和質(zhì)粒載體pTrc99A-M分別用限制性內(nèi)切酶SacI和Xmal進(jìn)行雙酶切。再將酶 切后的質(zhì)粒和DNA片段用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行清潔、回收。最后將回收得 到的片段和質(zhì)粒載體用NEB快連酶進(jìn)行連接，得到重組載體。pTrc99C-F/pTrc99C-R引物驗(yàn) 證，選PCR產(chǎn)物為2993bp的重組載體送到北京六合華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0113] 測(cè)序結(jié)果表明該重組載體為將含有BSyclB⑶基因的DNA片段（序列2)插入到 pTrc99A-M的SacI和Xmal酶切位點(diǎn)處，命名為99AM-BSycl。
[0114] 三、重組大腸桿菌表達(dá)99AM-ECycl和99AM-BSycl質(zhì)粒及苯酚測(cè)定
[0115] 1、重組菌株⑶-51-ECycl和⑶-51-BSycl的構(gòu)建
[0116] 選擇一株輔酶Q1Q生產(chǎn)菌株⑶-51 (戴冠蘋，苗良田，孫濤，等.代謝工程改造 大腸桿菌生產(chǎn)輔酶Ql〇[J].生物工程學(xué)報(bào)，2015,31 (2):206-219.;公眾可從中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研宄所獲得）作為宿主菌，分別將重組載體99AM-ECycl和99AM-BSycl 電轉(zhuǎn)化到菌株⑶-51中，得到重組菌株⑶-51-ECycl和⑶-51-BSycl，具體步驟如下（以 ⑶-51-ECycl 為例）：
[0117] 將50ul大腸桿菌⑶-51電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入lul質(zhì)粒 99AM-ECycl (約50ng/ul)，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0? 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司）電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2. 5kv。電擊后迅速將lml LB培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75rpm，30°C孵育2小時(shí)。取50ul菌液涂 在含有氨芐青霉素的LB平板上，37°C孵育過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，將陽性單菌落 進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性單菌落的質(zhì)粒進(jìn)行SacI和Xmal雙酶切，得到3743bp和2283bp的 兩條帶的為陽性質(zhì)粒，將含有陽性質(zhì)粒重組菌命名為⑶-51-ECycl。
[0118] 按照同樣的方法構(gòu)建重組菌株⑶-51-BSycl。
[0119] 將表達(dá)質(zhì)粒載體pTrc99A-M電轉(zhuǎn)入⑶-51的感受態(tài)細(xì)胞中，得到菌株⑶-51-99AM， 作為對(duì)照菌株。
[0120] 2、重組菌株苯酚產(chǎn)量的測(cè)定
[0121] 按照上述苯酚測(cè)定方法，以⑶-51-99AM作為對(duì)照菌株，將菌株⑶-51-ECycl和 ⑶-51-BSycl發(fā)酵，每株菌做3個(gè)平行，然后測(cè)定苯酚產(chǎn)量。
[0122] 結(jié)果如圖3所示（其中空白柱代表0D_，陰影柱代表苯酚產(chǎn)量，下同）。發(fā)酵24h 后，每株菌的〇D_都在4. 0左右，細(xì)胞干重約為1. 29g/L ;菌株⑶-51-ECycl的細(xì)胞干重 略高于菌株⑶-51-BSycl。對(duì)照菌株⑶-51-99AM不產(chǎn)苯酚，⑶-51轉(zhuǎn)入99AM-ECycl和 99AM-BSycl后均能生產(chǎn)苯酚。就苯酚產(chǎn)量而言，菌株⑶-51-ECycl的產(chǎn)量也均要略高于菌 株⑶-51-BSycl。所以，選擇來源于E.coli W中的4-羥基苯甲酸脫羧酶基因進(jìn)一步進(jìn)行研 宄，即選用重組載體99AM-ECycl進(jìn)行下面研宄。
[0123] (二）、表達(dá)ar〇Gto的重組載體
[0124] 一、克隆編碼DAHP合酶基因
[0125] 1、克隆aroG基因
[0126] 將來源于大腸桿菌 E. coli ATCC 8739(Gunsalus IC，Hand DB. The use of bacteria in the chemical determination of total vitamin C. J Biol Chem. 1941，141:853-858.公眾可從中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研宄所獲得），編碼DAHP 合酶的aroG基因克隆到表達(dá)載體pACYC184-M上，得到重組質(zhì)粒184M-aroG。具體步驟如 下：
[0127] (l)aroG 基因的 PCR 擴(kuò)增
[0128] 引物如下：
[0129] aroG-Pstl-F ：5, -GCATCTGCAGAAGGAGATATACCATGAATTATCAGAACGACGATTTAC-3'
[0130] aroG-Hindlll-R ：5, -GCATAAGCTTCATCGGATACGCCACTCTGA-3'
[0131] 上述引物的下劃線部分分別為PstI和Hindlll的酶切位點(diǎn)。
