一種能夠生產(chǎn)人神經(jīng)生長因子的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)而生產(chǎn)人神經(jīng)生長因子的方法，屬于分子遺傳 學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)生長因子（NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有 神經(jīng)元營養(yǎng)和促突生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神 經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。NGF包含α、β、 Y三個亞單位，活性區(qū)是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而 成的二聚體。目前，臨床使用的NGF多為動物（小鼠）基因表達(dá)產(chǎn)物，雖然NGF的生物效應(yīng) 無明顯的種間特異性，但是有研究表明人的NGF具有顯著高于鼠源NGF的生物學(xué)活性。因 此，采用人NGF用于臨床治療具有鼠源NGF無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前有采用重組方法生產(chǎn)的 人NGF的報道。但是由于NGF分子結(jié)構(gòu)的特殊性，很難獲得具有生物學(xué)活性的重組人NGF。 也有通過轉(zhuǎn)基因的方法使人NGF在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)的技術(shù)，但是外源基因在小鼠的基 因組中是隨機(jī)整合，其表達(dá)水平變化比較大。另外，在純化過程中，會同時獲得人NGF和鼠 NGF，因此純度達(dá)不到要求。
[0003] 基因敲入技術(shù)是一項(xiàng)利用同源重組的原理，在小鼠的胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）中定 位整合外源基因，使外源基因可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)的技術(shù)，在外源基因定位整合的同時，可 以將整合位點(diǎn)小鼠的內(nèi)源基因完整或者部分取代，成為一種特定基因人源化的轉(zhuǎn)基因小鼠 模型。目前這種技術(shù)已經(jīng)用于基因表達(dá)調(diào)控的研究
[0004] 目前利用基因敲入技術(shù)已獲得多種特定基因人源化的基因敲入小鼠模型。例如 人alpha-珠蛋白的基因敲入模型。通過分別在人alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端 連接小鼠 alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端DNA序列，構(gòu)建同源重組載體，然后將載體 導(dǎo)入小鼠的ES細(xì)胞，載體上的小鼠 alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端DNA序列和小鼠 染色體上的alpha-珠蛋白基因 5' -端和3' -端DNA序列發(fā)生2次同源重組，從而將人的 alpha-珠蛋白基因序列定位整合在小鼠的alpha-珠蛋白基因位置上，同時將小鼠內(nèi)源性 的alpha-珠蛋白基因刪除。這樣，小鼠的紅細(xì)胞中就可以表達(dá)人的alpha-珠蛋白基因，其 表達(dá)水平與小鼠內(nèi)源性alpha-珠蛋白基因的表達(dá)相當(dāng)。
[0005] 如果通過基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因組中定位替換鼠的NGF 基因，可以使人NGF基因在小鼠內(nèi)源性NGF的表達(dá)調(diào)控序列控制下表達(dá)，在純化時也不會有 鼠源NGF的污染。但是利用常規(guī)基因敲入技術(shù)獲得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困難或 風(fēng)險，例如，在基因敲入的過程中需要在ES內(nèi)發(fā)生2次同源重組，經(jīng)過2次篩選，一次正的 篩選，一次負(fù)的篩選，才能獲得陽性克隆。同源重組載體進(jìn)入ES細(xì)胞內(nèi)后，可以隨機(jī)插入小 鼠基因組的任何序列，造成假陽性結(jié)果，導(dǎo)致小鼠內(nèi)源性NGF基因不能正確的刪除。
