一種水溶性生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的發(fā)酵方法及應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 本發(fā)明得到天津市科技攻關(guān)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目資助(項(xiàng)目編號(hào)05YFGZGX04400)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水溶性生物殺線(xiàn)蟲(chóng)農(nóng)藥的發(fā)酵方法及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0003] 植物線(xiàn)蟲(chóng)是一類(lèi)世界性分布的重要植物病原物，可寄生于植物的根、莖、葉、花、芽 和種子，環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)，幾乎每種植物都可被一種或幾種線(xiàn)蟲(chóng)寄生或侵害，使植物發(fā)生各 種線(xiàn)蟲(chóng)病，給農(nóng)、林業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。受到危害的植物自身抵抗力降低，其它病 原物趁機(jī)入侵植物，與線(xiàn)蟲(chóng)組成復(fù)合病害，導(dǎo)致植物減產(chǎn)、枯爛、甚至死亡，給世界農(nóng)業(yè)造成 每年約1250億美元的損失。
[0004]由于我國(guó)處于溫帶和亞熱帶，氣候條件適宜線(xiàn)蟲(chóng)的活動(dòng)與繁殖，世界性重要植物 線(xiàn)蟲(chóng)病害在我國(guó)均有發(fā)生。目前，從我國(guó)海南島到遼東半島的廣大溫暖地區(qū)均有根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng) 病害的發(fā)生，并且危害嚴(yán)重。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的危害程度僅次于真菌，已超過(guò)細(xì)菌、病毒成為第二 大植物病害。蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害在保護(hù)地中造成的損失達(dá)20-30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%，甚至絕 產(chǎn)，華北、西北、東北等地區(qū)保護(hù)地和華南露地蔬菜種植區(qū)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病已泛濫成災(zāi)。大豆孢 囊線(xiàn)蟲(chóng)是世界大豆生產(chǎn)的重要線(xiàn)蟲(chóng)病害，主要發(fā)生于偏冷涼地區(qū)，大豆受其危害后，輕者減 產(chǎn)20%-30%，嚴(yán)重的達(dá)到70%-80%，并且每年都有大面積地塊絕產(chǎn)。松材線(xiàn)蟲(chóng)病是由松材線(xiàn) 蟲(chóng)寄生在松屬樹(shù)種體內(nèi)取食營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致樹(shù)木死亡的一種毀滅性病害。一旦感染，它最快能 使得松樹(shù)植株在40天內(nèi)迅速萎蔫枯死，3-5年間便導(dǎo)致大面積山林毀滅。植物線(xiàn)蟲(chóng)病已成 為保護(hù)地發(fā)展的主要限制因素，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。
[0005]目前化學(xué)農(nóng)藥仍然是控制植物線(xiàn)蟲(chóng)病的重要措施之一，但是其中大部分藥劑對(duì)人 畜劇毒、用量高、花費(fèi)大、嚴(yán)重污染環(huán)境和地下水源，破壞生態(tài)平衡，而且農(nóng)藥的殘留污染直 接影響農(nóng)產(chǎn)品深加工的質(zhì)量和品質(zhì)，因此化學(xué)殺線(xiàn)劑的應(yīng)用正逐步受到限制。隨著人類(lèi)環(huán) 保意識(shí)的增強(qiáng)及對(duì)自身生活質(zhì)量要求的不斷提高，生物防治隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展已成 為線(xiàn)蟲(chóng)防治的主導(dǎo)。
