專利名稱：雞ibd病毒vp2蛋白和ltb的融合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程亞單位疫苗技術領域，具體涉及IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其應用，即雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白及應用。
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)主要侵害雞的中樞免疫器官法氏囊，從而導致免疫抑制，增加了機體對其它病原體的易感性，降低對其它疫苗的反應性，國外學者形象地稱該病為雞的“艾滋病”。雖然各國學者在IBD疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能從根本上扭轉IBD流行日趨嚴重的現狀。近十幾年來，由于雞傳染性法氏囊病病毒IBDV超強毒株和變異株的出現、抗原變異和血清亞型的多樣性，使目前的商品化疫苗不能提供足夠的保護，其保護率僅達109^70%。超強毒株的毒力是標準病毒株的兩倍以上，使雞的發(fā)病率和死亡率明顯上升，年齡較大的雞甚至18周齡以上的后備母雞也能致病。傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗已經面臨著嚴峻的考驗，大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-liable enterotoxin, LT)是由腸產毒性大腸桿菌(Enterotox1-genetic E. coli,ETEC)分泌的一種外毒素,具有很強的免疫佐劑特性。大腸埃希菌不耐熱腸毒素是六聚體蛋白，由I個分子質量為28 ku的A亞基和5個分子質量為11 ku的B亞基單體組成，形成AB5型結構。A亞基具有毒性作用，而B亞基具有較強的免疫佐劑作用，并可避免A亞基的毒性作用，無毒且具有佐劑活性的B亞單位被研究者所關注。研究發(fā)現IBD通常通過經消化道和呼吸道等粘膜途徑感染，良好的局部粘膜免疫是抵抗該病感染的重要防線，所以通過模擬病原體的自然感染途徑，增強病原體最初侵入的呼吸道和消化道粘膜局部產生特異性的抗體，進而引起全身性系統(tǒng)免疫應答，對防治該病具有重要意義。因此，建立一種能夠預防雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗就具有重要的現實意義和市場開發(fā)價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其應用，涉及一種IBDV VP2蛋白與大腸桿菌LTB融合蛋白的制備及應用，即將臨床分離的IBDV超強毒株的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑作用的大腸桿菌LTB蛋白通過I inker連接起來，獲得了一個融合蛋白，該蛋白經過純化后制成疫苗可以是免疫雞抵抗IBDV強毒及超強毒的攻擊而不引起免疫抑制。本發(fā)明的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。用于編碼上述融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明的融合蛋白用于制備亞單位疫苗。一種亞單位疫苗的制備方法如下取注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相罐中混合均勻，加熱融化至半透明狀，再加6份的司本-80高壓滅菌作為油相備用；取滅菌的4份吐溫-80，加入96份的融合蛋白，充分攪拌至吐溫-80完全溶解作為水相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即可制備雞傳染性法氏囊病病毒VP2亞單位疫苗。上述制備的亞單位疫苗用來防治雞傳染性法氏囊病。本發(fā)明是將雞IBDV超強毒的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑大腸桿菌LTB蛋白融合表達，制備的疫苗經皮下注射后對雞抵抗雞傳染性法氏囊病強毒攻擊具有堅強的抵抗力。
具體實施例方式IBDV的主要結構蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護性抗原，而大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB是良好的粘膜免疫佐劑，本發(fā)明是用重疊延伸PCR方法將兩種基因通過linker連接起來，克隆到pET-28a載體上，轉化BL21(DE3)，經IPTG誘導后VP2-LTB融合蛋白獲得了表達，將表達菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2-LTB蛋白溶液，加入礦物油佐劑制成 油乳劑疫苗，可用于預防雞傳染性法氏囊病，效果優(yōu)于VP2亞單位疫苗。下面結合具體的實施例對本發(fā)明的融合蛋白進行詳細的描述。一、VP2基因的篩選用Primer5. 0軟件設計了一對擴增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護性堿基及BamH I酶切位點，在下游引物的5'端加入保護性堿基和Xho I酶切位點，引物序列為Primer1:5' -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 :5' -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 W用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按RNAisoReagent說明書所述方法提取病毒RNA,按反轉錄試劑盒使用說明書進行反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，擴增體系為(50 m) 10XPCR Buffer 5W，dNTP (lOmM each) ml,上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，Taq酶(5U/>1 ) ll^l，ddH2034W ;PCR 反應參數95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個循環(huán)，72 °CIOmin。得到一個1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6W，T 載體 2W (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 1W，T4 buffer 2. 5W，水13. 5W，總計25沿。16°C過夜連接，取20沿連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑選10個白色菌落培養(yǎng)，提取質粒鑒定正確的選取3個測序，結果3個質粒的測序結果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴增的過程中沒有產生錯誤，其核苷酸序列為SEQ ID N0:4，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO:3。將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對，有十幾個堿基發(fā)生了點突變，導致翻譯的氨基酸序列也有幾個位點發(fā)明變化。表明該毒株為一新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護性抗原，經常發(fā)生突變而導致抗原性發(fā)生差異。二、VP2重組蛋白的表達將鑒定正確的上述一個質粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個酶切的pET-28a載體連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質粒鑒定正確后轉化感受體的BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉接5mlLB小管培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)3 4小時至0D600為0. 6時，加入終濃度為0. 