施用治療有效量的分離核酸分子，該分子包含衍生自上表1中至少一種標記基因的反義核苷酸序列，其中該反義核苷酸具有改變該至少一種基因的轉錄/翻譯的能力。
在用拮抗劑治療時，所說的方法包括對個體施用治療有效量的拮抗劑，所說的拮抗劑抑制或激活上表1中至少一種標記基因編碼的蛋白質。
對于包含反義核苷酸的分離核酸分子、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA或拮抗劑，“治療有效量的”指這些治療劑任一的量足以治療腎病或腎中毒。本領域技術人員有能力確定治療有效量。對于任何治療劑而言，治療有效劑量開始都可以在細胞培養(yǎng)試驗(如，腫瘤細胞的)或在動物模型中(通常為大鼠、小鼠、兔子、狗或豬)中進行估計。動物模型還可以用于確定適當?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。然后這些信息可用于確定施用于人時的有用劑量和途徑。
可用標準的藥學方法在細胞培養(yǎng)物或實驗動物中測定治療效力和毒性，如，ED50(在50％群體中有療效的劑量)和LD50(致使群體的50％死亡的劑量)。在毒性和療效之間的劑量比率是治療指數(shù)，它可以表示為LD50/ED50比率。優(yōu)選顯示出大治療指數(shù)的反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA和拮抗劑。從細胞培養(yǎng)試驗和動物試驗中獲取的數(shù)據(jù)可用于制定人使用的劑量范圍。這樣的組合物中所含的劑量優(yōu)選在包括ED50在內的低毒性或無毒性的循環(huán)濃度范圍內。劑量在此范圍內變化，取決于所用的制劑形式、患者的敏感度和施藥的途徑。
確切的劑量將由醫(yī)師根據(jù)需治療個體的相關因素確定?？梢哉{整給藥量和施藥方式以提供足夠水平的活性成分或維持期望的效果?？赡苄枰紤]的因素包括疾病的嚴重程度、個體的一般健康狀況、個體的年齡、體重和性別、飲食、施藥的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性以及對治療的耐受性/應答。
正常的給藥量可以在0.1-100000微克范圍內變化，可高達約1g總劑量，這取決于給藥的途徑。對具體劑量和投遞方法的指導在文獻中有描述，且是本領域的醫(yī)師通?？色@得的。對于核苷酸和拮抗劑，本領域的技術人員將使用不同制劑。
對于治療上的應用而言，反義核苷酸、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA(無論是包裹于脂質體中或包含于病毒載體中)和抗體優(yōu)選以含有一種或多種藥用可接受載體及此治療劑的藥物組合物形式施用。組合物可以單獨施用或與至少一種其它藥劑(諸如起穩(wěn)定作用的化合物)聯(lián)合施用，所述藥劑可以在任何無菌的、生物相容的藥用載體(包括，但不局限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水)中給藥。組合物可以單獨施用于患者或與其它藥劑、藥物或激素聯(lián)合施用。
藥物組合物可以通過許多途徑施用，包括但不局限于口服、靜脈內、肌內、關節(jié)內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下或直腸方式。除了活性成分以外，這些藥物組合物還包含包括賦形劑和助劑的在內的適宜的藥用可接受載體，它們將有利于活性化合物被加工成制藥學上可使用的制劑。
口服的藥物組合物可以用本領域眾所周知的藥用可接受載體以適于口服的劑量配制。這樣的載體使藥物組合物可配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿、混懸液，等等，便于患者攝取。
引用的文獻本文中引用的所有文獻為所有目的全文收編于此作為參考，就如同具體單獨指出為所有目的將各出版物或專利或專利申請分別地全文收編作為參考一樣。此外，本文所引的所有Gen Bank錄入號也為所有目的全部收編于此作為參考，就如同具體單獨指出為所有目的將各編號完整地收編于此作為參考一樣。
本發(fā)明并不局限于本申請所述的具體實施方案，它們只意圖作為本發(fā)明各方面的單一舉例說明。正如對本領域技術人員顯而易見的，可以不脫離本發(fā)明的精神和范圍對本發(fā)明進行許多修改和改變。除了本文所列的那些具體實施方案外，本發(fā)明范圍內的功能等價方法和設備對于本領域技術人員來說在閱讀前面的說明書和附圖后將是顯而易見的。這樣的修飾和變化也意圖落在所附權利要求的范圍內。本發(fā)明只受所附權利要求以及這些權利要求的等價方案的完整范圍的限制。
在實施本發(fā)明時，利用了分子生物學、微生物學和重組DNA方面的許多常規(guī)技術。這些技術是眾所周知的且在文獻中有描述，例如，分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第I、II和III卷，1997(F.M.Ausubel編輯)；Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Mannual)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；DNA克隆實用方法(DNA CloningA PracticalApproach)，第I和II卷，1985(D.N.Glover編輯)；寡核苷酸合成(Oligonucleotides Synthesis)，1984(M.L.Gait編輯)；核酸雜交(NucleicAcid Hybridization)，1985，(Hames和Higgins)；轉錄和翻譯(Transcriptionand Translation)，1984(Hames和Higgins編輯)；動物細胞培養(yǎng)(AnimalCell Culture)，1986(R.I.Freshney編輯)；固定化細胞和酶(ImmobilizedCells and Enzymes)，1986(IRL出版社)；Perbal，1984，分子克隆的實用指導(A Practical Guide to Molecular Cloning)；叢書，酶學方法(Methodsin Enzymology)(Academic Press，Inc.)；用于哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，冷泉港實驗室)；以及，酶學方法(Methods in Enzymology)，第154和155卷(分別由Wu和Grossman，和Wu編輯)。
