專利名稱：用于血癌分析與臨床處理的細(xì)胞抗原及靶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的復(fù)合分布的制作方法
用于血癌分析與臨床處理的細(xì)胞抗原及靶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的復(fù)合分布
背景技術(shù)：
白血病是骨髓和血液中的一種惡性癌癥。白血病表現(xiàn)為異常白細(xì)胞的過(guò)度增生，充滿骨 髓和/或外周血。這導(dǎo)致正常血細(xì)胞的生長(zhǎng)減少和功能減弱。慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL) 是人類罹患的四種主要類型白血病中的一種，其余為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓 性白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。
白血病患者經(jīng)歷不同的臨床進(jìn)程。白血病的治療很復(fù)雜并且取決于白血病類型。在白血 病患者中發(fā)現(xiàn)緩解期存在大量的臨床可變性，哪怕是在那些接受了一個(gè)療程治療的患者身上 也會(huì)發(fā)生。有的患者在沒(méi)有接受確切治療的情況下能夠存活很長(zhǎng)時(shí)間，而有的患者接受攻擊 性治療后仍然迅速死亡。那些對(duì)治療有抗性的患者只能存活很短時(shí)間，不管抗性何時(shí)發(fā)生。 雖然目前已有各種的分期系統(tǒng)用于對(duì)付這種臨床多樣性，但是它們并不能精確地預(yù)測(cè)一個(gè)早 期或中期的患者是否經(jīng)歷疾病的惰性期還是攻擊期。確切的說(shuō)，因?yàn)檫@些系統(tǒng)考慮了疾病的 總體表現(xiàn)，包括血液水平和骨髓中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴結(jié)的大小及分布、脾的大小、貧血度 數(shù)以及患者血液中血小板數(shù)，它們只能通過(guò)當(dāng)疾病發(fā)展到更進(jìn)一步的狀態(tài)時(shí)采用有限的預(yù)測(cè) 結(jié)果來(lái)鑒別病人。
慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)是美國(guó)和歐洲最常見(jiàn)的白血病，2004年美國(guó)新診斷的CLL 患者超過(guò)1萬(wàn)人，其中大多數(shù)患者為40歲以上的男性。CLL表現(xiàn)為小淋巴細(xì)胞的克隆性增生， 大部分顯明與B-淋巴細(xì)胞亞型一致的表面標(biāo)志物CD5和CD19。在大多數(shù)病例中，疾病呈現(xiàn) 一種惰性狀態(tài)，患者在不接受確切治療的情況下仍能存活較長(zhǎng)時(shí)間。此外，性別與CLL相關(guān)， 因?yàn)榛颊咧心信壤s為2:1。在少數(shù)病例中，盡管接受攻擊性治療，但疾病仍呈現(xiàn)迅速發(fā)展 的情況頻繁發(fā)生在年輕患者身上。在大多數(shù)情況下，疾病呈現(xiàn)緩慢發(fā)展的狀態(tài)，并且在若干 年內(nèi)都不會(huì)引起患者不舒適或者疼痛的感覺(jué)。
CLL表現(xiàn)為大量的癌性成熟淋巴細(xì)胞和變大的淋巴結(jié)。癌細(xì)胞淹沒(méi)了骨髓和淋巴結(jié)中的 正常細(xì)胞?；颊甙l(fā)生貧血，而且血液中正常白細(xì)胞和血小板的數(shù)目減少，但是由于異常白細(xì) 胞的增殖導(dǎo)致血液總白細(xì)胞數(shù)增加?？贵w的水平和活性也會(huì)下降。因此，患者的免疫系統(tǒng)受 損。CLL患者經(jīng)常死于受損免疫系統(tǒng)帶來(lái)的后果如感染等，而不是CLL本身。
CLL的臨床階段的特征有Rai分期系統(tǒng)(O-IV期)和Binet分期系統(tǒng)(A-C期)，其仍然 是CLL患者強(qiáng)大的預(yù)測(cè)者。這兩個(gè)系統(tǒng)都是基于相關(guān)淋巴組織的數(shù)量和貧血和/或血小板減
少的表現(xiàn)?？偠灾?，晚期患者具有明顯的不良預(yù)后和短期存活。Rai分期中IV期患者或者 Binet分期中C期患者平均存活時(shí)間為1.5到2年。
目前，仍沒(méi)有一個(gè)已知的針對(duì)B-CLL的治療，其能明顯延長(zhǎng)患者的存活期望。因此，只 對(duì)歸為B-CLL高級(jí)階段的患者考慮進(jìn)行攻擊性治療，包括化療、放療、手術(shù)、免疫治療或移 植。這些治療措施可能會(huì)讓患者產(chǎn)生生理和情緒上的嚴(yán)重代價(jià)，但是卻不能取得必要的好轉(zhuǎn) 結(jié)果；在某些病例中，B-CLL患者甚至死于這些治療的嚴(yán)酷性，而不是死于B-CLL的影響。 B-CLL早期的患者，因?yàn)榫哂休^好的生理狀態(tài)，所以能接受攻擊性或者實(shí)驗(yàn)性治療，只要狀 態(tài)維持穩(wěn)定，他們通常不接受治療，原因有兩個(gè)第一，目前可用的治療并不能延長(zhǎng)存活期； 第二，目前還不能為早期患者是否會(huì)好轉(zhuǎn)或者惡化提供可靠的指示。進(jìn)一步說(shuō)，疾病不可預(yù) 知的進(jìn)程可以為臨床治療困難的結(jié)果提供解釋，因?yàn)橐恍┰缙诓∪松踔猎诓唤邮苤委煹那闆r 下將進(jìn)入惰性期。
考慮到白血病患者臨床進(jìn)程的多樣性以及緩解期的巨大可變性，用于預(yù)測(cè)個(gè)體疾病進(jìn)程 的可靠的指示體系的需求變得重要，它可以幫助臨床工作者鑒定出將進(jìn)入發(fā)展?fàn)顟B(tài)的患者， 并讓他們能夠選擇在疾病的更早期接受攻擊性或?qū)嶒?yàn)性治療。此外，臨床治療中，可以根據(jù) 患者預(yù)后情況，針對(duì)患者使用新藥或者實(shí)驗(yàn)性治療手段，從而發(fā)現(xiàn)臨床治療中的更多相關(guān)結(jié) 果。
本發(fā)明滿足了這種需求并且?guī)?lái)了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分 布的方法。本發(fā)明的復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于鑒別個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)相關(guān)亞群的預(yù)后和 治療、以及預(yù)測(cè)個(gè)體的疾病進(jìn)程，本發(fā)明的方法為罹患腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體提供用于選擇 治療方式的工具，包括用于確定危險(xiǎn)人群的方法、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、預(yù)測(cè)發(fā)生繼發(fā) 性并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、為個(gè)體選擇治療方案的方法、預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)的方法、確 定對(duì)個(gè)體治療效果的方法、確定個(gè)體的預(yù)后的方法。特別地，本發(fā)明的方法公開了一種建立 復(fù)合標(biāo)志物分布的方法，其可用作預(yù)后指示來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的進(jìn)程是攻擊性還 是惰性，從而幫助臨床工作者處理病人和評(píng)估將要使用的治療形式。
在特別公開的實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的在于建立用于白血病的復(fù)合標(biāo)志物分布，該白 血病選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病 (CML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)所構(gòu)成的組。公開的本方法所建立的復(fù)合標(biāo)志物
分布可以用在罹患白血病的個(gè)體臨床處理所有方面，包括例如，確定罹患白血病的個(gè)體為 白血病危險(xiǎn)群體、預(yù)測(cè)罹患白血病的個(gè)體是否有復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)測(cè)罹患白血病的個(gè)體是否 有發(fā)生繼發(fā)性并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)；這些本方法為罹患白血病的個(gè)體確定預(yù)后提供幫助、為罹患 白血病的個(gè)體選擇治療方案、為接受一項(xiàng)或多項(xiàng)白血病治療的個(gè)體監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)。


圖1為用于顯示建立復(fù)合標(biāo)志物分布的樣品制備方法的示意圖。
圖2為由用于一例CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略方案所獲得的流式細(xì)胞儀面板。
圖3為由用于CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略所獲得的流式細(xì)胞儀面板。
圖4為描述一例CLL樣品中存在的細(xì)胞空間中ZAP-70表達(dá)情況的示意圖。(紅色B
細(xì)胞；綠色正常T細(xì)胞；紫色NK細(xì)胞)
圖5為描述一例AML樣品中mTOR激活S6情況的流式細(xì)胞儀面板。 圖6為外周血中動(dòng)員干細(xì)胞(CD34+)的復(fù)合分布示意圖。直方圖提供了與未處理樣品 (紅)相比，在用PMA (藍(lán))、干細(xì)胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)激活后每個(gè)動(dòng)員干細(xì)胞、
正常粒細(xì)胞、正常單核細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞中三種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT
的反應(yīng)情況比較。
圖7為單個(gè)AML患者的復(fù)合分布示意圖。等分血樣用PMA刺激，用或者不用特異性信
號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑(圖例見(jiàn)右下角)刺激，或用干細(xì)胞因子刺激。反應(yīng)結(jié)果用P-ERK對(duì)P-S6
的雙邊量散點(diǎn)圖檢測(cè)(右側(cè)面板)，紅色群表示AML胚細(xì)胞，藍(lán)色表示內(nèi)在淋巴細(xì)胞，綠色
表示內(nèi)在粒細(xì)胞。AML胚細(xì)胞(紅)、淋巴細(xì)胞(藍(lán))和粒細(xì)胞(綠)通過(guò)使用左邊兩個(gè)框
中描述的CD34側(cè)向散射來(lái)鑒定。
圖8為CLL中ZAP-70表達(dá)的復(fù)合分布示意圖。綠色CD5陰性B細(xì)胞；藍(lán)色CD5+B
細(xì)胞；粉色T細(xì)胞(CD5+/CD3+);紫色NK細(xì)胞(CD5陰性/CD56+)。每一個(gè)獨(dú)立地被
換算成亞型產(chǎn)生次數(shù)的柱狀圖顯示出了重疊柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的在于提供用于為從疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體得到的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物 分布的方法。本發(fā)明中的復(fù)合標(biāo)志物分布可用來(lái)鑒別個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)預(yù)后和治療相關(guān) 亞群、以及用來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體的臨床進(jìn)程。本發(fā)明的方法為罹患腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體提供用于 臨床處理的工具，包括用于確定危險(xiǎn)人群的方法、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、預(yù)測(cè)發(fā)生繼發(fā) 性并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、為個(gè)體選擇治療方案的方法、確定對(duì)個(gè)體治療效果的方法、確定
個(gè)體預(yù)后的方法。
某種意義上，本發(fā)明基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物的出現(xiàn)與一種或更多 選出的靶蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)，這樣就有可能制備一種復(fù)合標(biāo)志物分布，該分布根據(jù)不同樣品間的 內(nèi)在細(xì)胞群的陽(yáng)性和陰性比較而表現(xiàn)為一種定量檢測(cè)。
特別地，本發(fā)明的方法公開了一種建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法，該復(fù)合標(biāo)志物分布可作 為一種預(yù)后指示物，用來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的臨床進(jìn)程是將具有攻擊性還是惰性， 從而幫助臨床工作人員處理患者并評(píng)估將要使用的治療形式。
在這里公開的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法目的在于建立用于白血病的復(fù)合標(biāo)志物分布，
該白血病選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白 血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)所構(gòu)成的組。通過(guò)公開的方法而建立的復(fù)合標(biāo) 志物分布可以用在罹患白血病的個(gè)體臨床處理的所有方面，包括比如，確定罹患白血病的 個(gè)體為白血病危險(xiǎn)群體、預(yù)測(cè)罹患白血病的個(gè)體是否具有復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)測(cè)罹患白血病的 個(gè)體是否具有發(fā)生繼發(fā)性并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)；這些方法為罹患白血病的個(gè)體確定預(yù)后提供幫助、 為罹患白血病的個(gè)體選擇治療方案、為接受一項(xiàng)或多項(xiàng)白血病治療的個(gè)體監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)。