[0006] 生物殺線(xiàn)劑第一代是活菌劑，但是存在著受環(huán)境因素影響大、穩(wěn)定性差、貨架期短 等局限性。目前，從微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找殺線(xiàn)蟲(chóng)化合物或?qū)€(xiàn)蟲(chóng)有活性的組分制 備第二代線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。但已研究報(bào)道的真菌殺線(xiàn)蟲(chóng)代謝物大多為 脂溶性，水中溶解度較差，需要通過(guò)添加無(wú)機(jī)化學(xué)藥品、有機(jī)酸及其衍生物、氨基酸、以及一 些蛋白質(zhì)溶解劑等增效劑來(lái)助溶，或需對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行必要的化學(xué)修飾，這給真菌代謝物的 實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了困難。并且此類(lèi)生防制劑的開(kāi)發(fā)多停留于實(shí)驗(yàn)室研究階段，存在著大田實(shí) 驗(yàn)效果不佳的問(wèn)題。瑞士先正達(dá)公司開(kāi)發(fā)的新型生物殺線(xiàn)劑于2014年上市，該生物殺線(xiàn)劑 產(chǎn)品實(shí)際上是一種細(xì)菌孢子，會(huì)粘附于大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)并在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)最后導(dǎo)致其死亡， 該藥目前未進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)。在中國(guó)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)目前十分缺乏安全、環(huán)保、耐熱、水溶性、殺線(xiàn)蟲(chóng) 譜廣的生物殺線(xiàn)劑。隨著植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害日趨嚴(yán)重以及人們環(huán)境和健康意識(shí)的增強(qiáng)，目 前國(guó)內(nèi)外對(duì)防治植物線(xiàn)蟲(chóng)病害生物農(nóng)藥的市場(chǎng)需求量很大，但合適的生防制劑在這方面存 在很大空白。因此，篩選高效廣譜殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)產(chǎn)生菌，開(kāi)發(fā)新型的實(shí)用制劑，是一件十 分迫切和重要的工作。
[0007] 總狀共頭霉屬接合菌綱毛霉目共頭霉科，共頭霉科是單屬科，只有共頭霉屬 (Syncephalastrum)一個(gè)屬，此屬目前認(rèn)為只有一個(gè)種即總狀共頭霉（51racefflos??)，是土 壤和糞中常見(jiàn)的習(xí)居菌，分布遍及全球。（見(jiàn)《普通真菌學(xué)》邢來(lái)君李明春編著P305-320) 總狀共頭霉（rac6?〇5??(Cohn)Schroter)是常見(jiàn)的腐生菌，該菌可從土 壤和糞便中分離的刀得到，也可通過(guò)中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)（CCCCM)下屬的中國(guó)普通 微生物菌種保藏中心（CGMCC，歸口中國(guó)科學(xué)院，掛靠在中科院微生物研究所）購(gòu)買(mǎi)(其菌種 編號(hào) 3. 264-3. 3737)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害防治過(guò)程中缺乏高效、低毒、使用方便的生防 制劑的問(wèn)題，利用課題組篩選到的線(xiàn)蟲(chóng)生防菌株Srl8,在大量活性應(yīng)用實(shí)驗(yàn)證實(shí)其代謝產(chǎn) 物具有耐熱、水溶性、低毒、殺線(xiàn)蟲(chóng)譜廣及藥效實(shí)驗(yàn)對(duì)番茄和黃瓜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害有較好的防 治效果并具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)和明顯的增產(chǎn)作用等特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究200L及5噸發(fā)酵 罐生產(chǎn)規(guī)模上的發(fā)酵過(guò)程和規(guī)律、確定了生產(chǎn)工藝和技術(shù)參數(shù)，所建立的發(fā)酵工藝為二級(jí) 發(fā)酵，具有發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單易控、發(fā)酵周期短、能耗低、活性產(chǎn)物高產(chǎn)等特點(diǎn)；制備的濃縮水劑 活性強(qiáng)，無(wú)毒副作用、穩(wěn)定、易于儲(chǔ)藏，貨架期達(dá)兩年以上；施用方便、可與水以任意比例混 合，還可與其他農(nóng)藥配合使用。通過(guò)進(jìn)行多地的防治植物線(xiàn)蟲(chóng)病害的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，取得了良好 的結(jié)果。