瓠瓜抗炭疽病基因片段或基因標記及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明是利用抗病基因同源序列方法，克隆瓠瓜抗炭疽病基因片段或者將其轉化 為分子標記等，主要涉及瓠瓜常規(guī)雜交育種，利用分子標記輔助育種，抗炭疽病基因的定位 和分子作圖，抗炭疽病基因的克隆以及抗病基因的調控機理分析等方面，屬于植物生物技 術科學領域。
【背景技術】
[0002] 炭疽病是瓠瓜生產上最重要的病害之一。幼苗染病，子葉邊緣產生稍凹陷的圓形 或橢圓形黃褐色病斑，邊緣明顯，病部粗糙。成株期葉片染病，初始產生水漬狀圓形斑，稍凹 陷，擴大后直徑約2?3厘米，逐漸變?yōu)楹稚⒕咄妮喖y，病斑邊緣明顯，逐漸變?yōu)榈S 色近圓形；天氣干燥時病斑中央容易破裂穿孔，高濕條件下病部流出粉紅色粘稠物（即病 菌的分生孢子）。葉柄、莖蔓染病，初始產生淡褐色長橢圓形的條斑，稍凹陷。瓜條染病，初 始產生暗綠水漬狀病斑，隨后變?yōu)楹稚?，凹陷明顯；高濕條件下，病斑上產生粉紅色粘著物， 失去商品價值。
[0003] 瓠瓜炭疽病由真菌半知菌亞門葫蘆科刺盤孢侵染引起。病菌以菌絲體和擬菌核隨 病殘體遺留在土壤中或潛伏在種皮內越冬。翌年春季條件適宜時產生分生孢子盤，并產生 大量的分生孢子，成為初侵染源。病菌借助風雨、灌溉水、農事操作等傳播，引起再侵染。種 子調運可造成遠距離傳播。田間發(fā)病適溫在20?27°C，病菌最適生長溫度24°C，空氣相對 濕度大于95%，葉片有露珠時有利于發(fā)病，適宜的溫濕度潛育期僅需3天。土壤粘性、排水 不良、偏施氮肥、保護地光照不足、通風不及時的瓜地發(fā)病重。浙江及長江中下游地區(qū)黃瓜 炭疽病多在保護地栽培中發(fā)生，發(fā)病盛期在5?6月和9?10月。炭疽病嚴重影響了瓠瓜 植株的正常的生長發(fā)育過程，給生產帶來極大的經濟損失?？共』虻睦眉翱共∮N是 瓠瓜病害防治最有效的方法。
[0004] 二十世紀四十年代，Flor提出了經典的"基因對基因"理論學說，即植物和病原 菌體內各自存在一個顯性基因，植物抗病基因或病菌無毒性（Avr)基因的缺失或改變都能 引起病害的產生。這個模型適用于大多數活體營養(yǎng)型病原菌，包括病毒、細菌、真菌和線蟲 類。"基因對基因"抗病性一般是受體被作為模型：植物抗病蛋白能夠直接或間接的識別源 自病菌的Avr產物。一旦這種識別發(fā)生，就會引起防御反應。大多數抗病基因 （Resistance gene ;R)觸發(fā)的抗性與快速防御反應相關，稱為過敏性反應（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多數抗病基因的產物都含有蛋白識別的結構域，如富含亮氨酸的重復單位 (LRR)的結構域或卷曲螺旋（CC)的結構域；信號轉導結構域，如核苷酸結合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)結構域。一些抗病基因產物被預測為細胞質蛋白，而另一些通過一個跨膜結 構域（TM)貫穿細胞膜。這些結構域組合能夠產生不同類型的R蛋白。根據結構的特性已 經鑒定出至少六種不同類型的 R 基因：I) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6) PK-PK。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物體內存在的最大一類抗病基因；這些抗病基因 在結構上的保守性為我們利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因帶來了潛在 可能。在已知分離獲得的抗病基因中，小麥抗葉銹病基因 LrlO和馬鈴薯抗馬鈴薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的經典例子，說明利用該法克隆抗病基 因是可行的。

【發(fā)明內容】

[0005] 技術問題
[0006] 本發(fā)明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鑒定瓠瓜炭疽病基因片段或者將 其轉化為分子標記及應用。結果一方面可用于瓠瓜抗炭疽病分子標記輔助選擇育種，另一 方面也為抗炭疽病基因的克隆提供參考依據。