通過(guò)本發(fā)明的方法而建立的復(fù)合標(biāo)志物分布包括將生物樣品與一結(jié)合分子集發(fā)生反應(yīng)， 其中該結(jié)合分子集包括兩組或兩組以上對(duì)明顯的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子。 標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別出樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，并且 可以用于通過(guò)檢測(cè)鑒別標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性 轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，所述結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。最終， 通過(guò)將每個(gè)正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與靶蛋白的存在相關(guān)聯(lián)，本發(fā)明的 方法可以為從疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體所得到的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
本發(fā)明的方法建立的復(fù)合分布具有預(yù)料不到的優(yōu)點(diǎn)，并且基于生物樣品中細(xì)胞標(biāo)志物的 存在，解決了疾病進(jìn)程預(yù)測(cè)中遇到的各種困難。如此所說(shuō)，本發(fā)明的靶蛋白可以通過(guò)參照樣 品中含有的、并且已知對(duì)所研究的細(xì)胞靶呈陰性和陽(yáng)性的多種細(xì)胞群，來(lái)確定所研究的細(xì)胞 靶的半定量水平。如本方法所述，所研究的細(xì)胞靶的存在和水平分別與樣品中的多個(gè)陽(yáng)性細(xì) 胞群相關(guān)聯(lián)，所述陽(yáng)性細(xì)胞群為包含樣品中的細(xì)胞群、以及特征為所研究的細(xì)胞靶水平可變 的細(xì)胞群。此外，本方法將所研究的細(xì)胞靶分子的存在和水平與樣品中一種或更多的已知呈 靶蛋白陰性的內(nèi)在細(xì)胞群相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明的方法不是使用不相關(guān)的抗原來(lái)提供定量的 內(nèi)參，而是把多個(gè)對(duì)所研究的細(xì)胞耙呈陽(yáng)性的內(nèi)在細(xì)胞群聯(lián)系起來(lái)，并可用于根據(jù)個(gè)體的復(fù) 合分布來(lái)生成靶向治療策略。本發(fā)明的方法可以用來(lái)對(duì)樣品內(nèi)具有陰性或陽(yáng)性細(xì)胞群參照的
任何細(xì)胞耙進(jìn)行定量。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種為從疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體身上獲得的 樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法，其包括如下步驟使生物樣品與結(jié)合分子集進(jìn)行反應(yīng)的步 驟，其中所述結(jié)合分子集包括兩組或兩組以上的對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié) 合分子，并且其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化 細(xì)胞群；通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化 細(xì)胞群的存在，其中所述標(biāo)志物水平和結(jié)合可鑒別樣品內(nèi)部正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群； 以及然后將每個(gè)正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從 而建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
在一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的方法應(yīng)用于一種進(jìn)一步被定義為"血癌"的癌 癥，該術(shù)語(yǔ)是指造血組織的惡性瘤，包括白血病、淋巴瘤和多種骨髓瘤。白血病包括急性骨 髓性白血病或急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、 慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞白血病(HCL)、胚 芽型骨髓增生異常綜合征(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)、和通過(guò)形態(tài)學(xué)、組織學(xué) 以及免疫學(xué)技術(shù)等本領(lǐng)域技術(shù)人員所定義的這些白血病的所有亞型。在本發(fā)明的一個(gè)特別具 體實(shí)施方式中，血癌選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢 性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)所構(gòu)成的組。
最初白血病根據(jù)預(yù)期存活時(shí)間分為急性或慢性，但是現(xiàn)在根據(jù)細(xì)胞成熟度區(qū)分。急性白 血病主要由未成熟細(xì)胞(通常為胚細(xì)胞形式)組成，而慢性白血病含有更多的成熟細(xì)胞。急 性白血病表現(xiàn)為未成熟血細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。這種大量未成熟細(xì)胞的生長(zhǎng)使骨髓不能產(chǎn)生健康 的血細(xì)胞。急性白血病進(jìn)一步分為成淋巴細(xì)胞性(ALL)和髓細(xì)胞性(AML)類型，其可根 據(jù)法-美-英(FAB)分類法或免疫顯型法的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)表現(xiàn)而進(jìn)一步細(xì)分。將特異的T 細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓性抗原的單克隆抗體與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)于區(qū)分ALL和AML非 常有幫助，這種區(qū)分對(duì)治療至關(guān)重要。
急性白血病包括急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。白血病 細(xì)胞在骨髓中聚集，取代正常的血液細(xì)胞，并且擴(kuò)散至肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 腎臟以及性腺。因?yàn)檫@些細(xì)胞來(lái)自血液，因此它們可以滲透到任何一個(gè)器官和部位。ALL通 常浸染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而急性單核細(xì)胞白血病會(huì)浸染齒齦，而AML可以包括在任何部位形 成的聚集體(粒細(xì)胞肉瘤或綠色瘤)。
慢性白血病分為慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)。 CLL包
括涉及淋巴結(jié)和其余淋巴組織的外觀成熟淋巴細(xì)胞的克隆性擴(kuò)張，與對(duì)骨髓的進(jìn)展性滲透有 關(guān)并出現(xiàn)在外周血中。對(duì)CLL的傳統(tǒng)描述已經(jīng)成為最常見(jiàn)的亞型，特別是B細(xì)胞的形式幾乎 在所有病例中可見(jiàn)。在2%到3%的病例中，類型表現(xiàn)為T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)張，而且此類型依 然具有亞型，特別是隨血球減少的大顆粒淋巴細(xì)胞。另外，其他慢性白血病的形式也被歸類 到CLL名下前淋巴細(xì)胞白血病，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的白血病樣階段(Sezary綜合癥)，毛 細(xì)胞白血病，淋巴瘤白血病(惡性淋巴瘤發(fā)展階段的白血病樣改變)。這些典型CLL亞型的 分化通常很容易辨別。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種方法，包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子集 反應(yīng)，從而為來(lái)自疑似B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中 所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子；接 著通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存 在，其中標(biāo)志物結(jié)合情況可識(shí)別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；并且使正常和腫瘤性 轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與ZAP-70的存在相關(guān)聯(lián)，從而為來(lái)自疑似B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性 白血病(B-CLL)個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
B-CLL的特征表現(xiàn)為CD5+細(xì)胞的克隆積累(Caligaris-Cappio， et al， J Exp Med 155: 623-8, 1982)。特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)可以區(qū)別出人類B細(xì)胞的亞型，該亞型在不同分化和 激活階段是不同的，并且具有生物學(xué)特性(Clark and Lane, Ann Rev Immunol 9:97-127,1991 )。 特別地，CD38和IgD表達(dá)的分析在辨別B細(xì)胞處于從幼稚到成熟細(xì)胞的各個(gè)分化階段中尤 其有用(Pascual, et al., J Exp Med 180:329-339， 1994; Zupo, et al.， Blood, 88:1365-1374, 1996)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種方法，包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子
集反應(yīng)，從而為來(lái)自疑似CML個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中所述結(jié)合分子集含有
兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志
物結(jié)合情況可識(shí)別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；接下來(lái)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志 物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情 況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；并且使正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群標(biāo)志 物水平與至少一種靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑似CML個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志 物分布。在該實(shí)施方式中，該耙蛋白可選自由活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡 標(biāo)志物所構(gòu)成的組。
慢性骨髓性白血病(CML)是一種具有明顯不同于其他種類白血病的臨床和病理特征的 白血病。普遍認(rèn)為CML的病因是由于人9號(hào)染色體和22號(hào)染色體之間的特異性染色質(zhì)易位。 易位后產(chǎn)生的異常染色體常常被叫做費(fèi)城染色體(Darnell, J. et al., Molecular Cell Biology, 2nd Ed., W. H. Freeman and Co., New York(l990), p. 992)。 C-abl (ABL)基因， 一個(gè)據(jù)認(rèn)為有關(guān)生 長(zhǎng)調(diào)控的酪氨酸激酶，定位于人9號(hào)染色體的末梢臂上，而c-bcr(BCR)基因定位于22號(hào) 染色體。易位將ABL啟動(dòng)子末梢包括編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的元件的三個(gè)外顯子置于BCR 的第一或者第二外顯子的下游(Chung, S. and Wong， P. M. C.， Oncogene, 10:1261-1268 (1995))。 人類9號(hào)和22號(hào)染色體間的易位產(chǎn)物是一個(gè)嵌合基因，BCR-ABL，其編碼一個(gè)融合蛋白， 取決于是否包含BCR的第二個(gè)外顯子，通常寫作pl85bCT-abl或者p210beMbl(Bartarm, C. R., et al., Nature, 306:277-280(1983))。 pl85bc>abl會(huì)導(dǎo)致急性白血病，典型的是成淋巴細(xì)胞性白血??； p210bCT—31)|通常導(dǎo)致CML，但是偶爾也能導(dǎo)致急性白血病。
CML涉及惡性多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的克隆性骨髓增生，臨床特征為粒細(xì)胞的過(guò)度產(chǎn)生， 主要在骨髓，也可見(jiàn)于髓外組織，(比如脾臟、肝臟)。盡管粒細(xì)胞增殖占主要地位，但腫瘤 性轉(zhuǎn)化克隆還涉及RBC、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、甚至一些T和B細(xì)胞。正常干細(xì)胞仍然存在， 而且可以在藥物抑制CML克隆后仍然會(huì)出現(xiàn)。骨髓富含細(xì)胞，但是20-30%的病人會(huì)發(fā)生骨 髓纖維變性，通常是在幾年后。對(duì)大多數(shù)病人而言，CML復(fù)制會(huì)進(jìn)入一個(gè)加速階段，最終導(dǎo) 致胚細(xì)胞危機(jī)。在這時(shí)，胚細(xì)胞瘤會(huì)發(fā)展至髓外組織，包括骨、中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS、淋巴結(jié) 和皮膚。