[0132] 以 aroG-Pstl-F/aroG-Hindlll-R 為引物，以 E. coli ATCC 8739 的基因組 DNA 為 模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為1053bp的PCR產(chǎn)物，即為aroG基因（序列3)。
[0133] (2)重組載體184M_aroG的構(gòu)建
[0134] 將得到的DNA片段用SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將 回收的片段和質(zhì)粒載體PACYC184-M分別用限制性內(nèi)切酶PstI和Hindlll進(jìn)行雙酶切。再 將酶切后l〇53bp PCR產(chǎn)物和酶切后4174bp的質(zhì)粒載體骨架用SanPr印柱式DNA膠回收試 劑盒進(jìn)行清潔、回收。最后將回收得到的片段和質(zhì)粒載體用NEB快連酶進(jìn)行連接，得到重 組載體。pTr C99C-F/pTrC99C-R引物驗(yàn)證并將驗(yàn)證正確的重組載體送去測(cè)序，測(cè)序引物為： pTrc99C-F/pTrc99C-R。
[0135] 測(cè)序結(jié)果表明該重組載體為將DNA片段aroG (序列3)插入到pACYC184-M的PstI 和Hindlll酶切位點(diǎn)處，命名為184M-aroG。
[0136] 2、克隆 aroGfbl基因
[0137] 將aroG基因定點(diǎn)突變（aroG基因ATG下游第436位堿基由G突變?yōu)锳)，來解除 DAHP合酶的反饋抑制，得到ar 〇Gffc基因（序列4)。然后將aroG f 基因克隆到表達(dá)載體 PACYC184-M上，得到重組載體184M-aroGfto。具體步驟如下：
[0138] (1)含pACYC184-M載體和aroGfto基因的DNA片段的擴(kuò)增
[0139] 引物如下：
[0140] aroG-1-A436 :5' -GGGTGATCATATTGAGAAACTCACC-3'
[0141] aroG-2 :5' -CACAATATCTCGCTGACCTGATGAG-3'
[0142] 以aroG-1-A436/aroG-2為引物，以質(zhì)粒184M-aroG為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到 大小為5284bp的PCR產(chǎn)物，即含有pACYC184-M載體和aroG?"基因的DNA片段。
[0143] (2)重組載體184M_aroGfto的構(gòu)建
[0144] 將PCR得到的含有pACYC184-M載體和aroGfbl:基因的DNA片段用SanPrep柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將回收的片段用Dpnl (購自NEB公司）酶處理，消除 原始的質(zhì)粒模板184M-aroG。
[0145] 將Dpnl處理后的DNA片段用SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收， 在回收得到的片段中加入luL T4多聚核苷酸激酶Buffer和0. 5yL T4多聚核苷酸激酶 (購自NEB公司）進(jìn)行磷酸化處理，來提供連接酶連接的磷酸末端。最后，將磷酸化的片段 用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體。將重組載體送去測(cè)序，測(cè)序引物為：pTrC99C-F/ pTrc99C-R〇
[0146] 測(cè)序結(jié)果表明，該重組載體為將序列表中序列4所示的aroG^S因插入 PACYC184-M載體的PstI和Hindlll酶切位點(diǎn)處，命名為lSAM-aroG?"，該重組載體也為將 184M-ar 〇G載體中的aroG基因的ATG下游第436位堿基由G突變?yōu)锳，其他序列保持不變， 得到的重組載體。
[0147] (三）、表達(dá)分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC基因的重組載體
[0148] 將來源于大腸桿菌E. coli ATCC 8739,編碼分支酸-丙酮酸裂解酶的ubiC基因克 隆到表達(dá)載體PACYC184-M上，得到重組質(zhì)粒184M-ubiC。具體步驟如下：
[0149] l、ubiC基因的PCR擴(kuò)增
[0150] 引物如下：
[0151] ubiC-Kpnl-F :5' -GCATGGTACCAAGGAGATATACCATGTCACACCCCGCGTTA-3'
[0152] ubiC-Pstl-R :5' -GCATCTGCAGTTAGTACAACGGTGACGCCG-3'
[0153] 上述引物的下劃線部分分別為Kpnl和PstI酶切位點(diǎn)。
[0154] 以u(píng)biC-Kpnl-F/ubiC-Pstl-R為引物，以E. coli ATCC 8739 的基因組DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為498bp的PCR產(chǎn)物，即為ubiC基因（序列5)。
[0155] 2、重組載體184M-ubiC的構(gòu)建
[0156] 將得到的DNA片段用SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將 回收的片段和質(zhì)粒載體PACYC184-M分別用限制性內(nèi)切酶Kpnl和PstI進(jìn)行雙酶切。再將 酶切后的質(zhì)粒和DNA片段用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行清潔、回收。最后將回收 得到的片段和質(zhì)粒載體用NEB快連酶進(jìn)行連接，得到重組載體。將重組載體送去測(cè)序，測(cè)序 引物為：pTrc99C-F/pTrc99C-R。
