專利名稱：Sars病毒s蛋白與n蛋白的融合蛋白及其制備、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是將化學(xué)合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段與N蛋白的基因片段連接，利用基因工程技術(shù)，制備SARS病毒S蛋白與N蛋白的融合蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白和N蛋白片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的S基因序列和N基因序列，利用基因工程技術(shù)表達兩者的融合蛋白，表達的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嚴重急性呼吸綜合癥，也稱SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)，是一種烈性病毒性傳染病。2003年11月16日，在我國廣州出現(xiàn)了第一例SARS病人，此后幾個月內(nèi)波及世界30多個國家，8000多人感染，死亡800多人。據(jù)WHO(WorldHealth Organization)統(tǒng)計SARS的死亡率可高達15％左右，感染該疾病的老年人死亡率可達40％至50％。人在感染SARS病毒后，有10至14天的潛伏期，發(fā)病時出現(xiàn)高熱、咳嗽、全身不適及頭痛、腹瀉，發(fā)病后的一周內(nèi)重癥者可發(fā)生呼吸窘迫綜合癥，以至喪失呼吸功能。
SARS病毒是一種新型的冠狀病毒，由于這種病毒以前未曾感染過人類，所以人群對該病毒普遍易感，SARS病毒是一種單股正鏈RNA病毒，目前對其全基因序列已經(jīng)測定，Genebank內(nèi)已公布了10個左右的全長病毒基因序列，為利用基因工程技術(shù)研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。
SARS病毒用Vero-E6可以體外培養(yǎng)，所以利用培養(yǎng)的SARS病毒建立了檢測SARS病毒抗體的免疫熒光方法和酶聯(lián)免疫檢測法，但是用培養(yǎng)的SARS病毒作抗原檢測抗體，難以大量生產(chǎn)，亦會產(chǎn)生假陽性，研制特異的基因重組抗原是建立SARS病毒特異抗體檢測試劑的發(fā)展方向。預(yù)防SARS感染的最理想途徑是注射疫苗，但目前沒有預(yù)防SARS的疫苗，國內(nèi)外均在積極開展疫苗的研制，尤其對滅活疫苗的研究進展較快，基因工程疫苗是最終的發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容
SARS感染人體后會刺激機體產(chǎn)生多種抗體，但有時血清內(nèi)只有針對部分SARS病毒蛋白的抗體，可能與各種抗體產(chǎn)生的時間或與機體的免疫狀態(tài)有關(guān)，所以在檢測血清內(nèi)的SARS病毒抗體時要用多種抗原，以提高抗體檢出率。
SARS病毒最外層的S蛋白，是介導(dǎo)病毒和宿主細胞結(jié)合的主要蛋白，封閉該蛋白的結(jié)合位點可阻止病毒感染細胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首選蛋白。SARS病毒的N蛋白具有較高的保守性，在各株SARS病毒之間變異很小，所以是用作抗原研制SARS病毒抗體檢測試劑的理想蛋白。通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，我們篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，將兩個基因片段串聯(lián)，利用基因工程技術(shù)表達S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，表達的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測等。
本發(fā)明是將化學(xué)合成的SARS病毒S蛋白和N蛋白的基因片段連接，利用基因工程技術(shù)，制備SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的融合蛋白。通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162個氨基酸至第460個氨基酸，共299個氨基酸，和含強抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1個氨基酸至258氨基酸。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，將兩個基因片段串聯(lián)，利用基因工程技術(shù)表達S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，兩蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，在N蛋白片段的第一個氨基酸蛋氨酸后插入一個甘氨酸，融合蛋白全長560個氨基酸。表達的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測，及用于免疫制備抗SARS病毒單抗和多抗等。
SARS病毒S蛋白與N蛋白的融合蛋白及其制備、應(yīng)用是采取以下步驟實施的1.SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)S蛋白的N端第162個氨基酸至第460個氨基酸含有較強的抗原決定簇，N蛋白的N端第1個氨基酸至第258個氨基酸含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，分別化學(xué)合成包含上述抗原決定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位點(下畫線部分)及8個保護堿基(GCGAGTCACC)，并在起始密碼子ATG之后插入了一個密碼子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及3個保護堿基(GCG)。在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GT)，在3’端增加了終止密碼子(TAA)和EcoRI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(AC)。使合成的兩個基因片段易于串聯(lián)克隆至質(zhì)粒pET28a(+)內(nèi)的NcoI和EcoRI酶切位點內(nèi)。
篩選的SARS病毒N蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第1個aa-第258個aa)Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe GlyGly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg ProLys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala LeuThr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile AsnThr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg ValArg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr LeuGly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr GlyAla Asn Lys Glu Gly Ile Val TrpVal Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn ProAsn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys GlyPhe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser ArgSer Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro AlaArg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg LeuAsn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr ValThr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys篩選的SARS病毒S蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第162個aa-第460個aa)Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Glv TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn TyrAsn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化學(xué)合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796 bp)GCG AGT CAC CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCC CCGCAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAATGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTGGTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGGCGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGCTAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTACTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGAAGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGGCAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AACATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCGCTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGGAAA TTC TCC TGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCTGCT AGA CAG ATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACAAGG CCA AAC TGT CAC TAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA GGG ATC CGC G
化學(xué)合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916 bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表達SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pET28a(+)(美國Novagen公司產(chǎn)品)，用Nco I和EcoR I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。用Nco I和BamH I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamH I和EcoR I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分別電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
取等摩爾濃度的上述三種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段經(jīng)BamH I酶連接后，插入到載體pET28a(+)內(nèi)的Nco I和EcoR I位點之間，表達一個SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的融合蛋白。
