一種結(jié)核感染t細(xì)胞免疫檢測抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種結(jié)核感染特異T細(xì)胞免疫檢測抗原及其應(yīng)用。具體地說就是一種 結(jié)核分枝桿菌抗原及其表位肽組合物，用于結(jié)核感染細(xì)胞免疫檢測，屬于結(jié)核病檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的人畜共患的慢性傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 的統(tǒng)計，目前全球有超過1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，每年有200萬人因結(jié)核病死亡。 我國是全球22個結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一、同時也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重 的國家之一。我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，中國結(jié)核病年新發(fā)病人數(shù)約 為130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14. 3%，位居全球第二位；15歲及以上人群肺結(jié)核的患病率為 459/10萬。結(jié)核分枝桿菌除感染人外，還感染50多種哺乳動物和20多種禽類；易感性因 動物種類和個體不同而異，家畜中牛是最敏感動物。結(jié)核病的流行不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展， 更重要的是由于交叉感染，而使人類的健康受到嚴(yán)重威脅。因此，結(jié)核病已經(jīng)成為一個嚴(yán)重 的社會經(jīng)濟(jì)問題，對我國公民健康、社會安定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重的危害。
[0003] 結(jié)核病的早期診斷對結(jié)核病的控制至關(guān)重要，而結(jié)核病防治的最大挑戰(zhàn)之一就是 缺乏早期、快速、敏感和特異的診斷工具。目前所采用的結(jié)核感染的診斷方法仍然存在著較 大的局限性。經(jīng)典的結(jié)核菌素試驗（TST)用于結(jié)核病診斷雖然已達(dá)一個世紀(jì)，但其受卡介 苗接種和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌感染的干擾，特異性和敏感性均不理想；細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)作為 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)用于結(jié)核病也存在著培養(yǎng)周期過長、陽性率較低、且依賴于標(biāo)本采集質(zhì)量等 問題；而影像學(xué)、血清學(xué)等方法，因為較高的假陰性或假陽性，用于結(jié)核病診斷的參考價值 受限。現(xiàn)有結(jié)核病檢測試劑靈敏度、特異度均有待提高。
[0004] 抗結(jié)核病的保護(hù)性免疫機(jī)制目前仍不完全清楚，細(xì)胞免疫尤其是循環(huán)及感染部 位的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答被認(rèn)為起著重要作用。因此能否有效地激發(fā)機(jī)體的T細(xì)胞，尤其是 CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)是機(jī)體成功對抗結(jié)核感染的關(guān)鍵。被病原菌致敏的T淋巴細(xì)胞，再次 受到同種抗原刺激后會釋放Y干擾素，高水平的Y干擾素反應(yīng)可以提示該病原菌的感 染。近年來，隨著免疫學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外Y干擾素反 應(yīng)測定法（IGRA)，可用于結(jié)核病輔助診斷和結(jié)核感染篩查。目前已經(jīng)有以結(jié)核分枝桿菌 基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10為刺激物的商品化IGRA試劑，如 QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT. TBtest，用于檢測外周血中結(jié)核特異性釋放Y干擾 素的T淋巴細(xì)胞，呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。
[0005] 抗原表位是多肽抗原的一部分，是抗原性的核心基礎(chǔ)；抗原通過抗原表位與相應(yīng) 的淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合從而致敏淋巴細(xì)胞、引起免疫應(yīng)答，即免疫反應(yīng)的特異性是針對 抗原表位，而不是針對整個抗原，抗原表位在抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的過程中起著決定性作用。
[0006] 基于T細(xì)胞分泌Y干擾素的體外檢測技術(shù)，主要以完整抗原作為相應(yīng)的刺激源， 抗原成分組成較為復(fù)雜、靈敏度和特異性有待提高，且相應(yīng)試劑由于國外公司的專利保護(hù)， 使得我國在引進(jìn)相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)用時成本較高，不適合目前情況下在我國大范圍應(yīng)用。本發(fā)明 是在國家傳染病重大專項資助下，對結(jié)核菌蛋白抗原及其表位充分分析、驗證和比較研究 的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，擁有完全的自主知識產(chǎn)權(quán)，基于本發(fā)明的檢測試劑可廣泛用于結(jié)核病的輔 助診斷、流行病學(xué)監(jiān)測與感染篩查等相關(guān)領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明在現(xiàn)有的T細(xì)胞Y干擾素釋放試驗技術(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RD1區(qū)基因Rv3873 所編碼的Rv3873抗原和/或其所包含的抗原表位肽，形成一個抗原表位肽組合物，并結(jié)合 ELISA方法對結(jié)核病例和健康志愿者體內(nèi)結(jié)核感染特異性T細(xì)胞進(jìn)行檢測，從而評價該抗 原表位肽組合物用于結(jié)核檢測的靈敏度和特異性。
[0008] Rv3873基因作為分枝桿菌核心基因組中的基因在分枝桿菌屬中高度保守，其表達(dá) 產(chǎn)物具有較高的T細(xì)胞免疫原性；且Rv3873抗原存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，而卡介苗 (BCG)及絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中均缺失該多肽抗原。本發(fā)明驗證了 Rv3873抗原亦可用 于結(jié)核感染特異性檢測，且使用相應(yīng)的抗原表位肽替代完整的多肽抗原作為檢測標(biāo)志物， 提供了一種抗原衍生的表位肽庫組合物，并將這種抗原衍生表位肽庫應(yīng)用于結(jié)核病例及健 康志愿者的檢測中。
