ID N0:7)所示 ' CDR3 的抗 體'鏈的核苷酸序列。
[0022] 在另一些實(shí)施列中，分離的核酸包含編碼含有SSSVNYMH(SEQ ID N0:22)所示八 CDR1，DTSKLAS(SEQ ID N0:23)所示 ' CDR2 和 QQWSSNPW(SEQ ID N0:24)所示 ' CDR3 的 抗體'鏈的核苷酸序列。這樣的核苷酸序列可編碼SEQ ID NO: 18的抗體輕鏈可變區(qū)。
[0023] 在另一方面，本發(fā)明描述了包含一種或多種本文所述核酸的載體（例如，表達(dá)載 體），例如編碼本文所述的抗體重鏈可變區(qū)的核酸和/或編碼本文所述的抗體輕鏈可變區(qū) 的核酸。包含本文所述載體的宿主細(xì)胞同樣落入本發(fā)明的范圍。
[0024] 此外，本發(fā)明提供了包含肽和輔佐劑的免疫組合物，其中，所述的肽包含 SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID N0:11)所示氨基酸序列或其中的免疫原性表位，和所述免疫組合 物誘導(dǎo)SEQ ID N0:11的特異性免疫反應(yīng)的應(yīng)用，例如，抗體生產(chǎn)。
[0025] 落入本發(fā)明范圍的還有用于治療IgE介導(dǎo)的疾病比如過(guò)敏性疾?。ㄟ^(guò)敏反應(yīng)，過(guò) 敏性哮喘，過(guò)敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎（濕疹），灰塵過(guò)敏，昆蟲或爬蟲毒液過(guò)敏，食物過(guò)敏，花 粉過(guò)敏和乳膠過(guò)敏）的藥物組合物，所述藥物組合物含有任一所述的抗IgE抗體或編碼此 類抗體的核酸和藥學(xué)上可接受的載體，以及所述藥物組合物在生產(chǎn)治療IgE介導(dǎo)的疾病的 藥物中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在以下作具體描述。本發(fā)明的其它特征或優(yōu)勢(shì) 從以下的附圖和幾個(gè)實(shí)施例的詳細(xì)描述中得以明了，從附加的權(quán)利要求中也將是顯然的。 [0027] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0028] 以下附圖形成本發(fā)明說(shuō)明書的一部分，包括這些附圖用以進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某 些方面，參考這些附圖中的一張或多張并結(jié)合本文所述具體實(shí)施例的詳述可以更好地理解 本發(fā)明的這些方面。
[0029] 圖1是人e -鏈，m e鏈的長(zhǎng)，短同種型和m e的長(zhǎng)型的CH4結(jié)構(gòu)域與C e mX結(jié)構(gòu) 域之間的連接處殘基（灰色陰影）的示意圖。TVQRAVSVNP(SEQ ID N0:12)是CH4的C末端 區(qū)段和 GLAGGSAQSQ(SEQ ID N0:13)是 C e mX 的 N 末端區(qū)段。
[0030] 圖2顯示了單克隆抗IgE抗體mAb 2H9的表位作圖。A:代表CH4-CemX的連接處 的合成肽。P1:SEQ ID N0:25;P1.15:SEQ ID N0:11;P1.17:SEQ ID N0:36;P1.18:SEQ ID 勵(lì):27;和？1.19:5￡〇10勵(lì):28。8:各種〇￡11^-融合蛋白和連接殘基的氨基酸序列。1 8￡. Fc-em67連接序列：SEQ ID N0:11 ;IgG.Fc-em67連接序列：SEQ ID N0:29;HBcAg-Pl連接 序列：SEQ ID N0:11 ;和 HBcAg-CemX:SEQ ID N0:30。C:顯示了 的單克隆抗體 2H9，h4B12, 和h47H4與各種連接肽和重組蛋白的結(jié)合活性的圖。
[0031] 圖3是顯示mAb 2H9與表達(dá)mlgE.FcL (紅線），但不表達(dá)mlgE.FcS (著色的柱狀 圖）的Ramos細(xì)胞結(jié)合的圖。Ramos細(xì)胞與20, 10, 1，和0. 1 y g/ml濃度的抗體在冰上孵育 20分鐘，然后用小鼠IgG的特異性FITC-標(biāo)記的兔F(ab<2 )2染色。