3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃過夜。次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和個對照菌(質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化菌)，分別提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)組成引物對，PCR擴增連接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段，含串聯(lián)兩個基因片段的陽性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴增出長約1701bp的串聯(lián)基因片段。將含有串聯(lián)基因的質(zhì)粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質(zhì)粒含有連接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段，序列完全正確ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACA TTTGGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGGCCA AAA CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCTCTC ACT CAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTT CCA ATCAAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGA AGA GCT ACC CGA CGAGTT CGT GGT GGT GAC GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCC AGA TGG TAC TTC TAT TACCTA GGA ACT GGC CCA GAA GCT TCA CTT CCC TAC GGC GCT AAC AAA GAA GGC ATC GTATGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC TTG AAT ACA CCC AAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AATCCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAAGGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGC GGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCACGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AAT TCA ACT CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCTGCT CGA ATG GCT AGC GGA GGT GGT GAA ACT GCC CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGATTG AAC CAG CTT GAG AGC AAA GTT TCT GGT AAA GGC CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACTGTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAGGGA TCCGAA TAC ATC TCT GACGCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTCGTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GACGTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCGCTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACCTTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAGAAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATTTAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AACATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTCTAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TACAAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTACGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCTACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTCGAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全長560個氨基酸，在其N端為N蛋白片段，長259個氨基酸，C端為S蛋白片段，長299個氨基酸，兩者之間由氨酸和絲氨酸兩個氨基酸連接，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala ArgPro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr AlaLeu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro IleAsn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg ArgVal Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr TyrLeu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile ValTrp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg AsnPro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro LysGly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser SerArg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser ProAla Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp ArgLeu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln ThrVal Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser AspAla Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu PheVal Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile AspVal Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu ProLeu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala GlnAsp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr ThrPhe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser GlnAsn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly IleTyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro AsnIle Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser ValTyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu TyrAsn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu AsnAsp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp ValArg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr SerThr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro PheGlu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定將含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，接種至含3ml LB培養(yǎng)基(含卡那毒素60μg/ml)的試管內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為60kD的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶。
5.表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的純化1)表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白工程菌的超聲裂解將誘導(dǎo)表達融合蛋白的工程菌離心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌體重懸于原培養(yǎng)液l/10體積的細菌裂解液(20mmol/L PB pH7.4、10mmol/L EDTA、1mmol/LDTT、5％甘油)內(nèi)，冰浴超聲破菌，離心收集上清。
2)表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的硫酸胺分級沉淀精確量出上清體積，向上清內(nèi)加入適量飽和硫酸胺溶液，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為30％，置冰浴內(nèi)過夜。離心收集上清，加入適量固體硫酸胺粉末，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為50％，置冰浴內(nèi)過夜。次日離心收集沉淀。用l00ml平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)懸浮沉淀，裝入透析袋內(nèi)，對500ml平衡液透析過夜，換液1次。離心收集上清，直接上S-Sepearse FF陽離子柱純化純化3)S-Sepearse FF陽離子柱純化用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)沖洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然后將上步透析好的上清直接上柱，上樣流速1.5ml/min。上樣結(jié)束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含50、100、200、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12％SDS-PAGE電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。100mmol/L NaCl洗脫蛋白峰即為SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。
6.純化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原檢測SARS病毒抗體將復(fù)性的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用50mmol/L的碳酸鹽(pH9.6)倍比稀釋后包被酶聯(lián)板，間接酶聯(lián)免疫法檢測已知的抗SARS病毒陽性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白能與抗SARS病毒陽性血清反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白有較好抗原性和特異性。
7.用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用撲獲法或夾心法檢測抗SARS病毒IgM或IgG抗體。SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋用作抗原，用金標(biāo)法檢測抗SARS病毒抗體。
8.將表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用于疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗SARS病毒單抗和多抗等。
9.將SARS病毒S蛋白基因片段與N基因片段連接，以融合蛋白的形式進行表達、制備。