研究成果為加速開(kāi)發(fā)新型高效殺線(xiàn)蟲(chóng)生物農(nóng)藥，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外對(duì)安全高 效低毒的殺線(xiàn)蟲(chóng)制劑的需求奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為促進(jìn)無(wú)公害蔬菜和重要農(nóng)作物的生產(chǎn)， 保護(hù)生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)民增產(chǎn)增收以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出了一定的貢獻(xiàn)。對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)病害的生 物防治、無(wú)公害蔬菜和食品的生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種水溶性生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的發(fā)酵方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行： (1) Srl8菌活化培養(yǎng)及孢子懸液的制備：將安瓿管中保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基， 26°C靜置培養(yǎng)6d-7d;取活化后的Srl8菌斜面，加入5ml無(wú)菌水洗下斜面上的孢子，倒入加 有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，振蕩1~2分鐘，計(jì)數(shù)；所述斜面培養(yǎng)基指的是PSMA培養(yǎng)基：30%馬鈴 薯浸汁+2%蔗糖+0. 2%進(jìn)口麥芽精+0. 2%瓊脂粉； (2) 2001罐發(fā)酵放大：采用501發(fā)酵罐作為種子罐制備一級(jí)種子：按照2.75\106/1的 孢子濃度將步驟（1)制備的孢子懸液接入裝有22L培養(yǎng)基的種子罐中，26°C培養(yǎng)24h。以4% 接種量將一級(jí)種子接入裝有150L發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速198~252r/min， 罐壓0. 05MPa，通氣量以維持溶氧水平為20%~30%為原則，發(fā)酵時(shí)間40h;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基 (w/w)為：30%馬鈴薯浸汁+2%蔗糖+0? 2%進(jìn)口麥芽精； (3) 5t罐發(fā)酵放大：利用馬鈴薯脫皮機(jī)，對(duì)馬鈴薯進(jìn)行脫皮，切片機(jī)切片，浸汁；采用 500L發(fā)酵罐制備一級(jí)種子：按照2. 794X106/L孢子濃度將步驟（1)制備的孢子懸液接入裝 有250L培養(yǎng)基的種子罐中，26°C培養(yǎng)24h，以4%(w/w)接種量將一級(jí)種子接入裝有3. 29t 發(fā)酵培養(yǎng)基的5t發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min，罐壓0. 03-0. 05MPa，通氣量以維持溶氧水 平25%-35%為原則，發(fā)酵時(shí)間37h-40h;所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)基指的是PS或PSM培養(yǎng)基：去皮馬 鈴薯300g煮汁，蔗糖20g，自來(lái)水1000mL(其中PSM添加國(guó)產(chǎn)麥芽精2g)，pH自然； (4) 濃縮水劑的制備：發(fā)酵結(jié)束后，將菌液加熱至70-80°C，采用板框過(guò)濾去除菌體，所 得濾液經(jīng)真空濃縮鍋濃縮得8-10倍重量濃縮水劑； (5) 粉劑的制備：利用噴霧塔將部分5t罐所得發(fā)酵液制成粉劑：取1. 3t發(fā)酵濾液，添 加過(guò)400目篩4%(w/w)玉米粉與菌體一起濃縮后，取出220L噴霧干燥，可直接得到粉劑。
[0010] 本發(fā)明的發(fā)酵方法針對(duì)目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)缺乏安全、環(huán)保、耐熱、水溶性、殺線(xiàn)蟲(chóng)譜廣 的生物殺線(xiàn)劑，而且真菌代謝物生防制劑的開(kāi)發(fā)多停留于實(shí)驗(yàn)室研究階段的問(wèn)題，本發(fā)明 重點(diǎn)解決了Sr18菌生防制劑200L及5噸規(guī)模的發(fā)酵工藝放大： (1) 建立了 5噸發(fā)酵罐規(guī)模生產(chǎn)水溶性高效殺線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑的二級(jí)發(fā)酵工藝，具有簡(jiǎn) 單易控、發(fā)酵周期短、能耗低