慢性髓性白血病(CML)表現(xiàn)出一個(gè)特別的病程，最初為慢性粒細(xì)胞增生癥，然后總是 由于某個(gè)低分化顯型(即，疾病的胚細(xì)胞危象階段)的細(xì)胞克隆性擴(kuò)增而進(jìn)化為急性白血病。 CML是一個(gè)不穩(wěn)定的疾病，最終進(jìn)行到終末階段，表現(xiàn)為急性白血病。2004年，在美國(guó)， 這個(gè)致命的疾病影響了大約9730位患者?；熕幬锢缌u基脲和白消安可以降低淋巴細(xì)胞載 量，但是不影響患者的生存期(例如大概4年)。所以，CML患者是骨髓移植(BMT)療法 的候選人。但是對(duì)于BMT生存患者而言，疾病復(fù)發(fā)仍然是一個(gè)主要的障礙(Apperley et al., 1988 Br. J. Haematol. 69, 239)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種方法，包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子 集反應(yīng)，從而為來(lái)自疑似AML個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中所述結(jié)合分子集含有 兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志 物結(jié)合情況可識(shí)別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群接下來(lái)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志 物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情 況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；并且使正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群標(biāo)志物水平 與至少一種耙蛋白的存在聯(lián)系起來(lái)，從而為來(lái)自疑似急性髓性白血病(AML)個(gè)體的樣本建
立復(fù)合標(biāo)志物分布。在該實(shí)施方式中，該靶蛋白可選自由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡 標(biāo)志物所構(gòu)成的組。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種方法，包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子 集反應(yīng)，從而為來(lái)自疑似急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其 中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子， 其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況可識(shí)別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；接下來(lái)通過(guò) 檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，其 中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；并且使正常和腫瘤性 轉(zhuǎn)化細(xì)胞群標(biāo)志物水平與至少一種靶蛋白的存在聯(lián)系起來(lái)，從而為來(lái)自疑似ALL個(gè)體的樣本 建立復(fù)合標(biāo)志物分布。在該實(shí)施方式中，該靶蛋白可選自由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋 亡標(biāo)志物所構(gòu)成的組。
在這里，術(shù)語(yǔ)"腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)"指的是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的狀態(tài)，其特征為正?？?制的缺失，該缺失會(huì)導(dǎo)致一種或者多種癥狀，包括不可調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)，分化缺失，所在組織 侵襲，和轉(zhuǎn)移。像在這里描述的那樣，當(dāng)為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo) 志物分布時(shí)，生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特 的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中相關(guān)標(biāo)志物可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤 性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。
生物樣品最好直接采集于個(gè)體，特別是被懷疑有癌癥的個(gè)體，并且接下去以合適的方式 為該樣品建立復(fù)合分布。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，生物液體可以是，例如，全血、外周血單 個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)、骨髓穿刺物或者淋巴組織。合適的生物液體包括任何身體組織或體液。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，身體組織可以是骨髓抽吸物、骨髓活檢切片、淋巴結(jié)穿刺物、淋巴結(jié) 切片、脾臟組織、細(xì)針穿刺物、皮膚活檢切片或者器官組織活檢切片，組織部分和脫落細(xì)胞。 其他實(shí)施方式包括的體液樣品是外周血、淋巴液、腹水、血漿和腦脊髓液。就急性白血病而 言，全血和骨髓穿刺物是特別合適的生物樣品。在一個(gè)生物樣品包含全血的實(shí)施方式中，提 供的樣品可以包括固定和滲透的白細(xì)胞和紅細(xì)胞的裂解液?？梢岳斫獾氖?，提供的包含很高 水平紅細(xì)胞的生物樣品可以通過(guò)處理來(lái)去除紅細(xì)胞，例如，通過(guò)低滲透壓裂解、去垢劑處理 和密度-梯度離心。
如同這里描述的那樣，在本發(fā)明的方法中，生物樣品與結(jié)合分子集相接觸，其中所述結(jié) 合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中相關(guān) 標(biāo)志物可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。這里使用的術(shù)語(yǔ)"結(jié)合分子"指的是任
何可以通過(guò)足夠的親和力與抗原結(jié)合從而現(xiàn)示出選擇性結(jié)合活性的分子。結(jié)合分子的例子包 括抗體、抗體片段和抗體樣分子。抗體可以通過(guò)B細(xì)胞、雜交瘤產(chǎn)生，并且可以是嵌合抗體 或人源化抗體或其任何片段，例如，F(xiàn)(ab')2和Fab片段、以及單鏈或單一結(jié)構(gòu)域抗體。
在實(shí)踐本發(fā)明方法中的有用結(jié)合分子可以是單鏈抗體，它由抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)通 過(guò)一個(gè)通常含有10至30個(gè)氨基酸、優(yōu)選為15-25個(gè)氨基酸的連接肽進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。所以， 這樣一個(gè)結(jié)構(gòu)不包括重、輕鏈的恒定區(qū)，而且據(jù)認(rèn)為這個(gè)小肽間隔區(qū)相比完整恒定區(qū)具有較 弱的抗原性。在實(shí)踐本發(fā)明方法中的有用結(jié)合分子也可以是嵌合抗體，它是這樣一種抗體 重鏈或者輕鏈或兩者的恒定區(qū)皆來(lái)源于人，而重、輕鏈的可變區(qū)都不是人源性的，比如是鼠 源性的。在實(shí)踐本發(fā)明方法中的有用結(jié)合分子還可以是人源化抗體，它的高變區(qū)(CDRs)不 是人源性的，比如，是鼠源性的，而它的所有或者幾乎所有其他免疫球蛋白部分、特別是恒 定區(qū)和可變區(qū)的高度保守區(qū)域(特別是架構(gòu)區(qū)域)，是人源性的。人源化抗體可以在挨著高變 區(qū)的架構(gòu)區(qū)域保留一點(diǎn)來(lái)源于小鼠序列的氨基酸。高變區(qū)可以與任何架構(gòu)區(qū)域相聯(lián)，最好是 鼠源性或者人源性的架構(gòu)區(qū)域。合適的架構(gòu)區(qū)域是眾所周知的，在現(xiàn)有技術(shù)中也有描述。所 有前面提到的結(jié)合分子都適于實(shí)踐本發(fā)明的方法。
本發(fā)明方法中使用的結(jié)合分子集合包含兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有 特異性的結(jié)合分子，所述標(biāo)志物可以辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。這里使用的 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物"指的是這樣一種抗原，其單獨(dú)或者與一個(gè)或者幾個(gè)不同的抗原組 合在一起用于依靠被選擇性地結(jié)合于結(jié)合分子而辨別在生物樣品內(nèi)部的一個(gè)或更多細(xì)胞群。 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的那樣，細(xì)胞群可以基于與獨(dú)特的標(biāo)志物，例如，展示在細(xì)胞表面 的細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)合而被識(shí)別。對(duì)于急性白血病而言，細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物包括，例如， CD45、 CD2,CD3、 CD7、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD33、 CD34、 CD56、 CD71、 CD117、 HLA-DR。取決于使用者，可以加入補(bǔ)充標(biāo)志物，例如，CDla、 cCD3、 CD4、 CD5、 CD8、 cCD22、 CD61、血型糖蛋白A和TdT。如同這里描述的，對(duì)于來(lái)自于疑 似AML個(gè)體的生物樣品，對(duì)于建立復(fù)合分布有用的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物可以包括，例如，CD45、 CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓過(guò)氧化物酶)、CD64、 CD117
(c-kit受體)。另夕卜，對(duì)于M6-M7型白血病，取決于使用者，可以加入標(biāo)志物例如CD41、 CD42、 CD61、 CD62P、 CD71、血型糖蛋白A、血紅素。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)樣品細(xì)胞性有限時(shí)， 幾乎沒(méi)有標(biāo)志物可以被分析。對(duì)于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)鑒別和定量細(xì)胞群而言，CD分子是方便 的診斷標(biāo)準(zhǔn)物。流式細(xì)胞術(shù)是用于計(jì)數(shù)、檢査和分類懸浮在液流中的顯微微粒的技術(shù)。流式 細(xì)胞術(shù)程序開始于細(xì)胞或者組織的獲得，經(jīng)過(guò)染色和洗滌，接下來(lái)通過(guò)在流式細(xì)胞儀上獲得
流體數(shù)據(jù)，并且以數(shù)據(jù)分析和報(bào)告結(jié)果而告終。
在實(shí)施這里所說(shuō)的方法時(shí)，所研究的細(xì)胞群包括不同種類的白細(xì)胞，特別是粒細(xì)胞，淋 巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。有三種粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞。白細(xì)胞還包括 淋巴細(xì)胞，其包括B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞或"NK細(xì)胞"是健康個(gè) 體內(nèi)包含2-15%外周血單核細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞。雖然大多數(shù)NK細(xì)胞是CD3:TCR'、 CD16+、 CD56+，在這個(gè)群體中仍然有相當(dāng)?shù)谋硇秃凸δ墚愘|(zhì)性(Trinchieri, Adv. Immunol., 47:187 (1989))。例如，人們發(fā)現(xiàn)CD56的表面密度限定了功能獨(dú)特的NK細(xì)胞群。CD56b喊tNK 細(xì)胞大部分是CD16+，其為無(wú)顆粒淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞溶解效應(yīng)功能方面有缺陷，其在對(duì)外源 性IL-2的反應(yīng)上會(huì)劇烈增殖。CD56dim NK細(xì)胞是具有潛在的細(xì)胞溶解效應(yīng)功能的CD16+ LGLs,其在對(duì)IL-2的反應(yīng)上不增殖。因?yàn)橐恍㏕細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD16和CD56，這些分子本 身不能限定NK細(xì)胞群(Trinchieri，1989)。另外，因?yàn)樵诠δ芊只腘K細(xì)胞群上CD56的表 達(dá)較低，單克隆抗體與CD56的反應(yīng)性不能可靠地用于將樣品中NK細(xì)胞的亞群與其他細(xì)胞 區(qū)分開來(lái)。除了能夠區(qū)分正常細(xì)胞群外，在本發(fā)明的方法中可以使用結(jié)合分子，以便鑒定樣 品內(nèi)部的腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。對(duì)于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒別和定量細(xì)胞群而言，CD分子是方便的 診斷標(biāo)準(zhǔn)物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平，例如CD38+對(duì)于 B-CLL的表達(dá)，是通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)決定的，該過(guò)程中，細(xì)胞被標(biāo)記了連接有熒光染料或 者酶的單克隆抗體，雖然可見(jiàn)免疫熒光法或者其他方法也可以使用。在具體的實(shí)施方式中， 分析了生物樣品，用于分析細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物結(jié)合性的表面表達(dá)，例如，通過(guò)多色免疫熒 光，使用對(duì)某個(gè)特定細(xì)胞型相關(guān)群體具有特異性的結(jié)合分子集合進(jìn)行分析。應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合 分子的任何結(jié)合性都可以進(jìn)行選擇，所述結(jié)合性對(duì)于在生物樣品中鑒別特定細(xì)胞性相關(guān)群體 具有特異性。
