產(chǎn)生具有改良的解離速率的適配體的方法
【專利說明】產(chǎn)生具有改良的解離速率的適配體的方法
[0001] 本申請是2008年7月17日提交的題為"產(chǎn)生具有改良的解離速率的適配體的方 法"的中國專利申請200880107336. 0的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2007年7月17日提交的美國臨時申請系列號60/950,281、2007年7 月17日提交的美國臨時申請系列號60/950, 293、2007年7月17日提交的美國臨時申請系 列號60/950,283、2008年2月26日提交的美國臨時申請系列號61/031，420和2008年5 月8日提交的美國臨時申請系列號61/051，594的權(quán)益。本申請還是2007年1月16日提 交的美國申請系列號11/623, 580和美國申請系列號11/623, 535的部分繼續(xù)申請。所述每 篇文獻均以其全文援引加入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明一般性涉及產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的適配體（aptamer)和光適配體 (photoaptamer)的方法，以及涉及由此產(chǎn)生的改良的適配體和光適配體。特別地，本發(fā)明描 述了對感興趣的靶高度特異的慢解離速率（off-rate)適配體。本發(fā)明描述了這些慢解離 速率適配體的組成以及選擇其的方法。本發(fā)明進一步描述了用于檢測方法的具有的改良功 能性的適配體構(gòu)建體。進一步地，本發(fā)明描述了這些改良的適配體的應(yīng)用。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 以下說明書提供了與本
【發(fā)明內(nèi)容】
相關(guān)的信息總結(jié)，但并非承認本文提供的任何信 息或參考的任何出版物是請求保護的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0007] SELEX方法是在體外選擇能高特異性結(jié)合靶分子的核酸分子的方法，在發(fā)明名 稱為"Nucleic Acid Ligands"的美國專利No. 5, 475, 096和發(fā)明名稱為"Nucleic Acid Ligands"的美國專利No. 5, 270, 163(也見WO 91/19813)中描述，所述專利在此均特異性地 援引進入。這些專利在此統(tǒng)稱作SELEX專利，描述了產(chǎn)生任何希望的靶分子的適配體的方 法。
[0008] 已對基本的SELEX方法進行了修飾以實現(xiàn)許多特別目的。例如，發(fā)明名稱 為"MethodforSelectingNucleicAcidsontheBasisofStructure" 美國專利 No. 5, 707, 796描述了SELEX方法結(jié)合凝膠電泳在選擇具有特異性結(jié)構(gòu)特征的核酸分 子如bentDNA中的應(yīng)用。發(fā)明名稱為"High-AffinityNucleicAcidLigandsThat DiscriminateBetweenTheophyllineandCaffeine" 的美國專利No. 5, 580, 737 描述了 鑒別能區(qū)分密切相關(guān)的分子的高特異性適配體的方法，稱作Counter-SELEX。發(fā)明名稱為 "SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment:SolutionSELEX" 的 美國專利No. 5, 567, 588描述了基于SELEX的方法，其實現(xiàn)了高效分開（partitioning) 對革E分子具有高和低親和性的寡核苷酸。發(fā)明名稱為"NucleicAcidLigandsto 111￥-1^&11(1111￥-11^￥"的美國專利此.5,496,938描述了在進行5￡1^乂之后獲得改良 的適配體的方法。發(fā)明名稱為"SystematicEvolutionofLigandsbyExponential Enrichment:Chemi-SELEX"的美國專利No. 5, 705, 337描述了共價連接適配體與其靶的方 法。
[0009]SELEX方法包括鑒別含有賦予配體改良特征的修飾的核苷酸的高親和性適配體， 所述特征如改良的體內(nèi)穩(wěn)定性或者改良的輸送特征。這種修飾的例子包括在核糖和/或磷 酸酯和/或堿基位置的化學(xué)取代。SELEX方法鑒別的含有修飾的核苷酸的適配體在發(fā)明名 稱為"HighAffinityNucleicAcidLigandsContainingModifiedNucleotides" 的美 國專利No. 5, 660, 985中描述，其描述了在嘧啶的5' -和2' -位置含有化學(xué)修飾的核苷酸衍 生物的寡核苷酸。如前的美國專利No. 5, 580, 737描述了含有用2'-氨基（2'-NH2)、2'-氟 (2' -F)和/或2' -0-甲基（2' -OMe)修飾的一或多個核苷酸的高特異性適配體。
[0010] 對SELEX方法的進一步修改在發(fā)明名稱為"SystematicEvolutionofNucleic AcidLigandsbyExponentialEnrichment:PhotoselectionofNucleicAcidLigands andSolutionSELEX"的美國專利No. 5, 763, 177、美國專利No. 6, 001，577和美國專利 No. 6, 291，184 以及發(fā)明名稱為"PhotoselectionofNucleicAcidLigands" 的美國專利 No. 6, 458, 539中所述。這些專利在此統(tǒng)稱為"PhotoSELEX專利"，其描述了選擇含有能結(jié)合 和/或光交聯(lián)（photocrosslinking)和/或光失活祀分子的光反應(yīng)性官能團的適配體的各 種SELEX方法。所得光反應(yīng)性適配體稱做光交聯(lián)適配體或者光適配體。
