實(shí)現(xiàn)ASGV的定性檢測。
[0047] (2)、檢測結(jié)果可由電腦軟件直接讀出，不需要進(jìn)行反應(yīng)后處理，所以避免了檢測 結(jié)果假陽性的產(chǎn)生及環(huán)境的污染。
[0048] (3)、該實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測過程只需要1小時(shí)左右，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，大大 簡化了檢測步驟，縮短了檢測的時(shí)間。
[0049] (4)、通過與常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)比，其靈敏度是常規(guī)RT-PCR技術(shù)的1000倍。
【附圖說明】
[0050] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0051] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2提供的重組質(zhì)粒ASGV-CP實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢 測；
[0052] 圖2為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)PCR檢測ASGV的靈敏度測試結(jié)果圖；
[0053] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2提供的檢測方法檢測ASGV的靈敏度測試結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0055] 需要指出的是，在本發(fā)明的所有實(shí)施例以及應(yīng)用例中，感染ASGV的田間蘋果葉片 于2012年6月采自河北省清苑縣溫仁村，15份田間供試材料2013年8月采自河北科技師 范學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)站，蘋果脫毒組培苗由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0056] 此外，對(duì)于所用到的主要儀器和設(shè)備來源如下：
[0057] RNAiso Plus，RNAiso-mate，EASY Dilution 購自大連寶生物工程有限公司； TransStart Probe qPCR Super Mix， TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix及pEASY_T3Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝 膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。
[0058] Bio-Rad iQ?5熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，NanoDrop 2000微量紫 外分光度計(jì)為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品
[0059] 實(shí)施例1
[0060] S11 :以染毒材料的cDNA為模板，以ASGV-cp-F和ASGV-cp-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 所獲擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽 性克隆增菌培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取和鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0061] S12 :以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽 性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R為引物、以ASGV-Probe為探 針?biāo)M(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0062] S13 :以供試材料的cDNA為模板，按照與步驟2)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定 量PCR，得到的Ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)供試材料蘋果莖溝病毒的定量檢測。
[0063] 其中，所述 ASGV-cp-F、ASGV-cp-R、ASGV-Probe-F、ASGV-Probe-R 和 ASGV-Probe 的 核苷酸序列分別如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO: 5所示。
[0064] 表1引物及探針序列
[0065]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、以染毒材料的cDNA為模板，以ASGV-cp-F和ASGV-cp-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克 隆增菌培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取和鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品； 2) 、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R為引物、以ASGV-Probe為探針?biāo)M(jìn) 行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線； 3) 、以供試材料的cDNA為模板，按照與步驟2)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR， 得到的Ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)供試材料蘋果莖溝病毒的定量檢測； 其中，所述 ASGV-cp-F、ASGV-cp-R、ASGV-Probe-F、ASGV-Probe-R 和 ASGV-Probe 的核 苷酸序列分別如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5 所示。
2. 權(quán)利要求1所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步驟 1)中：所述染毒材料的cDNA的制備方法包括： 提取感染有蘋果莖溝病毒材料的總RNA，并以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到染毒材料 的 cDNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟1)中，所述瓊脂糖凝膠電泳中所用的瓊脂糖凝膠的濃度為1-2%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征 在于，在步驟1)中： 所述載體為PEASY-T3，所述感受態(tài)細(xì)胞為E. coli DH5 α。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟2)中： 所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的OD26ciAD28ci比值在1. 8-2. 0之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟2)中： 所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度范圍為：1. OX IO8拷貝/ UL?I. 0X10 1拷貝 / μ L，且所述梯度稀釋的倍數(shù)為10倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟2)中： 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線以所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以所述Ct 值為縱坐標(biāo)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟2)中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的過程中，反應(yīng)體系為： TransStart Probe qPCR Super Mix 10 μ L，ASGV-Probe-F和 ASGV-Probe-R 4_5pmol， ASGV-Probe 4_5pmol，模板 I. 0 μ L，雙蒸水補(bǔ)齊至 20 μ L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，在步 驟2)中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的過程中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?94°C預(yù)變性 30-35s ;94°C變性 4-7s，55°C退火 12-15s，72°C延伸 15-20s，共 35-40 個(gè)循 環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所 述實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Bio-Rad iQ?5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蘋果莖溝病 毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，屬于病毒分子檢測領(lǐng)域。該方法通過染毒材料的cDNA為模板，以ASGV-cp-F和ASGV-cp-R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、采用特異性引物和探針進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；將供試材料按照相同條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過比對(duì)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)供試材料蘋果莖溝病毒的定量檢測。該方法實(shí)現(xiàn)了蘋 果莖溝病毒的定量測定，而且檢測結(jié)果可直接通過電腦軟件讀出，避免了檢測結(jié)果假陽性以及環(huán)境污染問題。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-94
【公開號(hào)】CN104561386
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510051864
【發(fā)明人】王娜, 秦子禹, 孫建設(shè), 邵建柱
【申請(qǐng)人】河北科技師范學(xué)院
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日