如同這里描述的那樣，對(duì)于來(lái)自于疑似CLL的個(gè)體的生物樣品，對(duì)于建立其復(fù)合分布， 有用的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物可以包括例如，用于鑒別T細(xì)胞的CD3，用于鑒別正常T細(xì)胞和 惡性B細(xì)胞的CD5，用于鑒別正常B細(xì)胞和惡性B細(xì)胞的CD19，用于鑒別正常NK細(xì)胞的 CD56，用于鑒別激活的B細(xì)胞或者濾泡外套層B細(xì)胞的CD23，用于鑒別細(xì)胞激活和分化的 CD38，作為細(xì)胞質(zhì)B細(xì)胞系標(biāo)志物的CD79b，作為正常B細(xì)胞系標(biāo)志物并且是特征性地在 B-CLL中呈陰性的FMC7。所以，對(duì)于鑒別B-CLL中細(xì)胞群有用的標(biāo)志物結(jié)合包括CD5陽(yáng) 性與CD19陽(yáng)性；CD5陽(yáng)性與CD20陰性;CD3陽(yáng)性或者CD56陽(yáng)性;以及CD3陽(yáng)性。
這個(gè)方法可以通過(guò)使用任何含有B-CLL細(xì)胞的組織而實(shí)現(xiàn)，所述組織包括但不局限于脾 臟、淋巴結(jié)、骨髓、淋巴液、外周血、來(lái)自于個(gè)體的全血樣品、或者經(jīng)過(guò)處理并進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離的全血樣品。
作為早期造血前體細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化結(jié)果，慢性髓性白血病(CML)的臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為 外周血循環(huán)中未成熟和成熟的髓樣細(xì)胞積累，細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)為費(fèi)城染色體的出現(xiàn)。在CML 中可表達(dá)髓系抗原CD33、 CD13、 CDll、 CD45和它的同種型CD45RO，但不表達(dá)有助于分 辨CML與急性髓性白血病(AML)的CD45RA。因?yàn)镃ML細(xì)胞表達(dá)HLA-DR，它們可以與 正常骨髓前體相區(qū)別。在本發(fā)明涉及疑似CML個(gè)體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物選自 下組用于鑒別未成熟或者"胚"細(xì)胞群的CD45、 CD34，用于鑒別正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化髓樣 細(xì)胞的CDllb，用于鑒別正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化髓樣細(xì)胞的CD13、 CD15，用于鑒別正常和腫瘤 性轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的CD14、 CD33、 CD79a和b，用于鑒別惡性細(xì)胞CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl， 和用于鑒別正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群分化狀態(tài)的末端脫氧核苷酸酶轉(zhuǎn)移酶(TdT)。
如同這里描述的，細(xì)胞群可以基于獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物的結(jié)合而被辨別，所述標(biāo)志 物例如是表達(dá)展示在細(xì)胞表面的細(xì)胞表面標(biāo)志物。在本發(fā)明的方法中，正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化的 內(nèi)部細(xì)胞群的鑒別是基于細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物的表達(dá)和水平，之前進(jìn)行使每個(gè)細(xì)胞群與至少 一種耙蛋白的存在相關(guān)聯(lián)的步驟。因此，最初的內(nèi)部細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物結(jié)合情況用來(lái)鑒別 正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，隨后與至少一種靶蛋白的存在相聯(lián)系。應(yīng)當(dāng)理解，基于生物樣品 內(nèi)部的特定細(xì)胞群，可以選擇細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物的出現(xiàn)和表達(dá)水平的結(jié)合方式，這些結(jié)合 方式預(yù)期用于進(jìn)一步與所研究的靶蛋白相關(guān)聯(lián)。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，當(dāng)通過(guò)在樣品中外源性加 入或者摻入合適的參照細(xì)胞群而在樣品中不存在參照群體時(shí)，基于與內(nèi)部細(xì)胞對(duì)照群體的比 較進(jìn)行的染色定量的方法可以推廣至應(yīng)用方面。
基于與B-CLL相關(guān)的實(shí)施方式的細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物表達(dá)和水平而鑒定的特定正常和腫 瘤性轉(zhuǎn)化內(nèi)部細(xì)胞，可以包含這樣一個(gè)群體CD5陽(yáng)性和CD19陽(yáng)性；CD5陽(yáng)性和CD20陰 性;CD3陽(yáng)性和CD56陽(yáng)性;CD3陽(yáng)性。作為本發(fā)明原則的例子，正常的或者活性T細(xì)胞(CD3+) 和NK細(xì)胞(CD56+)對(duì)于ZAP-70蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，而正常B細(xì)胞(CD19+/CD5-)和正常 粒細(xì)胞(通過(guò)單獨(dú)或者與CD45交聯(lián)后光散射特性而鑒定)對(duì)于ZAP-70蛋白表達(dá)呈陰性。這 些樣品內(nèi)部的細(xì)胞群被用于確定B-CLL (腫瘤性轉(zhuǎn)化)群體中ZAP-70表達(dá)水平，還一起被 用來(lái)建立復(fù)合體系，該ZAP-70蛋白是通過(guò)相對(duì)于內(nèi)部陽(yáng)性和陰性細(xì)胞群呈CD19+/CD5+ (有 潛力與其他標(biāo)志物例如FCM7-偶聯(lián))而鑒定的。
在針對(duì)CML的實(shí)施方式中，細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志物可以鑒別細(xì)胞群，所述細(xì)胞群除了任 何正常淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、或者粒細(xì)胞外，還包含淋巴顆粒細(xì)胞和另一種包含淋巴單核細(xì) 胞的細(xì)胞群。所以，本發(fā)明提供了一種方法，包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，從
而為來(lái)自疑似CML個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更 多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況 可識(shí)別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；接下來(lái)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況， 來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品 內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；并且使正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群標(biāo)志物水平與至少一種靶 蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑似慢性髓性白血病(CML)個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物 分布。在該實(shí)施方式中，該靶蛋白可選自由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物所構(gòu)成 的組。
生物樣品經(jīng)處理可以用于復(fù)合標(biāo)志物分布的建立，該建立方法使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可選 的任何細(xì)胞準(zhǔn)備方法和適合于樣品的染色處理。應(yīng)當(dāng)理解，準(zhǔn)備和染色步驟一般包括RBC裂 解、染色、固定、滲透，這些步驟的次序可以有某些變化，只要所研究的細(xì)胞群相關(guān)性標(biāo)志 物仍然存在，允許進(jìn)行這里描述的細(xì)胞群鑒別，就可以采用上述準(zhǔn)備和染色步驟。合適的準(zhǔn) 備步驟已本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，本文描述了，例如，使用低滲裂解對(duì)全血、骨髓、腹水等 進(jìn)行紅細(xì)胞裂解(以獲得純化的WBC群)，或者使用密度梯度離心技術(shù)(例如Hyp叫ue/Fico11) 以獲得富含單核細(xì)胞的樣品。
所以，在本發(fā)明為來(lái)自于疑似腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法中， 使樣品首先與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相 關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，以辨別正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。如同上文所述，結(jié)合分 子集可以被使用者選擇，以便鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。 一旦正常和腫瘤性 轉(zhuǎn)化細(xì)胞群得到鑒別，還可以將該細(xì)胞群與靶蛋白的存在相關(guān)聯(lián)，從而建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
這里使用的術(shù)語(yǔ)"靶蛋白"指的是這樣一種蛋白，作為其在調(diào)節(jié)正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 群的細(xì)胞反應(yīng)、表現(xiàn)、功能中的作用，可以用于建立復(fù)合標(biāo)志物分布。在建立本發(fā)明的復(fù)合 標(biāo)志物分布中，通常會(huì)測(cè)量一種或者更多種靶蛋白對(duì)調(diào)節(jié)性刺激物的功能反應(yīng)，比較樣品內(nèi) 部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。本發(fā)明方法中有用的靶蛋白可以是，比如，信號(hào)分子，其介 導(dǎo)細(xì)胞代謝的相關(guān)效應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡，或者實(shí)現(xiàn)其他任何生理作用。相應(yīng)地，靶 蛋白的調(diào)節(jié)狀態(tài)可以當(dāng)其作為一個(gè)特異性或者合適的底物、分子轉(zhuǎn)接蛋白、或者信號(hào)途徑的 組分而提高一個(gè)生物反應(yīng)時(shí)得到測(cè)量。為了建立本發(fā)明的復(fù)合標(biāo)志物分布，靶蛋白的調(diào)節(jié)狀 態(tài)例如磷酸化狀態(tài)，可以通過(guò)樣品內(nèi)部的腫瘤性轉(zhuǎn)化和正常細(xì)胞群來(lái)測(cè)定。
這里使用的術(shù)語(yǔ)"復(fù)合標(biāo)志物分布"，指的是比較生物樣品內(nèi)部獨(dú)特的細(xì)胞群靶蛋白表 達(dá)水平矩陣，復(fù)合標(biāo)志物分布代表了生物樣品內(nèi)量化的靶蛋白，該量化是基于腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)
胞內(nèi)的靶蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)靶蛋白呈陽(yáng)性的正常細(xì)胞群中靶蛋白染色水平的標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)靶蛋 白呈陽(yáng)性的正常細(xì)胞群用作不同靶蛋白表達(dá)水平的陽(yáng)性對(duì)照。 一種或者多種內(nèi)部不表達(dá)靶蛋 白的正常細(xì)胞群可以作為陰性對(duì)照。在組織樣品中，外周血污染可以導(dǎo)致足夠的用作內(nèi)部陰 性對(duì)照的粒細(xì)胞。
在為來(lái)自于疑似AML或者CML的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法中，靶蛋白可 以是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，例如，Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Flt3、 Akt/PKB、 ERK、 mTOR或S6。圖5顯示了描述在AML樣品中被mTOR激活的S6激活情況的流式細(xì) 胞術(shù)儀面板。另外，在為來(lái)自于疑似CML個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法中，靶蛋 白可以是增殖標(biāo)志物，例如周期蛋白Dl或者周期蛋白A2，以及是一個(gè)凋亡標(biāo)志，例如 cleaved-Caspase-3或者Bcl-XI。圖6顯示了一個(gè)通過(guò)比較在CD34+干細(xì)胞至內(nèi)參照群體(淋 巴細(xì)胞，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)內(nèi)三種不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT對(duì)三種 刺激的反應(yīng)而建立外周血干細(xì)胞中動(dòng)員干細(xì)胞的復(fù)合分布。圖7描述了根據(jù)AML患者樣本， 通過(guò)測(cè)定血液樣品中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶蛋白P-ERK和P-S6的表達(dá)情況，并將在AML (紅色)胚細(xì) 胞中的表達(dá)與在內(nèi)參照群淋巴細(xì)胞(藍(lán)色)和粒細(xì)胞(綠色)中的表達(dá)相比較，從而建立的 復(fù)合分布。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，B-CLL中ZAP-70的量化檢測(cè)可以通過(guò)相對(duì)于正常T和自 然殺傷細(xì)胞中的ZAP-70染色水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而實(shí)現(xiàn)，這兩種細(xì)胞都是ZAP-70陽(yáng)性。在本實(shí) 施方式中，其目的在于為罹患特定復(fù)合標(biāo)志物分布的個(gè)體建立復(fù)合標(biāo)志物分布，所述特定復(fù) 合標(biāo)志物分布是為來(lái)自疑似B-CLL個(gè)體的樣品建立的。本實(shí)施方式中，由于自然殺傷細(xì)胞相 比T細(xì)胞有更明亮的染色，正常T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞提供了兩種不同亮度的陽(yáng)性對(duì)照。在 本實(shí)施方式中，外周血和骨髓生物樣品中的粒細(xì)胞和正常B細(xì)胞是ZAP-70陰性的，可以作 為陰性對(duì)照。