[0032] 圖4是顯示用mAb 2H9誘導(dǎo)表達(dá)mlgE的Ramos細(xì)胞凋亡的圖。此處使用 migis-a (IgA的膜結(jié)合a鏈的C末端膜錨定多肽的胞外區(qū)段）特異性的單克隆抗體mAbs 7C3作為同種型mAb的對(duì)照，和單克隆抗體4B12 (參見W02010/097012)用作為陽(yáng)性對(duì)照。 結(jié)果表示為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式三份的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0033] 圖5是顯示用各種濃度的mAb 2H9誘導(dǎo)表達(dá)mlgE. FcL的A20細(xì)胞的NK細(xì)胞介導(dǎo) ADCC的圖。CFSE陽(yáng)性細(xì)胞用不同濃度的2H9處理，然后以E:T比例為10加入新鮮分離的 鼠NK細(xì)胞。數(shù)據(jù)是一式三份樣品的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。用4B12和7C3作為對(duì)照mAb。
[0034] 圖6顯示了 mAb 2H9的氨基酸序列和鼠類重鏈亞類1(HV1)和輕鏈k亞類13(KV13) 的序列。每條鏈的三個(gè)⑶R下面劃線。2H9重鏈可變區(qū)：SEQ ID N0:3 ;2H9輕鏈可變區(qū)：SEQ ID N0:4;HV1:SEQ ID N0:31 ;和 KV13:SEQ ID N0:32。
[0035] 圖 7 顯示了 mAb 5A8(SEQ ID N0:17)的 VH和重鏈亞類 1(HV2 ;SEQ ID N0:33)的 鼠類共有序列之間和mAb 5A8(SEQ ID N0:18)的 '和輕鏈k亞類13(HV2;SEQ ID N0:34) 之間的序列比對(duì)。每條鏈的三個(gè)⑶Rs下面劃線。
[0036] 圖8顯不了 mAb 5A8與表達(dá)mlgE. Ramos細(xì)胞結(jié)合，但不與表達(dá)mlgE. Fcs (著 色柱狀圖）的Ramos細(xì)胞結(jié)合。Ramos細(xì)胞與10, 5, 2. 5, 1. 25,和0. 625 ii g/ml濃度的所述 抗體在冰上孵育20分鐘，然后用小鼠IgG的特異性FITC-標(biāo)記的兔F (ab <2 ) 2染色。使用 4B12作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0037] 圖9是顯示用mAb 5A8誘導(dǎo)表達(dá)mlgE的Ramos細(xì)胞凋亡的圖。使用migis-a (IgA 的膜結(jié)合a鏈的C末端膜錨定肽的胞外區(qū)段）的特異性mAbs 7C3在此作為同種型mAb的 對(duì)照，和使用4B12作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表示為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式三份的平均值土標(biāo)準(zhǔn) 差。
[0038] 圖10是顯示用5A8誘導(dǎo)表達(dá)mlgE.Fq的A20細(xì)胞的NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的圖。CFSE 陽(yáng)性細(xì)胞用所示的不同濃度的5A8處理，然后以E:T比例為2. 5加入新鮮分離的鼠NK細(xì)胞。 數(shù)據(jù)是一式三份樣品的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。用4B12和7C3作為對(duì)照mAbs。
[0039] 發(fā)明詳述
[0040] 已開發(fā)了幾種抗IgE抗體，也確定了它們?cè)趍lgE中的結(jié)合表位。參見， 例如，US2009/0010924，W02010/097012，美國(guó)專利號(hào).8,071，097，Brightbill 等 Journal of Clinical Investigation 120:2218-29(2010)，Chen 等，Journal of Immunology, 184:1748-56 (2010)。發(fā)現(xiàn)所有這些抗IgE抗體與完全位于C e mX結(jié)構(gòu)域內(nèi)的 表位結(jié)合。