實施例1為了鑒定包括環(huán)孢菌素(CsA；Neoral)在內的免疫抑制劑的毒性和效力的標記物，進行2周體內研究，之后獲取大鼠的腎樣品。CsA在臨床應用方面以及研究模型方面用作免疫抑制的參照化合物。CsA抑制T細胞激活后的早期事件，阻斷數(shù)種細胞因子的轉錄激活。
腎作為毒性的主要靶目標而被研究，利用來自Affymetrix的高密度DNA-陣列系統(tǒng)監(jiān)測所有組中的RNA表達變化。本研究的活體部分(in-lifepart)進行如下實驗動物動物種類和品系大鼠，CrlWI(GLX/BRL/HAN)IGS BR。
每組的動物數(shù)目6只雄性年齡8周(在給藥開始時)體重范圍100-300g(在給藥開始時)室內相對濕度約40-70％(目標范圍)照明周期熒光燈12小時照明/12小時黑暗周期動物籠養(yǎng)在最佳衛(wèi)生條件下將同性別的動物以組為單位養(yǎng)在IV型Macrolon籠子的無菌軟木顆粒墊(Rettenmaier&Shne，Ellwangen-Holzmühle，德國生產)上。
食物除了為臨床病理學采集血樣前的整夜外，隨意取食NAFAG，編號890，標準顆粒飼料(來自NAFAG，Gossau，SG，Switzerland)(在即時原始數(shù)據(jù)中給出批號)。
食物分析微生物污染物由供應商分析，化學污染物由供應商和RCCLtd.，Environmental chemical/pharmaceutical Analytics(Itingen，瑞士)分析。
水隨意從聚乙烯瓶中獲得當?shù)毓淖詠硭姆治鲇墒姓斁趾蚏CC Ltd.Environmental chemical/pharmaceutical Analytics(Itingen，瑞士)每年定期檢查化學和細菌污染物以符合瑞士飲用水規(guī)范。
研究中所應用的CsA濃度是組號1對照組；2處理組試驗項目Neoral-Sandimmun(CsA)劑量(mg/kg)5；體積-劑量(mL/kg)5處理期后，收集大鼠腎臟并提取總RNA。用TRIzol試劑(LifeTechnologies)按照制造商說明書從冷凍的腎中提取總RNA。通過波長260nm處的吸收值(A260nm)對總RNA定量，并通過A260nm/A280nm比率估計純度。通過變性凝膠電泳檢查完整性。將RNA儲存于-80℃待分析。
通過Superscript choice系統(tǒng)(Life Technologies)用良好質量的總RNA合成雙鏈cDNA。然后將cDNA體外轉錄(MEGAscriptTMT7試劑盒，Ambion)形成生物素標記的cRNA。接著，在45℃將12-15μg標記的cRNA與探針陣列雜交16小時。然后按照EukGE-WS2方案(Affymetrix)洗陣列，并用10μg/ml鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物(Molecular Probes)染色。信號用2mg/ml乙?；疊SA(Life Technologies)、100mM MES、1M[Na+]、0.05％Tween 20、0.005％Antiofoam(Sigma)、0.1mg/ml山羊IgG和0.5mg/ml生物素化抗體進行抗體放大且用鏈霉親和素溶液進行復染。洗后，用Gene Array掃描儀(Affymetrix)掃描陣列兩次。
分析基因組數(shù)據(jù)后，在各組中使用的實驗條件下，在各探針陣列上發(fā)現(xiàn)數(shù)個基因有大于2倍的差異表達，選擇其進行實時PCR驗證。用GeneSpringTM軟件比較處理組中的表達水平并通過聚類算法將基因分類。這些計算將基因按照它們的表達變化分開并將共有相似變化模式的基因歸為一組(分級群聚、K-means聚類)。還將特定組中的表達水平分布與總體分布進行比較并計算對于給定組屬于總體分布的概率。選擇其表達變化與病理學分級相關的基因。五種基因標記，鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin，組成了用此藥劑處理后在DNA陣列上觀察到的特異譜的一部分。
表2中所列的引物序列被用于進行實時定量PCR分析。
表2用于實時定量PCR分析的引物和探針序列
Clusterin作為標記可能特別令人感興趣，因為此基因的產物是分泌型蛋白質。事實上，用無腎毒性的化合物(A)和三種腎毒性化合物(B、C、D；表3)處理后這些動物的血清樣品的蛋白質印跡分析證實了Clusterin蛋白質水平被提高。
表3化合物(A、B、C、D)處理后Clusterin蛋白質血清水平的蛋白質印跡測量
*＝(處理樣品的平均帶體積/對照的平均帶體積)×100圖1顯示了與腎小管嗜堿粒細胞增多(kidney tubular basophilia)相關的基因標記物(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)表達改變(倍數(shù)變化)進展。為了進行比較，在圖2中顯示了肌酸酐(一種經典標記物)排泄的發(fā)展，以便說明本文件中所述新基因標記物(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)受到更大的影響，因而與腎中毒有更緊密的聯(lián)系并由此更相關和更有價值。
實施例2在向大鼠給藥14天和42天的時候，開始進行非臨床研究以確立待測化合物(TC1)的毒理學效應。設計本研究來評估待測化合物的潛在腎毒性。