在此公開的特定實(shí)施方式中，檢測(cè)靶蛋白用于可以和某個(gè)狀況相聯(lián)系的修飾，比如磷酸 化狀態(tài)。細(xì)胞很大程度上依靠細(xì)胞外分子，該分子作為一種手段以便從其所處外界環(huán)境接受 刺激。這些細(xì)胞外信號(hào)對(duì)于正確調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過(guò)程比如分化、收縮、分泌、細(xì)胞分裂、接 觸抑制和代謝是必需的，還可以與異常的或者潛在有害的過(guò)程比如病毒-受體反應(yīng)、炎癥和細(xì) 胞轉(zhuǎn)化癌變相關(guān)聯(lián)。該過(guò)程的中心特點(diǎn)即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是某些蛋白的可逆磷酸化。磷酸化是一個(gè) 包括競(jìng)爭(zhēng)性磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，任意給定瞬間的磷酸化水平反映了此時(shí)催化這些 反應(yīng)的蛋白酶和磷酸酶的相對(duì)活性。
所以，本發(fā)明的復(fù)合標(biāo)志物分布可以將靶蛋白的磷酸化或去磷酸化相關(guān)聯(lián)，而不僅僅是
它的表達(dá)，因?yàn)楸徽{(diào)節(jié)的蛋白的構(gòu)象變化改變它們的生物學(xué)特性。當(dāng)?shù)鞍琢姿峄饕l(fā)生在 絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基時(shí)，酪氨酸殘基的磷酸化也會(huì)發(fā)生，很多人對(duì)此感興趣，因?yàn)?發(fā)現(xiàn)很多致癌基因產(chǎn)物和生長(zhǎng)因子受體具有內(nèi)源性蛋白酪氨酸酶活性。生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 細(xì)胞周期過(guò)程和腫瘤性轉(zhuǎn)化中的蛋白酪氨酸磷酸化的重要性現(xiàn)在己經(jīng)全面確認(rèn)了 (Cantley et al.， 1991, Cell 64:281-302; Hunter T.， 1991, Cell 64:249-270; Nurse, 1990, Nature 344:503-508; Schlessinger et al., 1992， Neuron 9:383-391; Ullrich et al., 1990， Cell 61:203-212)。正常生長(zhǎng)控制 途徑的破壞導(dǎo)致癌發(fā)生，表明是由于組成一大組主要致癌蛋白的蛋白酪氨酸酶的激活或者過(guò) 度表達(dá)造成的。(Hunter, T.綜述，1991 ，Cell 64:249-270)。如同這里揭示的，本發(fā)明中的復(fù)合標(biāo) 志物分布可以將正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的靶蛋白磷酸化水平與靶蛋白的存在相關(guān)聯(lián)，從而 為來(lái)源于疑似腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所有構(gòu)成復(fù)合標(biāo)志物分布的細(xì)胞群都在生物樣品內(nèi)。當(dāng)針對(duì)生物 樣品時(shí)，這里使用的術(shù)語(yǔ)"內(nèi)部"是指所有的細(xì)胞群最初存在于樣品中，而不是在建立復(fù)合 標(biāo)志物分布之前加入或者"摻入"的方式。在沒(méi)有可以作為陰性對(duì)照的細(xì)胞群的情況下，通 過(guò)比較對(duì)靶蛋白呈陽(yáng)性的正常細(xì)胞和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的內(nèi)部群體而建立對(duì)比矩陣，可以半定 量地確定足夠的靶蛋白水平，從而根據(jù)上面公開的方法建立復(fù)合標(biāo)志物分布?？筛M(jìn)一步想 到，可以將陽(yáng)性或者陰性內(nèi)部細(xì)胞參照群加入生物樣品，假如在樣品中不存在這些參照群的 話。
如上所述，本發(fā)明提供了一種方法，其包括通過(guò)使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，從而 為來(lái)自于疑似B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其 中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子； 并且通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的 存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；同時(shí)使正常 細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群標(biāo)志物水平與ZAP-70的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自于疑似B細(xì) 胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
通過(guò)相對(duì)于皆為ZAP-70陽(yáng)性的正常T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的ZAP-70染色水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) 化，可以實(shí)現(xiàn)B-CLL中ZAP-70的量化。這就提供了兩種不同亮度的陽(yáng)性對(duì)照，其中自然殺 傷細(xì)胞相比T細(xì)胞有更深的染色。在本實(shí)施方式中，外周血和骨髓生物樣品中的粒細(xì)胞或正 常B細(xì)胞是ZAP-70陰性的，可以作為陰性對(duì)照。
在組織樣品中，外周血污染可以提供足夠的粒細(xì)胞來(lái)作為內(nèi)部陰性對(duì)照。當(dāng)沒(méi)有粒細(xì)胞 時(shí)，其相對(duì)于正常T細(xì)胞的比例應(yīng)足以進(jìn)行半定量檢測(cè)。在CLL中可以實(shí)現(xiàn)該半定量檢測(cè)的
抗原的特異性組合體除了 ZAP-7之外是CD19、 CD5和CD56。其他抗體組合可以用于選擇相 關(guān)惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞群體。除了上面提到的以外，還可以包括，而不限于CD3、 CD20、 CD23、 CD79a、 MCF7和免疫球蛋白輕鏈。這里提出的方法可以通過(guò)借助針對(duì)給定的表面或 者細(xì)胞內(nèi)靶蛋白進(jìn)行特異性染色的樣品來(lái)實(shí)施，其中正常細(xì)胞群對(duì)于相同靶蛋白既呈陽(yáng)性又 呈陰性，或者有可進(jìn)行細(xì)胞染色的特性，該正常細(xì)胞群可以存在并可以作為生物參照用于決 定所研究的細(xì)胞群對(duì)于相同的抗原或者標(biāo)志物是否是呈陽(yáng)性。內(nèi)部生物細(xì)胞群還可以用作對(duì) 照以確定所研究的細(xì)胞中抗體或者標(biāo)志物的半定量目水平。內(nèi)部細(xì)胞群可以基于其他細(xì)胞性 質(zhì)而進(jìn)行挑選，包括但不局限于抗原檢測(cè)和散射光特征。所需的特異性標(biāo)志物取決于本發(fā)明 方法的具體應(yīng)用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可據(jù)此選擇。
根據(jù)以上描述的用于為特定血癌制備復(fù)合標(biāo)志物分布的實(shí)施方式可以延伸至診斷方法。 根據(jù)本發(fā)明的方法而建立的復(fù)合標(biāo)志物分布，通過(guò)與一個(gè)或者更多復(fù)合標(biāo)志物分布進(jìn)行比較， 可以用于診斷罹患疑似腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)，其中該比較可以用于預(yù)測(cè) 腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的臨床進(jìn)程。
這里使用的術(shù)語(yǔ)"預(yù)測(cè)臨床原因"意味著包含任何與狀況或者治療有關(guān)的因素的診斷和 預(yù)后，包括生存期，病程預(yù)后和治療反應(yīng)的預(yù)后。
當(dāng)用于復(fù)合標(biāo)志物分布內(nèi)容中時(shí)，這里使用的術(shù)語(yǔ)"參照"指的是一個(gè)已知與某個(gè)特定 參數(shù)相關(guān)的復(fù)合標(biāo)志物分布，該參數(shù)與來(lái)自于待測(cè)生物樣品的復(fù)合標(biāo)志物分布進(jìn)行比較。一 個(gè)參照復(fù)合標(biāo)志物分布可以代表一種特定的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)、腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的一個(gè)階段， 或者可以代表一個(gè)已知的疾病過(guò)程，例如是攻擊性還是惰性病程。例如，用于本發(fā)明的診斷 方法的參照復(fù)合標(biāo)志物可以代表疑似患病個(gè)體的特定狀態(tài)。參照復(fù)合標(biāo)志物分布可以代表腫 瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的一個(gè)特定階段，或者可以代表已知的疾病過(guò)程，例如攻擊性進(jìn)程。
在本發(fā)明診斷和預(yù)后方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，將一個(gè)個(gè)體的復(fù)合標(biāo)志物分布與一個(gè)以上 參照復(fù)合標(biāo)志物分布相比較。例如，在診斷應(yīng)用中，可以將一個(gè)個(gè)體的復(fù)合標(biāo)志物分布與代 表臨床階段圖譜的兩個(gè)或者更多參照復(fù)合標(biāo)志物分布的集合相比較，以便能夠通過(guò)比較將個(gè) 體疾病階段進(jìn)行細(xì)微分類。類似地，在預(yù)后應(yīng)用中，可以將個(gè)體的復(fù)合標(biāo)志物分布與兩個(gè)或 更多代表圖譜的參照復(fù)合標(biāo)志物分布的集合相比較，該圖譜系列從非攻擊性至攻擊性、或者 從治療應(yīng)答至不應(yīng)答。
通過(guò)將用上述方法獲得的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或者多種參照復(fù)合標(biāo)志物分布進(jìn)行比 較，根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于診斷疑似患有血癌個(gè)體的血癌，其中該對(duì)照 分布可以用于預(yù)測(cè)血癌的臨床病程，所述血癌選自由慢淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性髓性
白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)所構(gòu)成的組。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將復(fù)合分布與和一種或多種參照復(fù)合分布相比較，根據(jù)本發(fā)明 方法的復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于診斷疑似患病個(gè)體的Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血 病(CLL)，其中該比較可以預(yù)測(cè)Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床病 程(Hamblinetal.， Blood 94: 1848-1854(1999))。本發(fā)明可以提供一種用于預(yù)測(cè)個(gè)體Ig-未突變 B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床病程的方法，包括提供來(lái)源于個(gè)體的生物樣 品；使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞 群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正 常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和 腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化 細(xì)胞群；使正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與ZAP-70的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而 為來(lái)源于疑似患有B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分 布，其中該復(fù)合分布代表ZAP-70的相對(duì)量化水平；將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分 布相比較，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床 病程。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可以提供一種預(yù)測(cè)個(gè)體Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白 血病(CLL)臨床過(guò)程的方法，包括提供來(lái)源于個(gè)體的生物樣品；使生物樣品與結(jié)合分子 集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的 結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；通 過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在， 其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；使正常細(xì)胞群和腫 瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與一靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)源于疑似患有B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中該靶蛋白選自由 ZAP-70、激活誘導(dǎo)的C型凝集素(AICL)和脂蛋白脂肪酶所構(gòu)成的組，其中該復(fù)合分布代 表ZAP-70的相對(duì)量化水平；將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較 可以用于預(yù)測(cè)Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床進(jìn)程。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合分 布相比較，可以提供一種用于診斷疑似患病個(gè)體的Ig-突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)的方法，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)Ig-突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的 臨床過(guò)程。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可以提供一種預(yù)測(cè)個(gè)體Ig-突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞
性白血病(CLL)臨床過(guò)程的方法，包括提供來(lái)源于個(gè)體的生物樣品；使生物樣品與結(jié)合 分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異 性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群； 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在， 其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；使正常細(xì)胞群和腫 瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與一靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)源于疑似患有B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中該靶蛋白選自由 IM68532、 IM1286077和LCI15506所構(gòu)成的組，其中該復(fù)合分布代表耙蛋白的相對(duì)量化水平； 將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)Ig-突變B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床進(jìn)程。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合 分布相比較，可以提供一種用于診斷疑似罹患CML個(gè)體的CML的方法，其中該比較可以用 于預(yù)測(cè)CML的臨床進(jìn)程。通過(guò)將根據(jù)上述方法獲得的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù) 合分布相比較，可以提供一種用于診斷疑似罹患AML個(gè)體的AML的方法，其中該比較可以 用于預(yù)測(cè)AML的臨床進(jìn)程。在再一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)上述方法獲得的復(fù)合標(biāo)志物 分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，可以提供一種用于診斷疑似罹患ALL個(gè)體的ALL 的方法，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)ALL的臨床進(jìn)程。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，制備用于特定血癌的復(fù)合標(biāo)志物分布的方法可以延伸至 預(yù)后方法。特別是，根據(jù)上述方法獲得的復(fù)合分布可以被用于為患有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體 選擇合適的臨床處理和治療形式。
根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于從無(wú)論治療與否都永遠(yuǎn)不會(huì)發(fā)展至疾病較高 階段的個(gè)體中鑒別出預(yù)期對(duì)特定治療產(chǎn)生有效應(yīng)答的個(gè)體。因此，本發(fā)明的復(fù)合體系可以用 于預(yù)測(cè)個(gè)體的臨床進(jìn)展，盡管還是在疾病的常規(guī)階段，并且還可以幫助臨床醫(yī)生更好地評(píng)估 治療方法的選擇，而且通過(guò)較好地區(qū)分特定治療的效果，還會(huì)大大增強(qiáng)臨床研究?jī)r(jià)值。
通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，該復(fù)合標(biāo) 志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)個(gè)體的任何腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的臨床進(jìn)展，其 中該比較可以預(yù)測(cè)腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的臨床病程。通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與 一種或多種參照復(fù)合分布相比較，該復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患有血癌個(gè)體的血癌 的臨床進(jìn)展，其中該比較可以預(yù)測(cè)血癌的臨床病程，所述血癌選自由慢淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)
所構(gòu)成的組。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合分 布相比較，該復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患病個(gè)體的Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性 白血病(CLL)的臨床進(jìn)展，其中該比較可以預(yù)測(cè)Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)的臨床進(jìn)程。因此，本發(fā)明可以提供一種預(yù)測(cè)個(gè)體Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性 白血病(CLL)臨床進(jìn)程的方法，其包括提供來(lái)源于個(gè)體的生物樣品；使生物樣品與結(jié)合 分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異 性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群； 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在， 其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可辨別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；使正常細(xì)胞群和腫 瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與ZAP-70的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)源于疑似患有B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其中該復(fù)合分布代表 ZAP-70的相對(duì)量化水平；并且將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較 可以用于預(yù)測(cè)Ig-未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床進(jìn)程。
通過(guò)確定治療方案是否會(huì)帶來(lái)確實(shí)有效的作用或者是否值得冒相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)本發(fā)明 方法的復(fù)合標(biāo)志物分布可用于幫助使用者為個(gè)體選擇一個(gè)攻擊性或試驗(yàn)性治療方案。例如， 一些B-CLL病人死于治療和B-CLL的復(fù)合效應(yīng)而不單是B-CLL。通過(guò)可以鑒別已經(jīng)處于 B-CLL高級(jí)階段的B-CLL病人而不用依賴常規(guī)的Rai和Binet分級(jí)體系，根據(jù)本發(fā)明方法的 復(fù)合標(biāo)志物分布可用于幫助選擇更具攻擊性的治療方案，比如放療、化療、移植和免疫療法。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合 分布相比較，該復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患有CML個(gè)體的CML的臨床進(jìn)展，其中 該比較可以用于預(yù)測(cè)CML的臨床過(guò)程。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將根據(jù)上述方法獲得的 復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，該復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患 有AML個(gè)體的AML的臨床進(jìn)展，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)AML的臨床過(guò)程。在再一個(gè)實(shí) 施方式中，通過(guò)將根據(jù)上述方法獲得的復(fù)合標(biāo)志物分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較， 該復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于預(yù)測(cè)疑似患有CLL個(gè)體的CLL的臨床進(jìn)展，其中該比較可以預(yù) 測(cè)CLL的臨床過(guò)程。
在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以建立對(duì)監(jiān)測(cè)患有血癌個(gè)體正在進(jìn)行的治療有用 的復(fù)合分布。例如，對(duì)于CML病人，復(fù)合分布可以用于監(jiān)測(cè)病人對(duì)格列衛(wèi)(Gleevec)治療 的反應(yīng)，而對(duì)于AML病人，則用于監(jiān)測(cè)病人對(duì)抑制mTOR的雷帕霉素治療的反應(yīng)。另外，
復(fù)合分布在藥物研發(fā)和分子耙向治療中也有作用。根據(jù)本文的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，本發(fā)明的方法對(duì)于建立的復(fù)合分布會(huì)有進(jìn)一步的應(yīng)用，比如包括，用于確定單個(gè)病人在 疾病的發(fā)生和/或發(fā)展階段不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相對(duì)重要性，從而運(yùn)用于個(gè)性化治療。
另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一個(gè)試劑盒，其包含在本發(fā)明方法中有用的試劑，用于診 斷和檢測(cè)罹患腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)例如白血病的個(gè)體的疾病階段。這里指出的用于本發(fā)明方法的 材料期望適合于試劑盒制備。這樣的試劑盒可以包含攜帶工具，其劃分為可以緊密收容一種 或多種容器的限定空間，該容器著例如是藥瓶、試管和類似物，每樣容器都含有一個(gè)單獨(dú)的 用于本方法的組分。例如，容器之一可以包含有結(jié)合分子集，該結(jié)合分子集含有兩組或者更 多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，該標(biāo)志物是或者可以被適合于診斷 和預(yù)后目的的標(biāo)志物所可檢測(cè)地標(biāo)記。另外， 一個(gè)容器包含一種檢測(cè)靶蛋白的手段，它是或 者可以被適合于診斷和預(yù)后目的的標(biāo)志物所可檢測(cè)地標(biāo)記。就診斷試劑盒而言，試劑盒還可 以有含有參照樣品、比較用的參照復(fù)合標(biāo)志物分布的圖標(biāo)、緩沖液的容器和/或包含報(bào)告方法 的容器，該報(bào)告方法，例如，是結(jié)合于報(bào)告分子的生物素結(jié)合蛋白比如抗生物素蛋白或鏈霉 抗生物素蛋白，該報(bào)告分子例如是酶學(xué)或者熒光標(biāo)記。如果需要，試劑盒還可以包括珠子， 其提供了用于證實(shí)系統(tǒng)組分完整性目的的外部對(duì)照。
除了化學(xué)原料，當(dāng)然使用該試劑盒的說(shuō)明書也包括在內(nèi)，優(yōu)選用于預(yù)后和診斷應(yīng)用。說(shuō) 明書可以寫在瓶子、試管和類似物上，或者寫在一張單獨(dú)的紙上，或者在容器的外部或內(nèi)部。 說(shuō)明書也可以是多媒體的形式，比如CD、電腦光盤、錄像等，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的 結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群與腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。如果需要的話，該試劑盒可以包 括輔助性試劑，如酶抑制劑和/或信號(hào)發(fā)生試劑或系統(tǒng)。此外，其他的輔助試劑也可以包含在 該試劑盒內(nèi)，比如，緩沖液、穩(wěn)定劑以及類似物。
因此本發(fā)明提供了一種用于為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分 布的試劑盒，該試劑盒包括有結(jié)合分子集，該結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞 群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，該標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的 正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，并且結(jié)合分子對(duì)靶蛋白具有特異性，從而為來(lái)自疑有腫瘤 性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)可以進(jìn)一步是血癌如白血病， 比如急性骨髓性白血病或急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓細(xì)胞白 血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞白血 病(HCL)、骨髓增生異常綜合征(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)。