10.通過基因重組技術(shù)，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉(zhuǎn)基因動植物進行重組表達、制備SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。英文縮寫說明SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)嚴重急性呼吸綜合癥；EDTA四甲基乙二胺；IPTG異丙基硫代半乳糖苷；DTT二硫蘇糖醇；SDS十二烷基磺酸納；PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳；SKL肌苷酸納；PB磷酸鹽緩沖液；DNA脫氧核糖核酸；RNA核糖核酸；kD千道爾頓；Triton曲拉通。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點我們表達的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，有較多優(yōu)點1.現(xiàn)在應(yīng)用的SARS病毒抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生產(chǎn)較危險、成本高、與其它冠狀病毒有交叉反應(yīng)等缺點。表達的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白用作抗原可克服上述缺點。
2.表達的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白以可溶性形式存在，易于純化，且不需要復(fù)性處理。
3.將SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段融合表達，比分別使用兩個單獨的蛋白片段更方便、經(jīng)濟。用這兩個蛋白作抗原檢測抗SARS病毒抗體時，不再需要分別制備這兩種蛋白，也不需要調(diào)整兩個抗原的使用比例，因此應(yīng)用方便且成本較低。用捕獲法或夾心法檢測抗SARS病毒抗體時，只需酶標(biāo)記這一種融合蛋白，不再需要分別標(biāo)記兩個蛋白。
4.目前沒有SARS病毒疫苗。滅活疫苗的研究取得了較大進展，但是生產(chǎn)成本高、危險大。SARS病毒最外層的S蛋白，是介導(dǎo)病毒和宿主細胞結(jié)合的主要蛋白，封閉該蛋白的結(jié)合位點可阻止病毒感染細胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首選蛋白。N蛋白可刺激機體產(chǎn)生較強的細胞免疫。我們利用基因工程技術(shù)表達制備SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；蚬こ桃呙缇哂邪踩⒊杀镜偷膬?yōu)點。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明圖1是分子生物學(xué)軟件對SARS病毒N蛋白的抗原表位進行分析結(jié)果。結(jié)果顯示，在SARS病毒的N蛋白N端從第1個氨基酸到第258個氨基酸，含有強的親水性抗原表位，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
圖2是分子生物學(xué)軟件對SARS病毒S蛋白的抗原表位進行分析結(jié)果。結(jié)果顯示，在SARS病毒的S蛋白N端從第162個氨基酸到第460個氨基酸，含有強的親水性抗原表位，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
圖3是表達SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖4是用1.2％的Agarose凝膠檢測8個轉(zhuǎn)化子的PCR擴增產(chǎn)物。M低分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa，DL2000)；2、3、4、5、6第2、3、4、5、6號5個轉(zhuǎn)化子擴增出1701bp的目的基因片段，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置，1、7、8、第1、7、8號3個轉(zhuǎn)化子未擴增出1701bp的目的基因片段。
圖5是表達SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌的SDS-PAGE分析結(jié)果。M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia)；2、4、5、6、第2、4、5、6號4個重組子均表達相對分子量約為60000的目的融合蛋白，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。1、3、7、8、第1、3、7、8號4個轉(zhuǎn)化子未表達目的蛋白。
圖6是表達SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白純化前后的SDS-PAGE分析結(jié)果。M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia)；1對照菌BL21(DE3)；2表達SARS病毒的N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白的工程菌；3S-Sepharose FF陽離子柱純化后的的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。
具體實施例方式
本發(fā)明實施方式的詳細說明SARS病毒的S蛋白和N蛋白抗原表位的分析、基因合成及表達通過計算機分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1個氨基酸至258氨基酸，和含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162個氨基酸至第460個氨基酸，共299個氨基酸。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列，利用基因工程技術(shù)將兩個基因片段串聯(lián)，克隆至質(zhì)粒pET28a(+)內(nèi)的NcoI/EcoRI位點，表達S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選獲得了高效表達SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌，表達的SARS病毒的融合蛋白約占菌體蛋白總量的30％左右。
材料與方法1.菌種與質(zhì)粒宿主菌BL21(DE3)及表達載體pET28a(+)為美國Novagen公司產(chǎn)品。
2.分子生物學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶NcoI、BamHI、EcoRI、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。質(zhì)粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。DTT及IPTG為TaKaRa公司產(chǎn)品。其它試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。
3.基因片段的合成由大連TaKaRa公司幫助合成。
4.基因克隆方法DNA的酶切、連接、電泳；質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常規(guī)方法進行。其它試劑盒按說明書進行操作。
5.DNA序列分析用TaKaRa公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動測序儀測序。
結(jié)果1.SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列(GeneBank，接通號AY278488)，發(fā)現(xiàn)N蛋白的N端第1個氨基酸至第258個氨基酸含有較強的抗原決定簇(圖1)，S蛋白的N端第162個氨基酸至第460個氨基酸含有較強的抗原決定簇(圖2)。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，分別化學(xué)合成包含上述抗原決定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位點(下畫線部分)及8個保護堿基(GCGAGTCACC)，并在起始密碼子ATG之后插入了一個密碼子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及3個保護堿基(GCG)。在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GT)，在3’端增加了終止密碼子(TAA)和EcoRI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(AC)。使合成的兩個基因片段易于串聯(lián)克隆至質(zhì)粒pET28a(+)內(nèi)的NcoI和EcoRI酶切位點內(nèi)。
篩選的SARS病毒N蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第1個aa-第258個aa)Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe GlyGly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg ProLys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala LeuThr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile AsnThr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg ValArg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr LeuGly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile Val TrpVal Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn ProAsn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys GlyPhe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser ArgSer Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro AlaArg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg LeuAsn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr ValThr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys篩選的SARS病毒S蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第162個aa-第460個aa)Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化學(xué)合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796 bp)GCG AGT CAC CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCC CCGCAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAATGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTGGTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGGCGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGCTAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTACTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGAAGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGGCAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AACATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCGCTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGGAAA TTC TCC TGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCTGCT AGA CAG ATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACAAGG CCA AAC TGT CAC TAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA GGG ATC CGC G