[0006] 2007年Barrangou等人首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可以利用Cas/CRSPR系統(tǒng)對抵抗噬 菌體入侵。2008年Marraffini等人又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次 利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 Cas/CRISPR系統(tǒng)的功能。CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切 酶相似，它對序列的特異性切割，主要依賴crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識別 靶序列上的PAM以及protospacer。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)這一特性將它設(shè)計為人工的核 酸內(nèi)切酶（Engineered endonuclease，EEN)，用它來對科學(xué)家感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾。 釀濃鏈球菌（Streptococcus pyogenes SF370)的Type II型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人 工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾。
[0007] 為解決基因重組現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明人意欲通過利用Cas-9/CRSPR 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，提供一種同源重組位點(diǎn)準(zhǔn)確，成功率高的同源重組方法，以獲得整 合有人NGF基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并進(jìn)而提供一種制備具有商生物效能人NGF的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于現(xiàn)有技術(shù)在NGF的制備領(lǐng)域存在諸多的問題，發(fā)明人設(shè)計利用Cas-9/CRSPR 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，在小鼠 NGF成熟肽基因內(nèi)部把小鼠的染色體DNA切斷，依靠細(xì)胞自 身的同源重組修復(fù)能力，利用同時轉(zhuǎn)入的人工合成的融合基因（帶有鼠 NGF信號肽、前體 肽、人NGF成熟多肽）作為修復(fù)模板，一次完成小鼠 NGF成熟多肽基因的刪除和人NGF成熟 多肽基因的定位敲入。不僅可以在ES細(xì)胞上完成，還可以直接對小鼠的受精卵進(jìn)行顯微注 射，建立人NGF成熟多肽基因敲入小鼠，進(jìn)而通過該轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人NGF。
[0009] 為此，本發(fā)明首先提供了一種通過同源重組技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，所述小 鼠染色體中編碼神經(jīng)生長因子的基因被一個或多個拷貝的編碼人神經(jīng)生長因子的基因原 位取代，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建含有人神經(jīng)生長因子的編碼基因的同源重組載體，該同源重組載體能與 小鼠胚胎干細(xì)胞中鼠 NGF基因發(fā)生同源重組；優(yōu)選地，步驟（1)所述的同源重組載體依次包 含5' -同源重組臂、FRT序列、嘌呤霉素抗性基因表達(dá)盒、FRT序列、鼠 NGF信號肽序列、人 NGF基因、鼠 NGF3' -非翻譯區(qū)序列、3 同源重組臂。
[0011] 所述兩個同源重組臂（5' -和3' -端的重組臂）的長度為200 - 5000bp，優(yōu)選的 長度為l〇〇〇bp。5'-同源重組臂的序列可以如SEQ ID NO: 1所示，嘌呤霉素抗性基因 （Puro 基因）表達(dá)盒序列如SEQ ID N0:4所示，在其兩側(cè)的FRT序列如SEQ ID N0:2所示，F(xiàn)RT序 列用于在FLP酶的作用下刪除抗性基因表達(dá)盒。
[0012] 優(yōu)選地，所述嘌呤霉素抗性基因表達(dá)盒受PGK啟動子調(diào)控，所述PGK啟動子序列如 SEQ ID NO:3 所示。
[0013] 鼠 NGF信號肽序列如SEQ ID NO: 5所示，人NGF基因序列如SEQ ID NO: 6所示，所 述鼠 NGF3'-非翻譯區(qū)序列和3 同源重組臂序列可以如SEQ ID N0:7所示，所述3'-非 翻譯序列包括終止密碼子、PolyA加尾信號以及內(nèi)含子序列。
[0014] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述載體還帶有原核細(xì)胞的抗生素抗性基因，以便于 在大腸桿菌中篩選陽性克隆。
[0015] 在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（1)所述載體是在PBR322質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的， 所述抗生素抗性基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因。。