更具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用于為來(lái)自疑有B-CLL狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志
物分布的試劑盒，該試劑盒包括有結(jié)合分子集，該結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的 細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，該標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi) 部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，并且結(jié)合分子對(duì)ZAP-70或者其他靶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(包 括但不限制于本文公開的靶蛋白)具有特異性，從而為從疑有B-CLL的個(gè)體所獲得的樣品建 立復(fù)合標(biāo)志物分布。
通過(guò)使用該試劑盒，可以為多種類型臨床樣品建立復(fù)合分布，該樣品可以包括全血(用 任一可用試劑或試劑盒處理，以固定和透化白細(xì)胞并溶解紅細(xì)胞)、骨髓、外周血單核細(xì)胞 (PBMC's)、腹水等。那些含有顯著水平紅細(xì)胞的生物樣品應(yīng)該接受處理以移除紅細(xì)胞(低 滲溶解、清潔劑處理、密度梯度離心，等)，然后與細(xì)胞群標(biāo)志物反應(yīng)，接著用適當(dāng)?shù)脑噭?試 劑盒中提供)固定和透化白細(xì)胞。接著細(xì)胞群與表征(細(xì)胞內(nèi))信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等的 標(biāo)志物反應(yīng)，并通過(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)(如流式細(xì)胞術(shù)、影像分析、手工顯微鏡檢等)進(jìn)行分析。
可以理解，那些不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響本發(fā)明的各種具體實(shí)施方式
的活性的修飾也包括在本發(fā) 明限定的范圍內(nèi)。因此，以下實(shí)施例是為了說(shuō)明但不是為了限制本發(fā)明。
實(shí)施例l 制備用于建立復(fù)合分布的樣品
本實(shí)施例顯示了用于為疑有B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體建立復(fù)合分 布的樣品的制備過(guò)程。
概括地說(shuō)，將混和有細(xì)胞表面標(biāo)志物CD5-FITC、 +CD3-ECD、 +CD56-PC5、 +CD19-PC7 的l(Hd試劑加入小管，并加入100nl全血。室溫孵育20min，加入64pl固定液(10%甲醛) 后室溫孵育10min。接著，加入lmL裂解/透化試劑(0.1% Triton X-IOO)，室溫孵育30min 后離心。用緩沖液(含有2%BSA的PBS)洗滌細(xì)胞兩次，用lOpl抗-ZAP-70-PE和90pl的 緩沖液重懸，室溫孵育30min，然后用緩沖液洗滌一次，用含有0.1%多聚甲醛的緩沖液重懸。 然后將樣品用流式細(xì)胞儀分析。圖1顯示了用于建立復(fù)合標(biāo)志物分布方法的樣品制備的示例 性模式圖。
實(shí)施例2 用于建立復(fù)合分布的樣品的分析
本實(shí)施例顯示了用流式細(xì)胞儀分析樣品以建立復(fù)合分布。
如圖2所示，采用ZAP-70門控/分析算法按如下方法建立復(fù)合分布第一閘門正常全血 樣品用于通過(guò)光散射鑒別淋巴細(xì)胞(藍(lán)色加綠色)，如左上方直方圖所示。如果需要的話，
CD45側(cè)向散射(線性刻度)可以用來(lái)為外周血中CD45-亮型淋巴細(xì)胞設(shè)門以進(jìn)行CD4計(jì)數(shù)， 同時(shí)CD45側(cè)向散射(對(duì)數(shù)刻度)可以用來(lái)鑒定骨髓中胚細(xì)胞群以進(jìn)行顯型。圖2中，CD19 相對(duì)CD5的直方圖鑒別了正常B細(xì)胞(紫色，左上象限)、正常T細(xì)胞(藍(lán)色，右下象限) 和正常外周血中的"前"B細(xì)胞(CD19+5+，右上象限)。B-CLL腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞也落入右上 象限，但是與它們的正常細(xì)胞相比，B-CLL腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞不表達(dá)ZAP-70。圖2的底部展示 了疊加的散點(diǎn)圖，綜合了復(fù)合分布并且展示了B-CLL細(xì)胞落入該直方圖(ZAP-70表達(dá))，與 內(nèi)源性正常B細(xì)胞(CD19+)、正常T細(xì)胞(CD5+3+)和NK細(xì)胞(CD56+)相關(guān)。圖3顯 示了用流式細(xì)胞儀由用于CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略而得到的面板。圖4展示的圖 描述了一例CLL樣品中存在的細(xì)胞空間中ZAP-70的表達(dá)情況。(紅色B細(xì)胞；綠色正常
T細(xì)胞；紫色NK細(xì)胞)。
圖5展示了描述一例AML樣品中mTOR激活S6的流式細(xì)胞儀面板。 圖6為外周血中動(dòng)員干細(xì)胞(CD34+)的復(fù)合分布。直方圖提供了與未處理樣品(紅) 相比，在用PMA (藍(lán))、干細(xì)胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)激活后每個(gè)動(dòng)員干細(xì)胞、正常粒 細(xì)胞、正常單核細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞中三種不同的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT 的反應(yīng)情況比較。圖中顯示了體內(nèi)首次處理以動(dòng)員干細(xì)胞(CD34+)的(人)全血樣品。左 邊的兩幅直方圖展示了 CD34+干細(xì)胞(底部)和正常粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(頂部) 如何被鑒別。在這些實(shí)驗(yàn)中，單個(gè)供體的多份樣品用能刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下述因子進(jìn)行了 處理(體外)PMA (藍(lán))、干細(xì)胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)，并與未處理樣品(紅)相對(duì) 比。右邊的組圖展示了三種不同的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT的反應(yīng)(或缺 失)情況。這些結(jié)果將CD34+干細(xì)胞的反應(yīng)與內(nèi)部參照細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞) 群相比較，并證實(shí)了 CD34+細(xì)胞對(duì)這三種刺激產(chǎn)生了反應(yīng)。
圖7顯示了單個(gè)AML患者的復(fù)合分布。等分血樣用PMA刺激，用或者不用特異性信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑(圖例見(jiàn)右下角)刺激，或用干細(xì)胞因子刺激。反應(yīng)結(jié)果用P-ERK對(duì)P-S6 的雙邊量散點(diǎn)圖檢測(cè)(右側(cè)面板)，紅色群表示AML胚細(xì)胞，藍(lán)色表示內(nèi)在淋巴細(xì)胞，綠色 表示內(nèi)在粒細(xì)胞。AML胚細(xì)胞(紅)、淋巴細(xì)胞(藍(lán))和粒細(xì)胞(綠)通過(guò)使用左邊兩個(gè)框 中描述的CD34側(cè)向散射來(lái)鑒定。P-ERK和P-S6在未處理(從頂部向下排列)、PMA處理、 PMA+U0126 (P-ERK抑制劑)、PMA+Rapamysin (mT0R〉S6抑制劑)、PMA+Ly294002 (PKB/AKT抑制劑)和干細(xì)胞因子處理(底部)的全血樣品中的表達(dá)水平如圖所示。在所有 的P-表位直方圖中，長(zhǎng)柱揭示了P-ERK和P-S6在未刺激樣品中的水平，即為"基礎(chǔ)"表達(dá)。 直方圖展示了不同的處理方式對(duì)AM1胚細(xì)胞(紅)相比淋巴細(xì)胞(藍(lán))和粒細(xì)胞(綠)的效
果比較。
圖8顯示了CLL復(fù)合分布。樣品中的B細(xì)胞陰性峰和陽(yáng)性峰表現(xiàn)一致，NK細(xì)胞陽(yáng)性峰 的表達(dá)比ZAP70強(qiáng)陽(yáng)性的樣品更高，與樣品的一致性較低。ZAP70+CLL具有0.2。/。"正常B 細(xì)胞"，但該罕見(jiàn)的結(jié)果與其余樣品中陰性峰的現(xiàn)象相當(dāng)。中度表達(dá)ZAP70的CLL和正常 的B細(xì)胞-S/N2.15之間存在明顯的位移。
在該申請(qǐng)的全文中，如括號(hào)內(nèi)所示，引用了不同的著作。本申請(qǐng)中將所有這些出版物的
公開合并為參考，以便對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)作出更全面的描述。
雖然本發(fā)明已經(jīng)用公開的具體實(shí)施方式
作出了描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易領(lǐng)悟這些
具體的實(shí)施例和以上的研究細(xì)節(jié)只是用于說(shuō)明本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的宗旨的情況下，可
以對(duì)本發(fā)明作出各種的修飾。因此，本發(fā)明要求附后的權(quán)利。
權(quán)利要求
1. 一種為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法，該方法包括以下步驟(a)使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(b)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的存在，所述標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；以及(c)將每個(gè)正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與一靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白為活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括確定靶蛋白修飾方式。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、 急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL) 所構(gòu)成的組。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物包括選自下組的細(xì)胞 表面標(biāo)志物CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD23、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓過(guò)氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b禾卩CD117 (c-kit受體)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)志物進(jìn)一步包括K-和X-免疫球蛋白輕 鏈以用于檢測(cè)克隆性。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌為B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (B-CUJ 。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白選自由ZAP-70、激活誘導(dǎo)的C-型凝集素(AICL)、脂蛋白脂肪酶以及IM68532所構(gòu)成的組。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL) 是Ig-突變的B-CLL。
10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物選自由CD3、 CD5、 CD19、 CD23、 CD38、 CD56、 CD79b和ftnc7所構(gòu)成的組。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物可以鑒定包括白血 病B細(xì)胞的細(xì)胞群。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述白血病B細(xì)胞呈ZAP-70陽(yáng)性。
13. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的一種或多種細(xì)胞群包括ZAP-70陰 性細(xì)胞群。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的一種或多種細(xì)胞群包括正常B細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述ZAP-70陰性細(xì)胞群包括粒細(xì)胞。
16. —種用于預(yù)測(cè)個(gè)體Ig未突變B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)臨床進(jìn)程的方法， 該方法包括以下步驟(a) 提供來(lái)自于該個(gè)體的生物樣品；(b) 使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì) 胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi) 部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(c) 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn) 化細(xì)胞群的存在，所述標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(d) 將每個(gè)正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與至少一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的存 在關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑有B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的個(gè)體的樣品建立復(fù) 合標(biāo)志物分布，其中該復(fù)合分布代表了所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白水平的相對(duì)量化；以及(e) 將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)Ig未 突變的B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的臨床進(jìn)程。