化學(xué)合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表達SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pET28a(+)(美國Novagen公司產(chǎn)品)，用Nco I和EcoR I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。用Nco I和BamH I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamH I和EcoR I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分別電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
取等摩爾濃度的上述三種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段經(jīng)BamH I酶連接后，插入到載體pET28a(+)內(nèi)的Nco I和EcoR I位點之間，表達一個SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的融合蛋白。構(gòu)建流程見圖3。
3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含卡那霉素(60μg/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)過夜。次日隨機挑選8個轉(zhuǎn)化子菌落(分別標(biāo)記為1-8號)，分別接種到含4ml液體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素60μg/ml)的試管內(nèi)，置37℃振蕩培養(yǎng)6h，取菌液1ml，離心收菌。分別用50μl去離子水懸浮菌體，沸水煮5min，離心(4℃，12000rpm)5min，取上清(內(nèi)有質(zhì)粒)1μl用作PCR模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)組成引物對，PCR擴增連接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段，含串聯(lián)兩個基因片段的陽性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴增出長約1701bp的串聯(lián)基因片段。PCR反應(yīng)濃度為質(zhì)粒模板1μl、上下游引物各1μl、10x Buffer 5.0μl、2.5 mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去離子水37.5μl，總體積50μl。擴增條件為94℃30秒、60℃30秒、72℃60秒，30個循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。取PCR擴增產(chǎn)物5μl，用1.2％的Agarose凝膠檢測，結(jié)果，8個轉(zhuǎn)化子中，第2、3、4、5、6號5個轉(zhuǎn)化子擴增出1701bp的目的基因片段(見圖4)，而第1、7、8號3個轉(zhuǎn)化子沒有擴增出該基因片段。初步證實，有5個轉(zhuǎn)化子含有SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段的串聯(lián)基因。
提取5號重組子的質(zhì)粒，測定質(zhì)粒內(nèi)的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段的串聯(lián)基因序列，DNA序列分析證實，重組質(zhì)粒含有串聯(lián)的SARS病毒S蛋白基因片段和N蛋白基因片段，序列完全正確ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CA ACG TAG TGC CCC CCG CAT TAC ATTTGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAA TGG GGC AAGGCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTG GTT CAC AGCTCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGG CGT TCC AATCAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGC TAC CCG ACGAGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTA CTT CTA TTACCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGA AGG CAT CGTATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGG CAC CCG CAATCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC AAAAGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCG CTC CTC ATCACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGG AAA TTC TCCTGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCT GCT AGA CAGATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA A CAA CAA GGC CAA ACTGTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAGGGA TCCGAA TAC ATC TCT GACGCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTCGTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GACGTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCGCTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACCTTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAGAAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATTTAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AACATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTCTAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TACAAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTACGT GAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCTACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTCGAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全長560個氨基酸，在其N端為N蛋白片段，長259個氨基酸，C端為S蛋白片段，長299個氨基酸，兩者之間由氨酸和絲氨酸兩個氨基酸連接，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala ArgPro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr AlaLeu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro IleAsn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg ArgVal Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr TyrLeu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile ValTrp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg AsnPro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro LysGly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser SerArg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser ProAla Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp ArgLeu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln ThrVal Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser AspAla Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu PheVal Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile AspVal Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu ProLeu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala GlnAsp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr ThrPhe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser GlnAsn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly IleTyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro AsnIle Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser ValTyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu TyrAsn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu AsnAsp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp ValArg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr SerThr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro PheGlu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定將上述8個轉(zhuǎn)化子接種至含3ml LB培養(yǎng)基(含卡那毒素60μg/ml)的試管內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，第2、4、5、6號4個轉(zhuǎn)化子表達相對分子量約為60kD的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而第1、3、7、8號4個轉(zhuǎn)化子無此蛋白帶(圖5)。
表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的純化根據(jù)表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當(dāng)?shù)募兓椒ā＝?jīng)計算機分析，表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的等電點pH9.7，因此我們決定在pH為7.4的磷酸鹽緩沖液內(nèi)，用S-SepharoseFF陽離子純化。具體步驟如下
材料和方法1.主要試劑S-SepharoseFF陽離子凝膠為Pharmacia公司產(chǎn)品，IPTG、DTT為TaTaRa公司產(chǎn)品。其它試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。