通過管飼法將環(huán)孢菌素A(CsA；Neoral)安慰劑微乳化預濃縮物中溶液形式的待測化合物通過口服途徑給予IGS WistarHannover[CrlWI(Glx/BRL/Han)IGS BR]大鼠組(N＝5/性別/組)，劑量分別為20mg/kg/天、60mg/kg/天共14天以及10mg/kg/天、25mg/kg/天共42天。另有一組大鼠(雄性)接受5mL/kg等價給藥體積的賦形藥(CsA(Neoral)安慰劑微乳化預濃縮物)并用作對照。在開始給藥時，動物約8周齡。在尸體解剖當天收集腎臟樣品。
通過PCR監(jiān)測本發(fā)明中所述的基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)，這些基因一起或單獨用作腎中毒的標記，從而允許評估待測化合物的腎毒性。
只以本發(fā)明所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)的表達監(jiān)測為基礎，就可以在進行腎顯微鏡載片病理檢查前推斷出待測化合物對腎的毒性作用比CsA(20mg/kg/天)低，如5種基因標記物的表達所顯示的，其僅對腎造成輕微的損傷。不過在與CsA表達譜進行比較后，這種腎中毒看上去特異于該待測化合物。此外，在以10mg/kg/天的劑量處理42天后，本發(fā)明中所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)的基因表達譜未顯示出顯著的腎中毒(圖3)。在此圖中，“相對于對照的倍數(shù)變化”為處理組中本發(fā)明所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)的分子個數(shù)除以相應對照組中本發(fā)明所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)的分子個數(shù)。
這些結論稍后得到了驗證并證實了通過監(jiān)測本發(fā)明所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)的表達所做的預測是有效的。待測化合物的腎毒性的特征為小管胞質空泡形成(它不同于通過監(jiān)測本發(fā)明所述基因(鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin)早期預測的CsA-誘發(fā)的腎中毒)。
實施例3通過口服管飼法用環(huán)孢菌素A衍生物(TC3)以5或20mg/kg/天的劑量每天處理大鼠一次，共2周。然后收集腎臟并用實時定量PCR分析法利用表4中所列引物序列測量Podocin表達。表5顯示了Podocin基因在用TC3處理的大鼠中的表達。
表4用于實時定量PCR分析的引物和探針序列
表5Podocin mRNA水平的PCR測量
大鼠展示了與同等劑量CsA處理后所觀察到的結果相似的腎副作用，因此TC3(20mg/kg/天)是對腎臟有毒的。
實施例4為了(a)研究環(huán)孢菌素A(CsA，Neoral)所引起的藥物誘導的腎中毒的機制和(b)鑒定基因表達模式以確定可以作為腎中毒潛在早期標志的特定基因(和它們的蛋白質產物)，利用環(huán)孢菌素A進行了2周的大鼠研究。通過口服管飼法以5或20mg/kg/天的劑量給雄性大鼠(CrlWist Han株系)每天喂食環(huán)孢菌素A一次，共2周。然后收獲腎臟并用TRIzol試劑(LifeTechnologies)按制造商說明書從冷凍組織中提取總RNA。通過波長260nm處的吸收值(A260nm)對總RNA定量，并通過A260nm/A280nm比值估計純度。通過變性凝膠電泳檢查完整性。將RNA儲存于-80℃待分析。用Superscript Choice系統(tǒng)(Life Technologies)對RNA進行逆轉錄。然后將DNA體外轉錄(MEGAscriptTMT7試劑盒，Ambion)形成生物素標記的cRNA。隨后，將標記后的cRNA與GeneChipTM探針陣列(大鼠陣列RU34A)雜交。按制造商說明書進行與探針陣列的雜交、洗滌、染色和掃描。用Affymetrix RU34A大鼠基因芯片分析RNA表達譜。
用Compare和GeneChip分析程序進行表達譜分析。用運算法則1，平均信號對平均信號，進行比較分析，列出具有±2.5倍或更高比值的基因。用SigmaStat2.03進行統(tǒng)計分析。將所有為負值的原始平均差異值調整為1。對于表6中所列的基因而言，不同處理組間的總體差異在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
表6通過Affymetrix RU34A大鼠基因芯片測量的KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u、C4、EGF前體、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B的RNA表達譜
通過環(huán)孢菌素A(CsA)處理上調的基因腎臟損傷分子-1(KIM-1)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著上調的一種基因是腎臟損傷分子-1(KIM-1)(探針對AF035963_at)。如表6中所示，與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中誘發(fā)了26倍的KIM-1表達(p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對KIM-1的誘導。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的KIM-1表達改變在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.004)。