17. —種為從疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個(gè)體所獲得的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布 的方法，該方法包括以下步驟(a) 使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì) 胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi) 部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(b) 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn) 化細(xì)胞群的存在，其中標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群； 以及(c) 將每個(gè)正常細(xì)胞群的和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與至少一種靶蛋白的存在關(guān) 聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個(gè)體的樣本建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其 中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物、分化標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物所構(gòu) 成的組。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物選自由CD45、CD34、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD33、 CD79a、 CD79b、 CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl禾口 TdT所構(gòu)成的組。
19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白選自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所構(gòu)成的組。
21. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是增殖標(biāo)志物或凋亡標(biāo)志物。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是選自由細(xì)胞周期蛋白D1和 細(xì)胞周期蛋白A2所構(gòu)成的組的增殖標(biāo)志物。
23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是選自由胱天蛋白酶-3和Bcl-Xl 所構(gòu)成的組的凋亡標(biāo)志物。
24. —種為個(gè)體預(yù)測(cè)慢性骨髓性白血病(CML)的臨床進(jìn)程的方法，該方法包括以下步驟(a) 提供來(lái)自于該個(gè)體的生物樣品；(b) 使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì) 胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi) 部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(C)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn) 化細(xì)胞群的存在，其中所述標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 群；(d) 將每個(gè)正常細(xì)胞群的和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與至少一種靶蛋白的存在關(guān) 聯(lián)起來(lái)，從而為從疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個(gè)體所獲得的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布， 其中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物所構(gòu)成的組；以 及(e) 將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)慢性骨 髓性白血病(CML)的臨床進(jìn)程。
25. —種為從疑有急性骨髓性白血病(AML)的個(gè)體所獲得的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布 的方法，該方法包括以下步驟(a) 使生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì) 胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi) 部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(b) 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn) 化細(xì)胞群的存在，其中所述標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 群；以及(c) 將每個(gè)正常細(xì)胞群的和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與至少一種靶蛋白的存在關(guān) 聯(lián)起來(lái)，從而為來(lái)自疑有急性骨髓性白血病(AML)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布，其 中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物所構(gòu)成的組。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物選自由CD45、CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓過(guò)氧化物酶)、CD64和CD117 (c-kit受體)所構(gòu)成的組。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物可以鑒別包含白血 病粒細(xì)胞或白血病單核細(xì)胞的細(xì)胞群。
28. 如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
29. 如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白選自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所構(gòu)成的組。
30. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是增殖標(biāo)志物或凋亡標(biāo)志物。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是選自由細(xì)胞周期蛋白D1和 細(xì)胞周期蛋白A2所構(gòu)成的組的增殖標(biāo)志物。
32. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述的該靶蛋白是選自由胱天蛋白酶-3和 Bcl-Xl所構(gòu)成的組的凋亡標(biāo)志物。
33. —種為個(gè)體預(yù)測(cè)急性骨髓性白血病(AML)的臨床進(jìn)程的方法，該方法包括以下步驟(b) 使從該個(gè)體獲得的生物樣品與結(jié)合分子集反應(yīng)，其中所述結(jié)合分子集含有兩組或更 多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物具有特異性的結(jié)合分子，其中標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合 可以鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群；(c) 通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物水平和標(biāo)志物結(jié)合情況，來(lái)鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn) 化細(xì)胞群的存在，其中所述標(biāo)志物水平和結(jié)合情況可鑒別樣品內(nèi)部的正常和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 群；(d) 將每個(gè)正常細(xì)胞群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的標(biāo)志物水平與至少一種靶蛋白的存在關(guān)聯(lián) 起來(lái)，從而為從疑有急性骨髓性白血病(AML)的個(gè)體所獲得的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布， 其中所述耙蛋白選自由活化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、增殖標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物所構(gòu)成的組；以 及(e) 將該復(fù)合分布與一種或多種參照復(fù)合分布相比較，其中該比較可以用于預(yù)測(cè)急性骨 髓性白血病(AML)的臨床過(guò)程。
34. —種試劑盒，用于建立如權(quán)利要求l所述的復(fù)合標(biāo)志物分布，該試劑盒包括(a) 結(jié)合分子集合，其中該結(jié)合分子集含有兩組或者更多組對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物 具有特異性的結(jié)合分子，其中該標(biāo)志物的水平和標(biāo)志物的結(jié)合可以鑒別樣品內(nèi)部的正常細(xì)胞 群和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，以及(b) 至少一種對(duì)靶蛋白具有特異性的結(jié)合分子，用于為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體 的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布。
35. 如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，所述腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)選自由白血病、淋 巴瘤和多種骨髓瘤所構(gòu)成的組。
36. 如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其特征在于，所述白血病選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血 病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞性白 血病(ALL)所構(gòu)成的組。
37. 如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞群相關(guān)標(biāo)志物包括細(xì)胞表面標(biāo) 志物。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞表面標(biāo)志物選自由CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓過(guò)氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b和CDU7 (c-kit受體)所構(gòu)成的組。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種為來(lái)自疑有腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體的樣品建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法。本發(fā)明的復(fù)合標(biāo)志物分布可以用于鑒別個(gè)體的腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)相關(guān)亞群的預(yù)后和治療、以及預(yù)測(cè)個(gè)體的疾病進(jìn)程。本發(fā)明的方法為罹患腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的個(gè)體提供用于選擇治療方式的工具，包括確定危險(xiǎn)人群的方法、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、預(yù)測(cè)發(fā)生繼發(fā)性并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加的方法、為個(gè)體選擇治療方案的方法、確定對(duì)個(gè)體治療效果的方法、確定個(gè)體的預(yù)后的方法。特別地，本發(fā)明的方法公開了一種建立復(fù)合標(biāo)志物分布的方法，其可用作預(yù)后指示來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體腫瘤性轉(zhuǎn)化狀態(tài)的進(jìn)程是攻擊性還是惰性，從而幫助臨床工作者處理病人和評(píng)估將要使用的治療形式。在特別公開的實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的在于建立用于白血病的復(fù)合標(biāo)志物分布，該白血病選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(ALL)所構(gòu)成的組。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101389959SQ200680040388
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者戴維·赫德利, 文森特·T·尚奇, 斯坦利·沙克尼, 查爾斯·古爾斯比, 詹姆斯·雅克伯格 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司;西北大學(xué);健康網(wǎng)絡(luò)大學(xué);西儲(chǔ)大學(xué);阿勒格尼辛格研究所