2.表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白工程菌的誘導(dǎo)表達及超聲裂解從接種有5號工程菌的LB平板上，用牙簽挑單菌落，接種到含200ml LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，加卡那霉素至終濃度60μg/ml，置37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日，將菌液接種到4個分別含200ml LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，每瓶接種菌液50ml，置37℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)1小時，然后加IPTG至終濃度0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達4小時。
將誘導(dǎo)表達融合蛋白的1000ml工程菌離心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌體重懸于l00ml的細菌裂解液(20mmol/L PB pH7.4、10mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5％甘油)內(nèi)，冰浴超聲破菌10min，離心(12000rpm、30min、4℃)收集上清。
3.表達SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的硫酸胺分級沉淀精確量出上清體積，向上清內(nèi)加入適量飽和硫酸胺溶液，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為30％，置冰浴內(nèi)過夜。次日離心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，加入適量固體硫酸胺粉末，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為50％，置冰浴內(nèi)過夜。次日離心(12000rpm、20min、4℃)收集沉淀。用100ml平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)懸浮沉淀，裝入透析袋內(nèi)，對500ml平衡液透析過夜，換液1次。離心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，直接上S-Sepearse FF陽離子柱純化純化4.S-Sepearse FF陽離子柱純化用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)沖洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然后將上步透析好的上清直接上柱，上樣流速1.5ml/min。上樣結(jié)束后用平衡液充分洗柱，再依次用含50、100、200、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12％SDS-PAGE電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。
結(jié)果將不同濃度NaCl從S-Sepharose FF柱上洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示(見圖6)，電泳結(jié)果顯示，100mmol/L NaCl洗脫蛋白峰即為SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，顯色一條很濃的SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白(約60kD處)，其它洗脫峰內(nèi)無明顯SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白帶。
純化SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的鑒定及應(yīng)用將純化的重組SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原，通過間接ELISA試驗方法，檢測抗SARS病毒抗體(IgM或IgG)陽性及陰性血清，以鑒定表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的抗原性和特異性。實驗結(jié)果顯示，該重組融合蛋白有很好的抗原性和特異性，可用作抗原檢測抗SARS病毒抗體等。
材料和方法1.抗SARS病毒抗體陽性血清及正常人血清GBI公司生產(chǎn)的抗SARS病毒抗體ELISA試劑盒內(nèi)的陽性對照，及2份滅活的抗SARS病毒抗體陽性血清。正常人血清由本實驗室保存。
2.酶聯(lián)反應(yīng)材料酶聯(lián)板為深圳產(chǎn)96孔板，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人μ鏈單克隆抗體購自Sigma公司。其它材料為酶聯(lián)反應(yīng)的常規(guī)材料。
3.ELISA試驗采用間接ELISA檢測血清中的抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)?；静襟E為用50mmol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)稀釋SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白，包被酶聯(lián)板，每孔100μl，4℃過夜。次日用封閉液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.05％硫硫汞，5％蔗糖)封閉，每孔130μl，37℃ 1h(或4℃過夜)。將待測的抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)陰、陽性血清，用樣本稀釋液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)稀釋后(IgG 1∶20稀釋，IgM 1∶100稀釋)，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100μl，每個樣本加2孔，37℃反應(yīng)30min，用PBST洗液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4，0.5％吐溫-20)洗5遍后，加1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG或抗人μ鏈單抗，每孔100μl，37℃反應(yīng)30min，PBST洗5遍，加底物四甲基聯(lián)苯氨(TMB)溶液100μl，37℃避光顯色10min，加50μl 4N硫酸混勻終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。
結(jié)果1.間接ELISA檢測血清中抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)將純化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白與已知不同濃度的牛血清白蛋白(第五部分)共同電泳、顯色后比較，確定純化的SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白濃度約為0.5mg/ml。用50mmol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)1∶500稀釋后包被酶聯(lián)板，檢測已知2份抗SARS病毒IgG抗體陽性血清和1份抗SARS病毒IgM抗體陽性血清。結(jié)果顯示，2份抗SARS病毒抗體陽性血清均出現(xiàn)顯色反應(yīng)，A450值分別為1.335和1.098。1份抗SARS病毒抗體(IgM)陽性血清也出現(xiàn)顯色反應(yīng)，A450值為0.872。同時檢測了180份正常人血清，它們的A450值均小于0.05，說明SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白具有較好的抗原性和特異性。
SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白序列表<110>李越希<120>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白及其制備、應(yīng)用<160>2<210>1<211>560<212>PRT<213>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白<220><223>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，即SARS病毒的S蛋白的第162個氨基酸至第460個氨基酸片段和SARS病毒的N蛋白的第1個氨基酸至258氨基酸片段的融合蛋白，N蛋白片段在融合蛋白的N端，S蛋白片段在融合蛋白的C端，兩蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，在N蛋白片段的第一個氨基酸蛋氨酸后插入一個甘氨酸，融合蛋白全長560個氨基酸。<400>lMet Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg1 5 10 15Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly20 25 30Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro35 40 45Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu50 55 60Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser65 70 75 80Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val85 90 95Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe100 105 110Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn115 120 125Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu ASn Thr Pro130 135 140Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val145 150 155 160Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu165 170 175Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser
180 185 190Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser195 200 205Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu210 215 220Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly225 230 235 240Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala245 250 255Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val260 265 270Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys275 280 285Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp290 295 300Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe305 310 315 320Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr325 330 335Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr340 345 350Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu355 360 365Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala370 375 380Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr385 390 395 400Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe405 410 415Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr420 425 430Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys435 440 445Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe450 455 460Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser465 470 475 480Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln485 490 495Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu500 505 510Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile515 520 525Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg530 535 540His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe545 550 555 560<210>2<211>1683<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)…(1683)<223>人工合成的基因片段，編碼SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的融合蛋白。