8mM的IPTG誘導4飛小時，SDS-PAGE電泳結果證實為分泌表達。將表達菌用10倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴散試驗，結果瓊擴效價不低于1:64。三、VP2蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亞單位疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，混合后，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白發(fā)酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨 內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 01 %。VP2亞單位疫苗的免疫效果將20只SPF雞隨機分為兩組，每組10只，其中一組在21日齡時以0. 3ml/只的劑量皮下注射VP2亞單位疫苗，免疫21日后連同不免疫對照組每只經點眼途徑接種100BID雞傳染性法氏囊病強毒BC6-85株毒液，攻毒后每天觀察雞只的臨床表現及死亡情況，記錄發(fā)病和死亡雞數，剖檢觀察死亡雞法氏囊等病變，72 96小時撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病理變化。結果不免疫對照組8只雞發(fā)病，而免疫組雞只無發(fā)病。上述結果證明本發(fā)明制備的VP2亞單位疫苗具有很好的免疫原性。五、VP2蛋白與大腸桿菌LTB基因的融合采用重疊延伸PCR方法擴增融合基因。分別使用以下引物。其中P5引入Not I的酶切位點。P1:5' -GGATCCGCGTCGACATGACAA ACCTGCAAGATC - 3'P 3 :5' - AACGCCGTAAATAAAACCATGCCAGAGCCGCCAGAGCC - 3'P 4:5' -GGCTCTGGCGGCTCTGGCATGGTTTTATTTACGGCGTT - 3'P 5 :5' -GCGGCCGCCTAGTTTTCCATACTGATTG - 3'用Pl 和 P3 擴增 IBDV 的 VP2 基因(SEQ ID N0:4)，擴增體系為(50 m) =IOXPCRBuffer 5m,dNTP (IOmM each) 1W，上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 Pl，25mM MgCl24 Taq酶(5U/W ) lW，ddH20 3姐 JCR反應條件95°C預變性 5min，94°C變性 lmin，52°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin,循環(huán) 5 次后，94°C變性 lmin, 56°C退火 lmin, 72°C延伸 Imin,30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。膠回收試劑盒回收大約1400bp的PCR片段。用P4和P5擴增大腸桿菌LTB基因，用質粒提取試劑盒從產腸毒素大腸桿菌中提取質粒，以質粒為模板進行PCR擴增，PCR體系為(50 m) 10XPCR Buffer 5W，dNTP (IOmMeach) 1W，上、下游引物(IOmM)各 1耵，質粒 DNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，TaqT 酶(5U/m ) m, ddH20 3姐。PCR 反應條件95°C預變性 5min，94°C變性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)5次后，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸Imin，30個循環(huán)，72 °C延伸lOmin。膠回收試劑盒回收大約350bp的PCR片段，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 5。再用Pl和P5以回收的VP2 PCR片段及LTB PCR片段為模板，擴增融合基因，反應條件為95°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0得到片段大約1700bp。核苷酸測序結果為SEQ ID NO:2，翻譯的氨基酸序列為SEQID NO:1 ;都與最初設計的一致。六、融合蛋白的誘導表達1、將上述制備的融合基因與pET_28a載體分別經BamH I和Not I雙酶切回收后進行連接連接，將重組載體用氯化鈣法轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，克隆后篩選出的陽性克隆測序確定插入的片段正確。將陽性克隆用IPTG誘導表達，將表達產物后電泳可見65kd左右的蛋白，表達量大約為7 8%，瓊脂擴散試驗及western-blot方法鑒定表明，表達的蛋白為VP2-LTB融合蛋白，超聲破碎細菌后分別取上 清和沉淀SDS-PAGE電泳，表明蛋白為可溶性表達。2、重組蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過夜。所得透析液即為純化的
蛋白，可用于制苗。七、VP2亞單位疫苗與VP2-LTB亞單位疫苗制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，混合后，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后分別加入上述制備的VP2重組蛋白、VP2-LTB融合蛋白發(fā)酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 01 %。制備的疫苗分別為VP2亞單位疫苗與VP2-LTB亞單位疫苗。八、VP2亞單位疫苗與VP2-LTB亞單位疫苗的免疫效果將制備的兩種基因工程亞單位疫苗分別免疫21日齡SPF雞，每種疫苗免疫30只，免疫后7日分別測定采集抗凝血測定淋巴細胞轉化率，免疫21日后采血分離血清測定法氏囊瓊擴效價，并連同不免疫對照10只用強毒BC6-85點眼攻毒，結果表明7日淋巴細胞轉化率VP2-LTB免疫組明顯高于VP2免疫組與對照組；21日攻毒后兩免疫組均能得到10/10保護，對照組9/10發(fā)病；血清的瓊脂擴散抗體效價的幾何平均數VP2-LTB免疫組的明顯高于VP2免疫組。上述結果表明本發(fā)明所制備的融合蛋白作為疫苗具有很好的效果。
權利要求
1.一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.一種核苷酸，所述的核苷酸用于編碼權利要求1所述的融合蛋白。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQID N0:2。
4.權利要求1所述的融合蛋白在制備亞單位疫苗中的應用。
5.一種亞單位疫苗，其制備方法如下取注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相罐中混合均勻，加熱融化至半透明狀，再加6份的司本-80高壓滅菌作為油相備用；取滅菌的4 份吐溫-80，加入96份的權利要求1所述的融合蛋白，充分攪拌至吐溫-80完全溶解作為水相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即制成亞單位疫苗。
6.權利要求5所述的亞單位疫苗用來防治雞傳染性法氏囊病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明是將雞IBDV超強毒的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑大腸桿菌LTB蛋白融合表達，表達產物乳化制備疫苗，免疫21日齡SPF雞，并設VP2亞單位疫苗免疫對照及不免疫對照，免疫后7日測定淋巴細胞轉化率，免疫 21日采血測定血清瓊脂免疫擴散抗體效價并連同不免疫對照攻毒，結果各疫苗免疫組均能抵抗強毒攻擊，而淋巴細胞轉化率和血清抗體效價均明顯高于VP2免疫對照組，具有良好的免疫原性。
文檔編號A61K39/39GK102993311SQ20121050908
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權日2012年12月3日
發(fā)明者王雷, 凌紅麗, 王宏華, 王睿智 申請人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司