。將重組載體pACYC184M-P12用Spel和SacI進(jìn)行 進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得約2700bp和1550bp條帶。酶切驗(yàn)證結(jié)果表明將含有FRT-Km-FRT和人工 調(diào)控元件M1-12的DNA片段插入到pACYC184-M的Spel和SacI酶切位點(diǎn)，所得重組質(zhì)粒命 名為 PACYC184M-P12。
[0179] 二、質(zhì)粒 184M-P12_ycl 的構(gòu)建
[0180] 將質(zhì)粒載體pACYC184M-P12和質(zhì)粒99AM-Ecycl分別用限制性內(nèi)切酶SacI和Xmal 進(jìn)行雙酶切，將酶切后得到酶切后的載體（4246bp)和ycl操縱子（2268bp)分別用SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將回收得到的片段和載體用NEB快連酶進(jìn)行 連接。
[0181] 將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Transl-Tl中，并在含有硫酸卡那霉素和氯霉 素的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑選8個(gè)在含有Km+Cm的LB平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，用引物 kan-F/ycl-340-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。引物如下：
[0182] kan-F :5, -CCGTGATATTGCTGAAGAG-3'
[0183] ycl-340-R :5' -CTTCTTTGAGCACGACGTC-3'
[0184] PCR產(chǎn)物為約850bp的條帶為正確重組子，將PCR驗(yàn)證正確的克隆提取質(zhì)粒，用 SacI和Xmal進(jìn)行進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切后電泳得2270np和4300bp條帶，表明將來(lái)源于大 腸桿菌的ycl操縱子（ECyclB⑶，序列1)插入到pACYC184M-P12的SacI和Xmal酶切位點(diǎn) 處，該重組質(zhì)粒命名為184M-P12-ycl。
[0185] 三、一步同源重組法在ldhA位點(diǎn)整合ycl操縱子
[0186]1、整合片段的PCR擴(kuò)增
[0187] 引物如下：
[0188] 1 dhA-up-FRT : 5，-ATTAAATTTGAAATTTTGTAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAGTGT AGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[0189] ldhA-down-rrnB ：5, -AATAGAGGATGAAAGGTCATTGGGGATTATCTGAATCAGCTCCCCTGGAAT GCAGGGGAGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT-3，
[0190] 上述引物的下劃線部分分別為與ldhA基因上下游同源的序列。
[0191] 以 ldhA-up-FRT/ldhA-down-rrnB 為引物，以質(zhì)粒 184M_P12_ycl 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。得到大小為3728bp的PCR產(chǎn)物（一步同源重組片段），為含有與乳酸脫氫酶基因ldhA 上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、編碼4-羥基苯甲酸脫羧酶基因（ycl操縱子）及 其人工調(diào)控元件M1-12和與ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段。將得到的PCR產(chǎn) 物用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。并用Dpnl酶處理，再清潔、回收， 用于一步法整合。
[0192] 2、質(zhì)粒pKD46的電轉(zhuǎn)化
[0193] 將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌ATCC 8739的感受態(tài)細(xì)胞中，取50 y L轉(zhuǎn) 化的菌液，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0194] 3、ycl操縱子的一步法整合
[0195] 將1中準(zhǔn)備的一步同源重組片段（含有與乳酸脫氫酶基因ldhA上游同源的50bp 序列、FRT-Km-FRT片段、編碼4-羥基苯甲酸脫羧酶基因（ycl操縱子）及其人工調(diào)控元件 M1-12和與ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段）電轉(zhuǎn)化到含有pKD46的ATCC 8739 的感受態(tài)細(xì)胞中，取500 y L轉(zhuǎn)化的菌液，涂布在含硫酸卡那霉素的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑 選8個(gè)在含有Km的LB平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，用引物ldhA-up/ycl-340-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。 其中上游引物為：
[0196] ldhA-up :5' -GATAACGGAGATCGGGAATG-3'
[0197] PCR得到大小為2165bp的條帶，說(shuō)明整合成功。
[0198] 選2株整合成功的菌株送去測(cè)序，測(cè)序引物為kan-F/ycl-340-R。將測(cè)序正確的菌 株命名為PheOOl，其將含有與乳酸脫氫酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片 段、編碼4-羥基苯甲酸脫羧酶基因（ycl操縱子）及其人工調(diào)控元件M1-12和與ldhA基因 下游同源的60bp序列的DNA片段同源重組到大腸桿菌ATCC 8739中得到的重組菌。