<220><221>mis-feature<222>(1)…(777)<223>人工合成的基因片段，編碼SARS病毒N蛋白的第1個氨基酸至258氨基酸片段，在N蛋白第一個氨基酸密碼子ATG后插入一個甘氨酸密碼子GGA。<220><221>mis-feature<222>(778)…(783)<223>連接SARS病毒S蛋白基因片段與N蛋白基因片段的BamHI酶切位點。<220><221>mis-feature<222>(784)…(1680)<223>人工合成的基因片段，編碼SARS病毒S蛋白的第162個氨基酸至460個氨基酸片段。<220><221>mis-feature<222>(1681)…(1683)<223>合成基因時增加的終止密碼子。<400>2ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACA TTT GGT 60Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly1 5 10 15 20GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGG CCA AAA 120Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys25 30 35 40CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCT CTC ACT CAG 180Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln45 50 55 60CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTT CCA ATC AAC ACC AAT AGT 240His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln GIy Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser65 70 75 80GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGA AGA GCT ACC CGA CGA GTT CGT GGT GGT GAC 300Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp85 90 95 100GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCC AGA TGG TAC TTC TAT TAC CTA GGA ACT GGC CCA GAA 360Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu105 110 115 120GCT TCA CTT CCC TAC GGC GCT AAC AAA GAA GGC ATC GTA TGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC 420Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala125 130 135 140TTG AAT ACA CCC AAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG 480Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val145 150 155 160CTA CAA CTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAA GGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGC 540Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly165 170 175 180GGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCA CGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AAT TCA ACT 600Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr185 190 195 200CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCT GCT CGA ATG GCT AGC GGA GGT GGT GAA ACT GCC 660Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala205 210 215 220CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGA TTG AAC CAG CTT GAG AGC AAA GTT TCT GGT AAA GGC 720Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Ash Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly225 230 235 240CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACT GTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAG GGA 780Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly245 250 255 260TCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA 840Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Ash Phe Lys265 270 275 280CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC 900His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr285 290 295 300CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC 960Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe305 310 315 320AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG 1020Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
325 330 335 340GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT 1080Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr345 350 355 360ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG 1140Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln365 370 375 380AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC 1200Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr385 390 395 400CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT 1260Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr405 410 415 420AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG 1320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp425 430 435 440GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT 1380Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe445 450 455 460TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC 1440Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser465 470 475 480AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT 1500Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly485 490 495 500CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT 1560Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val505 510 515 520CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT 1620Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr525 530 535 540CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC 1680Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe545 550 555 560TAA 168權(quán)利要求
1.一種SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，即SARS病毒的S蛋白的第162個氨基酸至第460個氨基酸片段和SARS病毒的N蛋白的第1個氨基酸至258氨基酸片段的融合蛋白，N蛋白片段在融合蛋白的N端，S蛋白片段在融合蛋白的C端，兩蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，在N蛋白片段的第一個氨基酸蛋氨酸后插入一個甘氨酸，融合蛋白全長560個氨基酸，氨基酸序列如下Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg1 5 10 15Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly20 25 30Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro35 40 45Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu50 55 60Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser65 70 75 80Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val85 90 95Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe100 105 110Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn115 120 125Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro130 135 140Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val145 150 155 160Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu165 170 175Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser180 185 190Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser195 