骨橋蛋白(OPN)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著上調的第二基因是骨橋蛋白(OPN)(探針對M14656_at)。如表6中所示，與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中誘導了3.9倍的骨橋蛋白表達(p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對骨橋蛋白的誘導。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的骨橋蛋白表達改變在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
Clusterin/睪酮-抑制型前列腺信使2(TRPM-2)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著上調的第三基因是Clusterin，也稱為睪酮-抑制型前列腺信使2(TRPM-2)(探針對M64733mRNA_s_at)。與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中誘導了7.6倍的Clusterin表達(表6；p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對Clusterin的誘導。與CsA(20mg)相比，CsA(5mg)引起的Clusterin表達改變在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
α-2u球蛋白相關蛋白質(α-2u)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著上調的第四基因是α-2u球蛋白相關蛋白質(α-2u)(探針對rc_A946503_at)，人體中也稱為Lipocalin2(LCN2)或嗜中性粒細胞明膠酶相關Lipocalin(NGAL)。與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中誘導了60倍的α-2u表達(表6；p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對α-2u的誘導。與對照以及CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的C-2u表達改變在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
補體成分4(C4)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著上調的第五基因是補體成分4(C4)(探針對U42719_at)。與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中誘導了3.3倍的C4表達(表6，p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對C4的顯著誘導。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的C4表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
通過環(huán)孢菌素A(CsA)處理下調的基因表皮生長因子(EGF)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著下調的第一基因是表皮生長因子(EGF)(探針對X12748cds_s_at)。與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠顯示出EGF表達下降4.5倍(表6，p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到EGF表達的顯著變化。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的EGF表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＝0.004)。
血管內皮生長因子(VEGF)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著下調的第二基因是血管內皮生長因子(VEGF)(探針對rc_AA850734_at)。與對照大鼠相比，用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中VEGF被抑制了2.6倍(表6，p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到對VEGF的顯著抑制。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的VEGF表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
腎特異性有機陰離子轉運蛋白-K1(OAT-K1)已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著下調的第三基因是腎特異性有機陰離子轉運蛋白-K1(OAT-K1)(探針對D79981_at)，也稱為溶質載體家族21成員a4(SLC21A4)。與對照大鼠相比，在用20mg/kg/天劑量的CsA處理的大鼠中OAT-K1的表達被抑制了2.3倍(表6，p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到OAT-K1表達的顯著變化。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的OAT-K1表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜＝0.019)。