[0041] 本發(fā)明是基于開發(fā)出與位于CH4和CemX結(jié)構(gòu)域連接處新鑒定的抗原性表位結(jié)合 的抗IgE抗體和出乎意料的發(fā)現(xiàn)這些抗體能夠誘導(dǎo)表達(dá)mlgE的B細(xì)胞誘導(dǎo)和抗體依賴性 細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明通過(guò)至少清除表達(dá)mlgE的B細(xì)胞，與CH4和CemX結(jié)構(gòu)域之間的 這類結(jié)合區(qū)結(jié)合的抗體能有效治療IgE介導(dǎo)的疾病。
[0042] 因此，本發(fā)明涉及開發(fā)這樣一種抗體，其能與位于表達(dá)在人B淋巴細(xì)胞上的人 mlgE的e鏈長(zhǎng)同種型的CH4結(jié)構(gòu)域和C e mX結(jié)構(gòu)域之間（例如，在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接處） 的表位結(jié)合（例如，特異性結(jié)合）。具體地說(shuō)，這類抗體識(shí)別由第一部分和第二部分組成的 表位，其中所述的第一部分包含部分CH4結(jié)構(gòu)域（例如CH結(jié)構(gòu)域的C末端）和所述的第二 部分包含部分C e mX結(jié)構(gòu)域（例如C e mX結(jié)構(gòu)域的N末端）。本發(fā)明還提供了本文所述抗 IgE抗體治療IgE介導(dǎo)的疾病例如過(guò)敏性疾病的應(yīng)用，編碼所述抗IgE抗體的核酸分子，包 含所述核酸的載體（例如表達(dá)載體），包含所述載體（例如生產(chǎn)所述抗IgE抗體）的宿主細(xì) 胞。本發(fā)明的范圍還涉及包含新鑒定的連接處抗原性表位的免疫肽及其在誘導(dǎo)對(duì)這類表位 的特異性免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0043] 抗IgE抗體
[0044] 抗體（可與復(fù)數(shù)形式互換使用）是通過(guò)位于免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè) 抗原識(shí)別位點(diǎn)，能夠與靶抗原，例如碳水化合物，多核苷酸，脂類，多肽等結(jié)合的免疫球蛋白 分子。在此所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"不僅涵蓋完整（即全長(zhǎng)）多克隆或單克隆抗體，還涵蓋其抗 原結(jié)合片段（例如？ &13^&13'^(&13'）2^￥)，單鏈（ 8(^0，其突變體，包含抗體部分的融合 蛋白，人源化抗體，嵌合抗體，雙抗體，線性抗體，單鏈抗體，多特異性抗體（例如雙特異性 抗體）和包含所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)型，包括抗 體的糖基化變體，抗體的氨基酸序列變體和共價(jià)鍵修飾的抗體?？贵w包括任一種類的抗體， 例如IgD，IgE，IgG，IgA，或IgM (或其亞類），所述抗體無(wú)需是任何特定的類別。根據(jù)抗體 重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以歸入不同的類別。有5種主要免疫球蛋白類型： IgA, IgD, IgE, IgG,和IgM,和這些抗體的其中幾種可以進(jìn)一步分成亞類（同種型），例如， IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白不同亞類的重鏈恒定區(qū)被分別稱 作a, 6, e，A和y。免疫球蛋白不同亞類的亞單元結(jié)構(gòu)和三位構(gòu)型是眾所周知的。
[0045] 在此所述的分離抗IgE抗體能夠與含有膜結(jié)合IgE分子的CH4結(jié)構(gòu)域內(nèi)和C e mX 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的殘基的表位結(jié)合，所