200 205Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu210 215 220Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly225 230 235 240Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala245 250 255Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val260 265 270Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys275 280 285Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp290 295 300Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe305 310 315 320Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr325 330 335Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr340 345 350Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu355 360 365Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala370 375 380Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr385 390 395 400Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe405 410 415Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr420 425 430Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys435 440 445Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe450 455 460Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser465 470 475 480Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln485 490 495Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu500 505 510Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile515 520 525Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg530 535 540His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
2.權(quán)利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，利用基因工程技術(shù)表達、制備該蛋白，具體方法如下SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的篩選通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)S蛋白的N端第162個氨基酸至第460個氨基酸含有較強的抗原決定簇，N蛋白的第1個氨基酸至258氨基酸含有較強的抗原決定簇，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，分別化學(xué)合成包含上述抗原決定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位點及8個保護堿基，并在起始密碼子ATG之后插入了一個甘氨酸密碼子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位點及3個保護堿基，在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位點及兩個保護堿基，在3’端增加了終止密碼子TAA和EcoRI酶切位點及兩個保護堿基，使合成的兩個基因片段易于串聯(lián)克隆至質(zhì)粒pET28a(+)內(nèi)的NcoI和EcoRI酶切位點內(nèi)；篩選的SARS病毒N蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第1個aa-第258個aa)Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly AlaArg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp PheThr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln GlyVal Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg ArgAla Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro ArgTrp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly AlaAsn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro LysAsp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln LeuPro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly GlySer Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn SerThr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly GlyGlu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser LysVal Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser AlaAla Glu Ala Ser Lys Lys篩選的SARS病毒S蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第162個aa-第460個aa)Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn PheLys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val TyrLys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn ThrLeu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg AlaIle Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala AlaTyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu AsnGly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu LysCys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn PheArg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu CysPro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp GluArg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser ThrPhe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp LeuCys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val ArgGln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu ArgPro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化學(xué)合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796bp)GCG AGT CAC CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCCCCG CAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGGACG CAA TGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TACTGC GTC TTG GTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCCTCG AGG CCA GGG CGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGGCTA CTA CCG AAG AGC TAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGAGCT CAG CCC CAG ATG GTA CTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACTTCC CTA CGG CGC TAA CAA AGA AGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTTGAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGG CAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CACCGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGGAAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCG CTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAATTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGG AAA TTC TCC TGC TCG AAT GGCTAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCT GCT AGA CAG ATT GAA CCAGCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACA AGG CCA AAC TGT CACTAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA GGG ATC CGC G化學(xué)合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGTAAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TACGTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTTAAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTCCGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCTGCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GACGAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAACTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCTAAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AACCTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCATGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AACTCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GACGTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAACTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GACGCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAACTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC表達SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pET28a(+)，用Nco