醛縮酶A已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著下調的第四基因是醛縮酶A(探針對U20643_at)。與對照大鼠相比，在用20mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中醛縮酶A的表達被抑制了26倍(表6；p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到醛縮酶A表達的顯著變化。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的醛縮酶A表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜＝0.042)。
醛縮酶B已發(fā)現(xiàn)用20mg/kg/天劑量CsA處理能顯著下調的第五基因是醛縮酶B(探針對X02284_at)。與對照大鼠相比，在用20mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中醛縮酶B的表達被抑制了2.1倍(表6；p＜0.001)。在用5mg/kg/天劑量CsA處理的大鼠中未檢測到OAT-KI表達的顯著變化。與CsA(5mg)相比，CsA(20mg)引起的醛縮酶B表達變化在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。
權利要求
1.確定個體腎中毒的方法，包括a)從所說個體獲取身體樣品，b)測定身體樣品中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，獲得第一套數(shù)值，和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值小于第二數(shù)值是步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感的一個指征，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值是步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感的一個指征。
2.權利要求1的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中的至少2種或3種基因。
3.確定個體腎中毒的方法，包括a)從所說個體獲取身體樣品，b)測定身體樣品中相應于α-2u球蛋白相關蛋白質(α-2u)、補體成分4(C4)、血管內皮生長因子(VEGF)、腎特異性有機陰離子轉運蛋白-K1(OAT-K1)、醛縮酶A、醛縮酶B和Podocin中一種或多種基因的基因表達水平，獲得第一套數(shù)值，和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值小于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
4.權利要求3的方法，其中在步驟b)和c)中使用VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
5.權利要求1或3的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
6.在接受細胞毒性劑處理的個體中確定腎中毒的方法，包括a)從所說個體獲取身體樣品，b)測定身體樣品中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、α-2u、C4、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和Podocin中一種或多種基因的基因表達水平，獲得第一套數(shù)值，和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未患腎中毒的個體的身體樣品中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k、EGF、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值小于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，和/或其中對于KIM-1、OPN、Clusterin、α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值大于第二數(shù)值，指示步驟a)的個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
7.權利要求6的方法，其中細胞毒性劑選自環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類和三甲雙酮。
8.權利要求6或7的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中步驟b)的個體身體樣品中鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平低于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平高于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平低于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平高于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達水平高于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達水平低于3.00E+06，表明個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感，其中mRNA的表達水平以絕對值表示。
