一種藍(lán)蛤蛋白源ace抑制肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食物蛋白源活性肽不僅能提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)，還具有調(diào)節(jié)血壓、抗凝血、抗菌、免疫、抗氧化、降膽固醇、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂、護(hù)肝等功能。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽是一類(lèi)具有抑制ACE活性的生物活性物質(zhì)，自1965年首次發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研宄人員已從不同來(lái)源的蛋白質(zhì)中制備出各種具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽類(lèi)物質(zhì)。藍(lán)蛤是一種低值貝類(lèi)，在黃、渤海沿海灘涂產(chǎn)量高，繁殖量大，由于其個(gè)體小、蛤肉少，目前對(duì)藍(lán)蛤精深加工較少，僅有少量用作對(duì)蝦活餌料，多數(shù)沒(méi)有被充分利用，既造成資源浪費(fèi)同時(shí)給環(huán)境治理帶來(lái)了巨大壓力。藍(lán)蛤肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)資源，然而有關(guān)藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的研宄報(bào)道較少，本發(fā)明以藍(lán)蛤肉為原料開(kāi)發(fā)ACE抑制肽。檢索中國(guó)專(zhuān)利，未見(jiàn)相同相似記載。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。
[0004]本發(fā)明所述的一種藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法，包括原料預(yù)處理、酶解制備和活性炭吸附，具體步驟如下:
[0005](I)原料預(yù)處理
[0006]將藍(lán)蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時(shí)后，進(jìn)行真空冷凍干燥，取出藍(lán)蛤肉凍干物經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，獲得的藍(lán)蛤肉干粉并過(guò)200-400目篩，將過(guò)篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0007](2)酶解制備
[0008]取一定量過(guò)200-400目篩的藍(lán)蛤肉干粉配制成濃度為5-10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30?60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6?11，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6?11范圍內(nèi)(±0.05)，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解2?10小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50?70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至5?9，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?5%的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解I?5小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，5000?9000Xg離心10分鐘，上清液為藍(lán)蛤蛋白酶解液；
[0009](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0010]在酶解液中加入占酶解液總質(zhì)量I %?5%的活性炭，攪拌2?5小時(shí)后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
[0011]本發(fā)明所采用的ACE抑制活性的測(cè)定，具體步驟為:
[0012]取30 μ L馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10 μ L抑制劑混合均勻，在370C ±0.5°C恒溫水浴中預(yù)熱3-5分鐘，然后加入20 μ L血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)液充分混合，37°C保溫30分鐘后，再加入60 μ L的lmol/LHCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。同時(shí)用10 μ LpH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用0.45 μ m濾膜過(guò)濾后直接用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件:柱溫25 °C，流速0.5mL/min，流動(dòng)相乙腈/水(0.05 %TFA)比例為25/75等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm.
[0013]ACE抑制活性計(jì)算公式如下:
[0014]ACE 抑制活性(% ) = 100 (M-N)/M
[0015]式中:M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積。
[0016]N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。
[0017]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備采用分步酶解方式，由于兩種酶的底物特異性不同，第一步酶解產(chǎn)物能與第二步加入的蛋白酶充分接觸而被充分降解，因而最終獲得的活性肽分子量更低，更易于人體直接吸收進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用；同時(shí)本發(fā)明將低值貝類(lèi)藍(lán)蛤進(jìn)行精深加工，不僅改變了當(dāng)前藍(lán)蛤的低利用率的現(xiàn)狀，而且減輕了海洋環(huán)境治理的負(fù)擔(dān)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但不限于此。
[0019]實(shí)施例1:
[0020](I)原料預(yù)處理
[0021]將藍(lán)蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時(shí)后，進(jìn)行真空冷凍干燥，取出藍(lán)蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍(lán)蛤肉干粉并過(guò)200目篩，將過(guò)篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0022](2)酶解制備
[0023]取一定量過(guò)200目篩的藍(lán)蛤肉干粉配制成濃度為5%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%的Protamex復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6 (±0.05)，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解2小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至5，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解2小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，5000 Xg離心10分鐘，上清液為藍(lán)蛤蛋白酶解液；
[0024](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0025]在酶解液中加入占其總質(zhì)量I %的活性炭，攪拌2小時(shí)后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測(cè)定，其對(duì)ACE活性的抑制率>40%。
[0026]實(shí)施例2:
[0027](I)原料預(yù)處理
[0028]將藍(lán)蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時(shí)后，進(jìn)行真空冷凍干燥，取出藍(lán)蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍(lán)蛤肉干粉并過(guò)300目篩，將過(guò)篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0029](2)酶解制備
[0030]取一定量過(guò)300目篩的藍(lán)蛤肉干粉配制成濃度為8%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度50°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至9，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量5%的Protamex復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在9 (±0.05)，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解5小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度60°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至7，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量4%的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解5小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，9000 Xg離心10分鐘，上清液為藍(lán)蛤蛋白酶解液；
[0031](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0032]在酶解液中加入占其總質(zhì)量5%的活性炭，攪拌5小時(shí)后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測(cè)定，其對(duì)ACE活性的抑制率>50%。
[0033]實(shí)施例3:
[0034](I)原料預(yù)處理
[0035]將藍(lán)蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時(shí)后，進(jìn)行真空冷凍干燥，取出藍(lán)蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍(lán)蛤肉干粉并過(guò)400目篩，將過(guò)篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0036](2)酶解制備
[0037]取一定量過(guò)400目篩的藍(lán)蛤肉干粉配制成濃度為10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至11，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入0.5moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在11 (±0.05)，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解10小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至9，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量5%的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解10小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，7000 Xg離心10分鐘，上清液為藍(lán)蛤蛋白酶解液:
[0038](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0039]在酶解液中加入占其總質(zhì)量3%的活性炭，攪拌3小時(shí)后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測(cè)定，其對(duì)ACE活性的抑制率>45%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 原料預(yù)處理: 將藍(lán)蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時(shí)后，進(jìn)行真空冷凍干燥，取出藍(lán)蛤肉凍干物經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，獲得的藍(lán)蛤肉干粉過(guò)200-400目篩，將過(guò)篩后的粉末保存用于酶解制備； 酶解制備: 取一定量過(guò)200-400目篩的藍(lán)蛤肉干粉配制成濃度為5-10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30?60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6?11，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6?11范圍內(nèi)(±0.05)，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解2?10小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50?70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至5?9，加入占藍(lán)蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?5%的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，酶解過(guò)程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，酶解I?5小時(shí)后經(jīng)100°C滅酶10min，5000?9000Xg離心lOmin，上清液為藍(lán)蛤蛋白酶解液；活性炭吸附及冷凍干燥: 在酶解液中加入占其總質(zhì)量1%?5%的活性炭，攪拌2?5小時(shí)后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。針對(duì)目前藍(lán)蛤蛋白資源精深加工較少，造成資源浪費(fèi)，本發(fā)明以藍(lán)蛤肉為原料經(jīng)原料預(yù)處理、雙酶分步酶解制備、活性炭吸附和冷凍干燥，最終獲得藍(lán)蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，其對(duì)ACE活性的抑制率大于40％。本發(fā)明提供了一種ACE抑制肽開(kāi)發(fā)的潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，同時(shí)解決了藍(lán)蛤未被充分利用既造成的資源浪費(fèi)以及給環(huán)境治理帶來(lái)了巨大壓力的難題。
【IPC分類(lèi)】C12P21-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104593462
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410857104
【發(fā)明人】于志鵬, 趙文竹, 張宏陽(yáng), 勵(lì)建榮
【申請(qǐng)人】渤海大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日