[0016] (2)構(gòu)建指導(dǎo)RNA模板DNA載體，所述載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出20bp的RNA分子與小 鼠染色體中編碼神經(jīng)生長因子成熟肽DNA特異性互補(bǔ)，并被Cas蛋白所識別，在互補(bǔ)區(qū)域下 游切斷小鼠 NGF基因組DNA。優(yōu)選地，所述的指導(dǎo)RNA模板DNA載體中，含有兩種DNA編碼 序列分別如SEQ ID N0:8和9的第320-329位核苷酸所示。
[0017] 所述載體含有啟動子序列和終止序列；優(yōu)選地可以采用U6啟動子進(jìn)行體內(nèi)的轉(zhuǎn) 錄，也可以選擇其它可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的啟動子，如T7和Sp6啟動子控制指導(dǎo)RNA的合成。
[0018] (3)構(gòu)建含有Cas-9 DNA內(nèi)切酶基因的真核表達(dá)載體，所述載體含有編碼入核信 號肽的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述入核信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；更為優(yōu) 選地，在所述Cas-9 DNA內(nèi)切酶基因和所述編碼入核信號肽的核苷酸序列之間有一個編碼 如SEQ ID NO: 12所示的柔性多肽的核苷酸序列。進(jìn)一步優(yōu)選地，在所述Cas-9 DNA內(nèi)切酶基 因和所述編碼入核信號肽的核苷酸序列之間編碼柔性多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13 所示的。
[0019] (4)將步驟（1)-(3)獲得的3種載體一起轉(zhuǎn)染入小鼠胚胎干細(xì)胞，并篩選發(fā)生了同 源重組的細(xì)胞；優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染可以為電轉(zhuǎn)染或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地，所述小鼠的品系 為C57BL/6J。在同源重組載體整合有Puro基因的基礎(chǔ)上，本步驟中所述的篩選為嘌呤霉素 篩選。
[0020] (5)將步驟（4)獲得的胚胎干細(xì)胞顯微注射入小鼠囊胚中，之后移植到假孕母鼠 的子宮中，手術(shù)縫合后飼養(yǎng)受孕母鼠，獲得受孕母鼠生產(chǎn)的子代小鼠，對所述子代小鼠進(jìn)行 基因鑒定，篩選出人NGF基因陽性的小鼠。
[0021] (6)在步驟（5)獲得的人NGF基因陽性小鼠中，通過基因鑒定篩選嵌合率大于 50%的成熟公鼠與未發(fā)生同源重組的原品系野生型小鼠進(jìn)行交配，之后飼養(yǎng)受孕的母鼠， 獲得受孕母鼠生產(chǎn)的子代小鼠。
[0022] (7)使步驟（6)獲得的子代小鼠之間進(jìn)行交配，通過基因鑒定篩選出純合子轉(zhuǎn)基 因小鼠。
[0023] 另外，本發(fā)明還提供了一種通過轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人NGF的方法，所述方法包括：
[0024] (1)通過上述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的方法獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠并進(jìn)行飼養(yǎng)；
[0025] (2)從上述方法步驟⑴獲得的小鼠的頜下腺中提取人NGF ;
[0026] 本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0027] 1)通過外源導(dǎo)入的RNA指導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶定點(diǎn)切割染色體DNA，激活小鼠細(xì)胞內(nèi) 源的重組修復(fù)機(jī)制，利用人工導(dǎo)入的模板DNA，通過同源重組將人NGF基因成熟多肽的DNA 序列定位替換鼠的NGF基因成熟多肽，形成一個帶有鼠 NGF的表達(dá)調(diào)控序列、信號肽、前體 肽和人NGF成熟多肽DNA序列嵌合基因。較常規(guī)的利用正負(fù)雙篩選同源重組基因打靶技術(shù) 相比，操作簡單，只需將3種質(zhì)粒DNA同時轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞或者對小鼠的受精卵進(jìn)行原核注射 就可以，成功率高，可以達(dá)到2-5 %，顯著高于普通基因打靶技術(shù)的0. 1 %的ES細(xì)胞陽性率。
[0028] 2)小鼠細(xì)胞在合成人NGF蛋白時，完全利用鼠 NGF的表達(dá)調(diào)控序列，轉(zhuǎn)錄出一個帶 有小鼠 NGF信號肽、前體肽和人NGF成熟多肽的嵌合多肽，