[0199] 4、PheOOl菌株中Km-FRT序列的消除
[0200] 1)、質(zhì)粒pFT-A的電轉(zhuǎn)化
[0201] 將質(zhì)粒pFT-A電轉(zhuǎn)化到PheOOl菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB平 板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0202] 2)、Km-FRT序列的消除
[0203] 挑取轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pFT-A的PheOOl菌株的單克隆，接種到含有l(wèi)OmL LB液體培養(yǎng)基 (終濃度50 y g/mL的Amp)的250mL三角瓶中，30°C，200rpm培養(yǎng)至0D ~ 0? 1 ;加入50 y L 的氯四環(huán)素（chlorotetracyclin，5mg/mL，200X的母液），繼續(xù)生長(zhǎng)6h ;在LB平板上劃線， 39 °C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0204] 然后挑取單克隆同時(shí)在LB，LB (Amp)，LB (Km)平板中劃線培養(yǎng)，選取在LB上生長(zhǎng)， 在LB(Amp)和LB(Km)中不生長(zhǎng)的克隆，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證引物為：ldhA-up/ycl_34〇-R。
[0205] PCR得到大小為807bp的條帶，說(shuō)明驗(yàn)證成功。將驗(yàn)證成功的菌株命名為Phe002， 其為將來(lái)源于大腸桿菌的ycl操縱子（ECyclB⑶）和其人工調(diào)控元件M1-12整合到大腸桿 菌 ATCC8739 的 ldhA 位點(diǎn)。
[0206] 四、重組大腸桿菌Phe002苯酚產(chǎn)量的測(cè)定
[0207] 按照上述苯酚測(cè)定方法，以野生型大腸桿菌菌株ATCC 8739作為對(duì)照，將菌株 Phe002發(fā)酵，然后測(cè)定苯酚產(chǎn)量。
[0208] 結(jié)果如圖5(其中空白柱代表0D_，陰影柱代表苯酚產(chǎn)量，下同）所示。野生型大 腸桿菌菌株ATCC 8739不能生產(chǎn)苯酚，Phe002菌株的006(|(|為6. 22,苯酚產(chǎn)量為1. 73mg/L。
[0209] (二）、表達(dá)ycl操縱子和ar〇Gffc基因得到的重組菌Phe004及其苯酚產(chǎn)量的測(cè)定
[0210] 一、質(zhì)粒184M-P12_aroGfbr的構(gòu)建
[0211] 將質(zhì)粒184M-aroGfto和質(zhì)粒載體pACYC 184M-P12分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和 Hindlll進(jìn)行雙酶切。將切下來(lái)的ar〇Gfbl:基因片段（1053bp)和質(zhì)粒載體（4217bp)骨架分 別用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行清潔、回收。然后將回收得到的片段和載體用NEB 快連酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。挑選陽(yáng)性克隆用引物kan-F/aroG-552-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。 其中下游引物為：
[0212] aroG-552-R :5, -CGTCGGTGCCATTTTTGAAG-3'
[0213] 將驗(yàn)證正確的克隆用Kpnl和Hindlll進(jìn)行進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切驗(yàn)證結(jié)果表明該 重組載體為將aroG fto基因DNA片段（序列4)插入到pACYC184M-P12的Kpnl和Hindlll酶 切位點(diǎn)處，命名為184M-P12-aroG fbl:。
[0214] 二、一步法整合aroGfbl基因
[0215] 1、整合片段的PCR擴(kuò)增
[0216] 引物如下：
[0217] aroG-FRT-up ：5, -ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGGTGT AGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[0218] 上述引物下劃線部分為與aroG基因上游同源的50bp序列。
[0219] 以aroG-FRT-up/aroG-552-R為引物，以質(zhì)粒 lSAM-PU-aroG^1 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。得到大小為2555bp的PCR產(chǎn)物（一步同源重組片段），為含有與aroG基因上游同源 50bp、下游同源的100bp序列、FRT-Km-FRT片段、人工調(diào)控元件M1-12和aroG^S因的前 552bp片段。將得到的PCR產(chǎn)物用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。并用 Dpnl酶處理，再清潔、回收，用于一步法整合。
[0220] 2、質(zhì)粒pKD46的電轉(zhuǎn)化
[0221] 將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化到菌株P(guān)he002的感受態(tài)細(xì)胞中，取50 y L轉(zhuǎn)化的菌液，涂布 在含有氨芐青霉素的LB平板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0222] 3、aroGfbl基因的一步法整合