[0011] 盡管這些SELEX和光SELEX(photoSELEX)方法是有用的，但是仍需要使得在體外 選擇方法中產(chǎn)生的適配體性質(zhì)改良的方法。例如，需要與天然發(fā)生的DNA或者RNA核苷酸 相比與靶分子具有更好的結(jié)合親和性的適配體，以及產(chǎn)生這種適配體的方法。對于許多應(yīng) 用而言，例如體外測定、診斷、治療或者成像應(yīng)用，感興趣的是產(chǎn)生從適配體/靶親和性復(fù) 合物具有慢解離速率的適配體。已經(jīng)提議一些技術(shù)用于產(chǎn)生這種試劑（見例如W099/27133 和US2005/0003362)。然而，這些選擇方法不區(qū)分與靶具有快結(jié)合動力學(xué)（即快結(jié)合速率） 的試劑的選擇及與靶具有慢解離動力學(xué)（即慢解離速率）的試劑的選擇。因此，需要新的 方法和技術(shù)以有利地選擇慢解離速率適配體，同時抑制與靶具有快結(jié)合速率的適配體的選 擇。
[0012] 最后，需要包括不同的內(nèi)在功能性的適配體構(gòu)建體。這些功能性可包括用于固定 標(biāo)簽（tag)、檢測標(biāo)記（label)、促進或控制分離的方式等。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明描述了新的適配體以及產(chǎn)生和使用這種適配體的方法。特別地，本發(fā)明描 述了慢解離速率適配體、含有C-5修飾的嘧啶的慢解離速率適配體以及通過稀釋、加入競 爭劑或者通過組合這兩種方法選擇慢解離速率適配體的方法。此外，本發(fā)明描述了多種靶 分子如蛋白質(zhì)和肽的慢解離速率適配體。本發(fā)明還描述了具有獨特結(jié)構(gòu)特征和解鏈溫度的 慢解離速率適配體。本發(fā)明還描述了具有光反應(yīng)性官能團的慢解離速率適配體，耐聚陰離 子材料存在的適配體，及選擇這些適配體的方法，以及用多種其它功能性構(gòu)建的適配體以 改良其在多種應(yīng)用中的用途。
[0015] 本發(fā)明描述了產(chǎn)生能結(jié)合靶分子的適配體的改良的SELEX方法。更特別地，本發(fā) 明描述了產(chǎn)生與用先前的SELEX方法獲得的適配體和光適配體相比與其各自的靶分子具 有更慢的解離速率的適配體和/或光適配體的方法。通常，在候選混合物與靶分子接觸及 使得核酸-靶復(fù)合物形成之后，導(dǎo)入慢解離速率富集過程，其中具有快解離速率的核酸-靶 復(fù)合物將解離且不再形成，而具有慢解離速率的復(fù)合物保持完整。導(dǎo)入慢解離速率富集過 程的方法包括但不限于在核酸與靶分子的混合物中加入競爭劑分子，稀釋核酸與靶分子的 混合物，或者組合這兩種方法。本發(fā)明進一步描述了使用這些方法獲得的適配體與光適配 體。
[0016] 在一個實施方案中，所述方法包括制備核酸的候選混合物；將該候選混合物與靶 分子接觸，其中與靶分子具有最高相對親和性的核酸優(yōu)先結(jié)合靶分子，形成核酸-靶分子 復(fù)合物；導(dǎo)入慢解離速率富集過程以誘導(dǎo)具有相對快解離速率的核酸-靶分子復(fù)合物解 離；分開候選混合物中剩余的結(jié)合的核酸-靶分子復(fù)合物與游離核酸；以及鑒別結(jié)合靶分 子的核酸。所述過程可進一步包括擴增結(jié)合靶分子的核酸以產(chǎn)生富集結(jié)合靶分子但仍產(chǎn)生 具有慢解離速率的核酸-靶分子復(fù)合物的核酸的核酸混合物的重復(fù)步驟。
[0017] 在另一個實施方案中，核酸的候選混合物包括含有修飾的核苷酸堿基的核酸，所 述修飾的核苷酸堿基可有助于具有慢解離速率的修飾的核酸-靶復(fù)合物的形成。用修 飾的核苷酸包括含有光反應(yīng)性或者其它官能團的核苷酸或者含有光反應(yīng)性基團占位物 (placeholder)的核苷酸進行SELEX的改良的方法在2008年7月17日與本申請同時申請 的發(fā)明名稱為"ImprovedSELEXandPH0T0SELEX"的美國申請系列No. 12/175, 388中描述， 其以全文援引加入本文。占位核苷酸也可用于非光反應(yīng)性的修飾的核苷酸的SELEX中或者 SELEX后導(dǎo)入。
[0018] 本文描述的多種方法和步驟可用于產(chǎn)生能（1)結(jié)合靶分子或者（2)結(jié)合靶分子及 隨后在用UV光或者可見光照射時與靶分子形成共價連接的適配體。
[0019] 另一方面，本文描述的多種方法和步驟可用于產(chǎn)生通過結(jié)合和/或交聯(lián)靶分子而 能修飾靶分子的生物活性的適配體。在一個實施方案中，鑒別了與特殊疾病相關(guān)或有關(guān)的 獨特靶分子的適配體。這個適配體可用作體外或體內(nèi)診斷試劑。在另一個實施方案中，與 疾病狀態(tài)相關(guān)的靶分子的適配體可以施用給個體及用于在體內(nèi)治療疾病。本發(fā)明鑒別的 適配體和光適配體可用于可以無限制地使用適配體、寡核苷酸、抗體和配體的任何診斷、 成像、高通量篩選或者靶確認技術(shù)或者程序或者測定中。例如，根據(jù)在同時提交的名稱為 "MultiplexedAnalysesofTestSamples"的美國申請系列No. 12/175,446 中詳細描述的 方法，可以使用本發(fā)明鑒別的適配體和光適配體，該申請以其全文援引加入本文。
[0020] 不具有本發(fā)明適配體的慢解離速率性質(zhì)的先前的適配體已經(jīng)用于多種目的。在幾 乎所有的這種應(yīng)用中，慢解離速率適配體相對于未選擇具有慢解離速率性質(zhì)的適配體具有 改良的性能。
[0021] 已經(jīng)批準(zhǔn)