[0007] 技術方案
[0008] 本發(fā)明前期對大量瓠瓜種質資源進行抗病性篩選，在獲得高抗瓠瓜炭疽病抗病種 質的基礎上，應用抗病基因同源序列法克隆抗炭疽病基因片段，通過與已知抗病基因同源 性及序列比對分析等方法確認；為開發(fā)相應的分子標記和利用cDNA末端快速擴增技術獲 得抗病基因的全長奠定基礎。
[0009] 為了實現上述目標，本發(fā)明采用抗病基因同源序列法對瓠瓜抗炭疽病基因進行克 隆，獲得了抗炭疽病基因片段或者基因標記2個，片段大小分別為495bp和510bp。以該基 因片段序列為基礎，開發(fā)相應的分子標記，可以進行瓠瓜抗炭疽病分子標記輔助選擇育種； 同時利用基因片段或者基因標記進行新的種質資源的創(chuàng)新；結合已有的分子標記可以實現 瓠瓜抗炭疽病基因的分子作圖；利用這些基因片段，通過設計基因特異引物，采用cDNA末 端快速擴增技術分離瓠瓜抗炭疽病基因，為通過基因工程改良瓠瓜的抗病性奠定基礎；也 為最終解析瓠瓜抗炭疽病基因的分子機理提供了基因資源。
[0010] 本發(fā)明的積極效果：
[0011] 1)有利于快速開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標記。通過鑒定的瓠瓜炭疽病基 因，開發(fā)相應的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標記輔 助選擇，準確性高。
[0012] 2)縮短了瓠瓜抗炭疽病基因的挖掘周期，有利于炭疽病基因的快速鑒定。采用常 規(guī)方法（圖位克隆、轉座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。 本發(fā)明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘瓠瓜抗炭疽病基因，不僅可以縮短時間，還可 以提高炭疽病基因鑒定效率。
[0013] 3)有利于多抗性育種材料的創(chuàng)制?；谛妈b定的炭疽病基因開發(fā)的功能性分子標 記，結合已經定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種 年限，提1?育種效率。
[0014] 4)為闡述瓠瓜抗炭疽病分子機制奠定了基礎。鑒定的瓠瓜抗炭疽病基因，通過轉 基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術等研究 抗炭疽病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述瓠瓜抗病毒的作用機理。
【附圖說明】
[0015] 圖1是瓠瓜A25抗炭疽病基因序列；
[0016] 圖2是瓠瓜A34抗炭疽病基因序列；
【具體實施方式】
[0017] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出瓠瓜抗炭疽病基因。具體實施過程如下：
[0018] 1、DNA的提?。喝∵m量的瓠瓜的幼嫩葉片硅膠干燥后研磨成粉狀，用CTAB法提取 總基因組DNA。提取的DNA用紫外分光光度計檢測，選取0D260/0D280值在1. 8?2. 0的樣 品于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 2、抗病基因同源片段的擴增和克隆：根據已知的NBS-LRR型抗病基因的保守 區(qū)的氨基酸序列GG (L/I/V/M/S) GKTT和G (L/N) PL (A/T/S) (L/V)，設計了 1對簡并引物： NBS15，-GKTTGGlGGiwSIGGIAARACIACG-Si 和 NBS25，-GCIGCIIARIGGRTTKXHV。取瓠 瓜基因組DNA50ng為模板，按下列程序進行PCR擴增反應：94°C預變性3mirn ;94°C 30s， 55 °C 30s，72 °C 30s，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸5min。PCR產物經瓊脂糖膠電泳檢測，切 下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，用天根生物公司的膠回收試劑盒，按操作說明回收 純化目的DNA片段，回收產物用