10.權利要求1至8中任一項的方法，其中EGF的至少4倍抑制、VEGF的至少2倍抑制、OAT-K1的至少2倍抑制、醛縮酶A的至少20倍抑制和/或醛縮酶B的至少2倍抑制，和/或其中KIM-1的至少20倍誘導、OPN的至少3倍誘導、Clusterin的至少7倍誘導、α-2u的至少50倍誘導和/或C4的至少3倍誘導，指示所說個體患有腎中毒、正在形成腎中毒或對腎中毒敏感。
11.權利要求1至10中任一項的方法，其中通過檢測相應于基因表達產物的蛋白質的存在評估基因表達的水平。
12.用于確定個體中的腎中毒是否對治療有反應的檢測法，包括步驟對來自接受藥用可接受制劑治療腎中毒的個體的身體樣品實施權利要求1至11中任一項所述的a)、b)和c)步驟并確定個體對藥物治療的反應性。
13.治療個體腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟內鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和/或Clusterin中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使腎中毒的至少一種癥狀得到改善。
14.權利要求13的方法，其中在用調制化合物治療后，按照權利要求1、2或5至8之任一項的方法測定個體的腎中毒，其中個體身體樣品中的基因mRNA表達水平為鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平高于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平低于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平低于1.40E+08和/或Clusterin的mRNA表達水平低于1.90E+09，表明腎中毒的至少一種癥狀得到改善，其中基因的mRNA表達水平以絕對值表示。
15.治療個體腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟內VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和/或C4中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使腎中毒的至少一種癥狀得到改善。
16.權利要求13或15的方法，其中在用調制化合物治療后，按照權利要求1至11之任一項的方法測定個體的腎中毒，其中小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，表明腎中毒的至少一種癥狀得以改善。
17.在接受細胞毒性劑處理的個體中治療腎中毒的方法，包括步驟對所說的個體施用治療有效量的調制化合物，所述化合物調節(jié)腎臟內鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和/或C4中一種或多種基因或基因表達產物的合成、表達或活性，從而使腎中毒的至少一種癥狀得以改善。
18.權利要求17的方法，其中細胞毒性劑選自環(huán)孢菌素、順氯氨鉑、藤霉素、氨基糖苷類、磺胺類和三甲雙酮。
19.鑒定用于治療腎中毒的候選藥劑的方法，包括如下步驟a)將中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，b)測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值，和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未受候選藥劑誘導的中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值實質上高于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值實質上小于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀。
20.權利要求19的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中的至少2種或3種基因。
21.鑒定用于治療腎中毒的候選藥劑的方法，包括如下步驟a)將中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，b)測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值，和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未受候選藥劑誘導的中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值實質上高于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質上低于第二數(shù)值，指示候選藥劑改善腎中毒癥狀。
22.權利要求21的方法，其中在步驟b)和c)中使用VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
23.權利要求19或21的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
24.權利要求19、20或23的方法，其中中毒腎組織中mRNA基因表達水平為鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平高于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平低于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平低于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達水平低于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達水平高于3.00E+06，指示候選藥劑改善腎中毒，其中mRNA基因表達水平以絕對值表示。