[0223] 將1中準(zhǔn)備的一步同源重組片段電轉(zhuǎn)化到含有pKD46的Phe002菌株的感受態(tài)細(xì) 胞中，取500 y L轉(zhuǎn)化的菌液，涂布在硫酸卡那霉素的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑選8個(gè)在含有 Km的LB平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，用引物aroG-252-F/aroG-552-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其中上游 引物為：
[0224] aroG-256-F :5' -CATTGGTTTAAGATTTCAGCCAGG-3'
[0225] PCR得到大小為2249bp的條帶，說(shuō)明整合成功。
[0226] 選2株整合成功的菌株送去測(cè)序，測(cè)序引物為kan-F/aroG-552-R，將測(cè)序正確的 菌株命名為Phe003,為將aroG^S因替換Phe002菌株基因組中的aroG基因，且將人工調(diào) 控元件M1-12替換Phe002菌株基因組中的aroG基因的原始調(diào)控元件。
[0227] 三、兩步同源重組法調(diào)控ar〇Gfbl基因
[0228] 1、兩步同源重組所需片段I和片段II的PCR擴(kuò)增
[0229] 擴(kuò)增片段I引物如下：
[0230] aroG-cat-up ：5, -ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGTGTG ACGGAAGATCACTTCGCA-3 ?
[0231] aroG-cat-down ：5, -GGAAGTAACTCTTTGATTTCTTTGATGCGTAAATCGTCGTTCTGATAATTCA TTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG-3 ?
[0232] 上述引物下劃線部分分別為與aroG基因上下游同源的序列。
[0233] 以aroG-cat-up/aroG-cat-down為引物，以質(zhì)粒pXZ-CS為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得 到大小為2530bp的PCR產(chǎn)物，為含有與aroG基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇 (序列8)和與aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段（片段I)。將得到的PCR產(chǎn) 物用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收。并用Dpnl酶處理，再清潔、回收， 用于第一步同源重組。
[0234] 擴(kuò)增片段II引物如下：
[0235] aroG-p-up ：5, -ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGTTATCT CTGGCGGTGTTGAC-3'
[0236] aroG-RBS-down ：5, -GGAAGTAACTCTTTGATTTCTTTGATGCGTAAATCGTCGTTCTGATAATTCA TAGCTGTTTCCTGGTT-3 ,
[0237] 上述引物下劃線部分分別為與aroG基因上下游同源的序列。
[0238] 以aroG-p-up/aroG-RBS-down為引物，以M1-46菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。得到大小為203bp擴(kuò)增產(chǎn)物，為含有與aroG基因上游同源的50bp序列、人工調(diào) 控元件Ml-46(序列9)和與aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段（片段II)。 將得到的PCR產(chǎn)物用SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行清潔、回收，用于第二步同源重 組。
[0239] 2、第一步同源重組
[0240] 將上述1得到的片段I電轉(zhuǎn)化到含有pKD46的Phe003菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。取 500 y L轉(zhuǎn)化的菌液，涂布在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng) 性克隆分別在含有氯霉素氨芐的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上篩選。得到在含有 卡那霉素的LB平板上不長(zhǎng)，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上長(zhǎng)的克隆，使用引物 cat-up/aroG-552-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其中上游引物為：
[0241] cat-up :5' -ATGAAACCGCTGATTGCATCTA-3'
[0242] PCR得到大小為993bp的條帶，說(shuō)明重組菌株的aroG基因ATG前已經(jīng)成功插入 catsacB基因，可以用于第二步同源重組，命名為Phe003-aroG_catsacB。
[0243] 3、第二步同源重組
[0244] 將上述1得到的片段II電轉(zhuǎn)化到含有pKD46的中間菌株P(guān)he003-aroG_catsacB 的感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化菌液轉(zhuǎn)入50mL無(wú)鹽LB+10%蔗糖培養(yǎng)基中，37°C、250rpm震蕩培 養(yǎng)24h。然后在無(wú)鹽LB+6%蔗糖平板上劃線，41°C過(guò)夜培養(yǎng)，去除pKD46質(zhì)粒。挑去單克隆 分別在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上篩選，得到在含氯霉素