I和EcoR I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)，用Nco I和BamH I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamHI和EcoR I雙酶切化學(xué)合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分別電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)；取等摩爾濃度的上述三種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段經(jīng)BamH I酶連接后，插入到載體pET28a(+)內(nèi)的Nco I和EcoR I位點之間，表達一個SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的融合蛋白；重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含60μg/ml卡那霉素的LB平板，置37℃過夜，次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和含pET28a(+)質(zhì)粒的對照菌，分別提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)組成引物對，PCR擴增連接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段，含串聯(lián)兩個基因片段的陽性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴增出長約1701bp的串聯(lián)基因片段，將含有串聯(lián)基因的質(zhì)粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質(zhì)粒含有連接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段與S蛋白基因片段，序列完全正確ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACATTT GGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGGGCA AGG CCA AAA CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGGTTC ACA GCT CTC ACT CAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAGGGC GTT CCA ATC AAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGAAGA GCT ACC CGA CGA GTT CGT GGT GGT GAC GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCCAGA TGG TAC TTC TAT TAC CTA GGA ACT GGC CCA GAA GCT TCA CTT CCC TAC GGCGCT AAC AAA GAA GGC ATC GTA TGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC TTG AAT ACA CCCAAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG CTA CAACTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAA GGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGCGGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCA CGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AATTCA ACT CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCT GCT CGA ATG GCT AGC GGA GGTGGT GAA ACT GCC CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGA TTG AAC CAG CTT GAG AGCAAA GTT TCT GGT AAA GGC CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACT GTC ACT AAG AAA TCTGCT GCT GAG GCA TCT AAA AAGGGA TCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTGGAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAAAAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTTCGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTGGGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACTACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGCTCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GACAAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTGCGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCTGAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCTTTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTTATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCTTGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TATCGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTGCCG TTC TAA構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全長560個氨基酸，在其N端為N蛋白片段，長259個氨基酸，C端為S蛋白片段，長299個氨基酸，兩者之間由氨酸和絲氨酸兩個氨基酸連接，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile ThrPhe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn GlyAla Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser TrpPhe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly GlnGly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gin Ile Gly Tyr Tyr ArgArg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser ProArg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr GlyAla Asn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr ProLys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu GlnLeu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg GlyGly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg AsnSer Thr 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pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)懸浮沉淀，裝入透析袋內(nèi)，對平衡液透析過夜，換液1次，離心收集上清，直接上S-Sepearse FF陽離子柱純化純化；3)S-Sepearse FF陽離子柱純化用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2 mmol/L DTT)沖洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然后將上步透析好的上清直接上柱，上樣結(jié)束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含梯度濃度NaCl的平衡液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用SDS-PAGE電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，100mmol/L NaCl洗脫蛋白峰即為SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白；純化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原檢測SARS病毒抗體將復(fù)性的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用50mmol/L的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋后包被酶聯(lián)板，間接酶聯(lián)免疫法檢測已知的抗SARS病毒陽性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白能與抗SARS病毒陽性血清反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明表達的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白有較好抗原性和特異性。
3.權(quán)利要求1所述的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用于疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗SARS病毒單抗和多抗。
4.權(quán)利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，通過基因重組技術(shù)，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉(zhuǎn)基因動植物進行重組表達、制備。
5.權(quán)利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，融合蛋白中SARS病毒S蛋白片段與N蛋白片段的任意連接，N蛋白片段在融合蛋白的N端或C端，以融合蛋白的形式進行表達、制備。
全文摘要
本發(fā)明SARS病毒S蛋白與N蛋白的融合蛋白及其制備、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。通過計算機分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162個氨基酸至第460個氨基酸，共299個氨基酸，和含強抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1個氨基酸至258氨基酸。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，將兩個基因片段串聯(lián)，利用基因工程技術(shù)表達S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，兩蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，在N蛋白片段的第一個氨基酸蛋氨酸后插入一個甘氨酸，融合蛋白全長560個氨基酸。表達的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測，及用于免疫制備抗SARS病毒單抗和多抗等。
文檔編號A61P31/00GK1488646SQ0313216
公開日2004年4月14日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者李越希, 陶開華, 朱敏生 申請人:李越希