25.權利要求19至23中任一項的方法，其中小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，是候選藥劑改善腎中毒的一個指征。
26.權利要求19至25中任一項的方法，其中通過檢測相應于基因表達產物的蛋白質的存在評估基因表達的水平。
27.用于鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，包括以下步驟a)使未中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，b)測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值等于或大于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒，和/或其中對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)值等于或小于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒。
28.權利要求27的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中的至少2種或3種基因。
29.用于鑒定不會引起或誘發(fā)腎中毒的候選藥劑的方法，包括以下步驟a)使未中毒的腎組織的樣品與候選藥劑接觸，b)測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和c)將第一套數(shù)值與在和步驟b)相同的條件下對未中毒腎組織中相同基因進行評估得到的相應于基因表達水平的第二套數(shù)值進行比較，其中對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)值等于或大于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒，和/或其中對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值等于或小于第二數(shù)值，指示候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒。
30.權利要求29的方法，其中在步驟b)和c)中使用VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
31.權利要求27或29的方法，其中在步驟b)和c)中使用鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中的至少2種或3種基因。
32.權利要求27、28或31的方法，其中在未中毒腎組織中測定到鈣結合蛋白-D28k的mRNA表達水平高于5.30E+08、KIM-1的mRNA表達水平低于1.50E+07、EGF的mRNA表達水平高于2.80E+08、骨橋蛋白的mRNA表達水平低于1.40E+08、Clusterin的mRNA表達水平低于1.90E+09和/或Podocin的mRNA表達水平高于3.00E+06，是候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒的一個指征，其中mRNA表達水平以絕對值表示。
33.權利要求27至31之任一項的方法，其中與第二數(shù)值相比，小于4倍的EGF基因表達阻抑、小于2倍的VEGF基因表達阻抑、小于2倍的OAT-K1基因表達阻抑、小于20倍的醛縮酶A基因表達阻抑和/或小于2倍的醛縮酶B基因表達阻抑，和/或小于20倍的KIM-1基因表達誘導、小于3倍的OPN基因表達誘導、小于7倍的Clusterin基因表達誘導、小于50倍的α-2u基因表達誘導和/或小于3倍的C4基因表達誘導，是候選藥劑不會引起或誘發(fā)腎中毒的一個指征。
34.權利要求27至33之任一項的方法，其中通過檢測相應于基因表達產物的蛋白質的存在，評估基因表達的水平。
35.權利要求27至34之任一項的方法，其中所述方法體外實施，且中毒腎組織獲自在細胞毒性條件下與細胞毒性劑接觸的培養(yǎng)腎組織。
36.權利要求27至35之任一項的方法，其中中毒腎組織是患腎中毒的個體的腎臟樣品，所說的樣品具有礦化損傷、纖維化損傷、小管損傷(tubulardamages)、浸潤損傷、壞死損傷或任何其它類型的導致腎功能失調的損傷。
37.比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法，包括以下步驟a)將未中毒的腎組織的樣品與第一候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和b)將未中毒的腎組織的樣品與第二候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin中一種或多種基因的基因表達水平，得到第二套數(shù)值；和c)比較第一套數(shù)值和第二套數(shù)值，其中若對于鈣結合蛋白-D28k和/或EGF基因表達而言，第一數(shù)值實質上小于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎具有較小的細胞毒性，和/或其中若對于KIM-1、骨橋蛋白和/或Clusterin基因表達而言，第一數(shù)據(jù)實質上大于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎具有較小的細胞毒性。