[0009] 本發(fā)明的第一方面提供了一種用于結(jié)核感染細(xì)胞免疫檢測的抗原組合物，由結(jié)核 分枝桿菌Rv3873抗原和/或其衍生的抗原表位肽組成。
[0010] 所述結(jié)核分枝桿菌抗原RV3873氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 所述結(jié)核分枝桿菌Rv3873抗原衍生的抗原表位肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:2~59中的1種或多種。
[0012] 組合物中的表位肽可以是上述表位肽的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加1個或 幾個氨基酸且具有相同抗原性的衍生表位肽或其類似物。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原組合物由結(jié)核分枝桿菌RV3873抗原及其包含的 全部抗原表位肽組成。
[0014] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗原組合物由結(jié)核分枝桿菌RV3873抗原包含的全 部抗原表位肽組成。
[0015] 在最優(yōu)選的實施方案中，抗原組合物由氨基酸序列為SEQ ID N0:2~59所示的抗 原表位肽組成。
[0016] 本發(fā)明還提供了編碼所述抗原組合物的DNA分子，以及含有該DNA分子的重組表 達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌。
[0017] 本發(fā)明的第二方面提供了所述抗原組合物在制備用于體外檢測結(jié)核感染引起的 特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測試劑中的應(yīng)用，其特征在于人或動物的淋巴細(xì)胞經(jīng)過所述抗 原組合物的刺激后，檢測結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
[0018] 在特定的實施方案中，所述結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子選自Y干擾素 (IFN-Y)、白細(xì)胞介素2(IL_2)和腫瘤壞死因子a (TNF-a)，優(yōu)選IFN-Y ;所述結(jié)核特異 性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測方法選自酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISP0T)、酶聯(lián)免疫吸附試 驗（ELISA)、免疫層析試驗、細(xì)胞因子內(nèi)染色和T細(xì)胞增殖試驗，優(yōu)選ELISA ;所述淋巴細(xì)胞 來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水，優(yōu)選外周血。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述抗原組合物在制備結(jié)核檢測試劑中的應(yīng)用，并提供了一種結(jié) 核檢測試劑盒，其基本組成如下：
[0020] 本發(fā)明的抗原組合物；
[0021] 抗人或動物IFN- Y的小鼠IgG單克隆抗體（一抗）；
[0022] 酶標(biāo)試劑：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人或動物IFN-Y不同表位的的另一種小鼠 IgG單克隆抗體（二抗）；
[0023] 校準(zhǔn)品：含IFN-Y的陽性原料；
[0024] 培養(yǎng)管：測試培養(yǎng)管中含人工合成的抗原組合物，陽性對照培養(yǎng)管中含結(jié)核非特 異性刺激抗原，本底對照培養(yǎng)管中含基質(zhì)液；
[0025] 其他ELISA檢測所需試劑及耗材。
[0026] 優(yōu)選地，一抗固定在反應(yīng)板上。
[0027] 本發(fā)明采用的是雙抗體夾心原理檢測抗原的ELISA檢測方法?；具^程為：反應(yīng) 板上包被的一抗捕捉樣本中的IFN-Y，而同一 IFN-Y分子進(jìn)而又被酶標(biāo)的二抗捕獲、顯 色。雖然反應(yīng)板上固定的一抗和酶標(biāo)的二抗均為IFN-y單克隆抗體，但這兩種抗體為識別 IFN- Y上不同的抗原表位的單克隆抗體，因此不會相互影響。
[0028] 本發(fā)明的第三方面提供了一種結(jié)核疫苗候選材料，其特征在于含有所述的抗原及 其表位多肽組合物、DNA分子、重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0029] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)有以下優(yōu)點：本發(fā)明組合了能被T細(xì)胞識別的結(jié)核分枝桿 菌特異抗原Rv3873的表位肽抗原，與以往采用完整抗原的檢測手段相比，能夠減少由于冗 余的非表位識別區(qū)域?qū)μ禺愋訲細(xì)胞造成的干擾，從而提高檢測靈敏度；另一方面由于組 合了多個敏感的抗原表位序列，單檢測孔的反應(yīng)強(qiáng)度明顯增加，與單一的完整抗原相比檢 測結(jié)果的判斷更加容易；第三，本發(fā)明中所采用的全部衍生表位肽均已被研究證明能夠刺 激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此當(dāng)使用上述表位肽作為刺激物進(jìn)行體外T細(xì)胞Y 干擾素釋放試驗時，檢測結(jié)果真實可靠；第四，人工合成的氨基酸表位作為檢測試劑，可以 人為地調(diào)整各表位的混合濃度進(jìn)而增強(qiáng)檢測反應(yīng)的強(qiáng)度；第五，采用固相合成的方法合成 抗原表位肽，有利于質(zhì)量控制，且成本較低，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未 注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0031] 實施例1抗原表位肽組合物的構(gòu)成
[0032] 用于結(jié)核檢測的抗原表位肽組合物由Rv3873抗原衍生的表位肽構(gòu)成。所述抗原 Rv3873的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述Rv3873抗原衍生的表位肽的氨基酸序列 如SEQ ID N0:2~59所示。
[0033] 實施例2抗原表位肽組合物應(yīng)用于檢測試劑盒的開發(fā)
[0034] 本發(fā)明的抗原表位肽組合物可用于結(jié)核感染的檢測，形成臨床或?qū)嶒炇以\斷用試 劑盒。
[0035] 檢測試劑盒包括：
[0036] 1)實施例1中所述的抗原表位肽組合物；
[0037] 2)抗人或動