[0157] 測(cè)序結(jié)果表明該重組載體為將DNA片段ubiC (序列5)插入到pACYC184-M的Kpnl 和PstI酶切位點(diǎn)處，命名為184M-ubiC。
[0158] (四）、重組菌株 8739-ycl、8739-ycl-aroGfblP 8739-ycl-ubiC 的構(gòu)建及其苯酚 產(chǎn)量的測(cè)定
[0159] 1、重組菌株 STSg-ycljTSg-ycl-aroG^r和 8739-ycl-ubiC 的構(gòu)建
[0160] 將質(zhì)粒99AM-ECycl電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌野生型ATCC 8739的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重 組菌株8739-ycl ;
[0161] 將質(zhì)粒99AM-ECycl和質(zhì)粒lSAM-aroG?"電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌野生型ATCC 8739的 感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株8739-ycl-aroGfbl:;
[0162] 將質(zhì)粒99AM-ECycl和質(zhì)粒184M-ubiC電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌野生型ATCC 8739的感 受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株8739-ycl-ubiC。
[0163] 將表達(dá)載體pTrc99A-M和pACYC184-M電轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌ATCC 8739的感 受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株8739-99AM-184M，作為對(duì)照菌株。
[0164] 2、重組菌株苯酚產(chǎn)量的測(cè)定
[0165] 按照上述苯酚測(cè)定方法，以8739-99AM-184M菌株作為對(duì)照，將菌株8739-ycl、 STSg-ycl-aroG^lP 8739-ycl-ubiC發(fā)酵，每株菌做3個(gè)平行，然后測(cè)定苯酚產(chǎn)量。
[0166] 結(jié)果如圖4 (其中空白柱代表OD_，陰影柱代表苯酚產(chǎn)量，下同）所示。野生型大腸 桿菌ATCC 8739并不能生產(chǎn)苯酚；表達(dá)來源于E.coli W中的對(duì)羥基苯甲酸脫羧酶之后就可 以生產(chǎn)苯酚，轉(zhuǎn)化得到的菌株8739-ycl的苯酚產(chǎn)量為0. 30mg/L ;質(zhì)粒過表達(dá)了定點(diǎn)突變的 DAHP合酶后，得到的重組菌株STSg-ycl-aroG?"的苯酚產(chǎn)量提高了 5. 83倍，達(dá)到2. 05mg/ L。質(zhì)粒過表達(dá)了 UbiC后，得到的重組菌株8739-ycl-ubiC的苯酚產(chǎn)量提高了 68. 20倍，產(chǎn) 量達(dá)到了 20. 76mg/L。
[0167] 實(shí)施例2、基因組水平表達(dá)4-羥基苯甲酸脫羧酶基因（ECyclB⑶）、DAHP合酶突變 基因和/或分支酸-丙酮酸裂解酶基因的重組菌構(gòu)建
[0168] 本實(shí)施例中的ycl操縱子均為來源于大腸桿菌的4-羥基苯甲酸脫羧酶基因簇 (序列1)。
[0169] (一）ycl操縱子整合到大腸桿菌ATCC 8739的染色體上得到的重組菌Phe002及 其苯酚產(chǎn)量的測(cè)定
[0170] 一、組成型質(zhì)粒pACYC184M-P12的構(gòu)建
[0171] 1、FRT-Km-FRT: :M1-12DNA 片段的 PCR 擴(kuò)增。
[0172] 引物如下：
[0173] FRT-Spel :5' -GCATACTAGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[0174] AP2-down-PmeI-SacI ：5, -GCATGAGCTCAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC-3?
[0175] 上述引物的下劃線的部分分別為Spel、SacI和Pmel酶切位點(diǎn)。
[0176] 以FRT-SpeI/AP2-down-PmeI-SacI為引物，以M1-12菌株的基因組DNA為模板，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。得到大小為1573bp的PCR產(chǎn)物，為含有FRT-Km-FRT (序列6)和人工調(diào)控元 件M1-12的DNA片段（序列7)。
[0177] 2、重組載體pACYC184M-P12的構(gòu)建
[0178] 將得到的含有FRT-Km-FRT和人工調(diào)控元件M1-12的DNA片段用SanPr印柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將回收的片段和分別用限制性內(nèi)切酶Spel和SacI 進(jìn)行雙酶切。再將酶切后1573bp PCR產(chǎn)物與酶切后2700bp的質(zhì)粒載體pACYC184-M骨架 用NEB快連酶進(jìn)行連接，得到重組載體