38.比較兩種候選藥物的腎細胞毒性潛力的方法，包括以下步驟a)將未中毒的腎組織的樣品與第一候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第一套數(shù)值；和b)將未中毒的腎組織的樣品與第二候選藥物接觸，并測定腎組織中相應于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種基因的基因表達水平，得到第二套數(shù)值；和c)比較第一套數(shù)值和第二套數(shù)值，其中若對于VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B和/或Podocin基因表達而言，第一數(shù)據(jù)實質上小于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎具有較小的細胞毒性，和/或其中若對于α-2u和/或C4基因表達而言，第一數(shù)值實質上大于第二數(shù)值，則指示第二候選藥物比第二候選藥物對腎具有較小的細胞毒性。
39.前述權利要求的方法，其中通過選自以下的技術檢測mRNA的表達水平RNA印跡分析、逆轉錄PCR和實時定量PCR、分支DNA、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增、核糖酶保護試驗或者目前可用或將來可用于基因表達分析的任何其它方法。
40.基因多態(tài)性在腎中毒診斷中的用途，其中所述基因選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF和Clusterin。
41.基因多態(tài)性在腎中毒診斷中的用途，其中所述基因選自VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4。
42.基因多態(tài)性在腎中毒診斷中的用途，其中所述基因選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4。
43.診斷個體腎中毒的試劑盒，其包含用于測定相應于鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中一種或多種標記基因的基因表達水平的手段。
44.權利要求43的試劑盒，其中個體接受細胞毒性劑處理。
45.權利要求43或44的試劑盒，其中可以測定鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4中至少2種或3種標記基因的表達。
46.權利要求43至45之任一項的試劑盒，其中用于測定基因表達水平的手段包括特異于標記基因的一種或多種寡核苷酸。
47.權利要求43至46之任一項的試劑盒，其中用于測定基因表達水平的手段包括選自如下的方法RNA印跡分析、逆轉錄PCR和實時定量PCR、分支DNA、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增、核糖酶保護試驗和微陣列。
48.權利要求43至45之任一項的試劑盒，其中用于測定基因表達水平的手段包括至少一種特異于選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的標記基因編碼的蛋白質的抗體。
49.權利要求48的試劑盒，其中抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體、和足以與標記物結合的生物學功能性抗體片段。
50.權利要求48或49的試劑盒，其中用于測定基因表達水平的手段包括免疫測定法。
51.權利要求43至50之任一項的試劑盒，還包含用于獲取個體身體樣品的手段。
52.權利要求43至51之任一項的試劑盒，還包含容器，所述容器適于容納用于測定基因表達水平的手段和個體身體樣品。
53.權利要求43至52之任一項的試劑盒，還包含使用和解釋試劑盒結果的說明書。
54.用于鑒定與包括腎功能、腎中毒和/或腎疾患在內的生物學過程相關的候選基因的方法，包括以下步驟a)用選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的至少一種標記物的基因表達水平作為輸入值進行運算以獲得至少一個數(shù)值I；b)將a)中所獲得的至少一個數(shù)值I與針對候選基因獲得的數(shù)值II進行比較。
55.權利要求54的方法，還包括步驟c)，其中若步驟b)中獲得的數(shù)值I以預定關系與數(shù)值II相關，則候選基因與所述生物學過程相關。
56.權利要求54或55的方法，其中所述預定關系是1或更大。
57.權利要求54或55的方法，其中所述預定關系是1或更小。
58.權利要求54至57之任一項的方法，其中選自鈣結合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α-2u和C4的至少一種標記物的基因表達水平從諸如腎組織、血液或尿液等不同個體身體樣品或從諸如腎細胞系等細胞系獲得。
59.權利要求54至58之任一項的方法，其中身體樣品或細胞系已與細胞毒性劑接觸。
60.權利要求54至59之任一項的方法，其中所述方法是計算機可執(zhí)行的方法。
全文摘要
本申請公開了在腎中毒出現(xiàn)前以及用組織病理學檢查證實前快速準確的讀出腎中毒的方法。最終此方法應可用于初期的化合物篩選。為了根據(jù)預期的一般性腎毒性對新化合物進行表征和分級，鑒定的12種基因，即，鈣結合蛋白－D28k、KIM－1、OPN、EGF、Clusterin、VEGF、OAT－K1、醛縮酶A、醛縮酶B、Podocin、α－2u和C4，被分組并最終可以以試劑盒的形式利用高流通量技術PCR進行評估。本申請還公布了用于鑒定在腎病治療中有用的藥劑的方法、用于監(jiān)測腎病治療效力的方法和包含所公布基因的序列的腎特異性載體，以及用于鑒定與包括腎功能在內的生物學過程相關的候選基因的方法。
文檔編號G01N33/68GK1688715SQ03818783
公開日2005年10月26日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權日2002年7月4日
發(fā)明者S-D·希布, O·格勒內, G·英伯特, J·克倫, F·施泰特勒, C·D·沃爾夫岡 申請人:諾瓦提斯公司