一種豬肺炎支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測豬肺炎支原體的環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬支原體肺炎 (mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)，也稱豬氣喘病的一種重要的病原，由Goodwin (1964)首次從無細胞培養(yǎng)基中分離出，隨后上海農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所于1973年首 次分離到致病性毒株，該病原主要引起豬以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性接觸性呼吸道傳 染病。
[0003] Mhp可通過空氣傳染，很難隔離和阻斷其傳播途徑，造成豬氣喘病發(fā)病率高，流行 范圍廣，在世界各地廣泛傳播，以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低病死率為特點。 病豬長期生長發(fā)育不良，生長率和飼料轉化率降低，感染后引起豬免疫力降低，臨床上經常 與多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒等混合感染，是豬呼吸道 綜合癥（porcinechronicrespiratoryinfectiousdisease，PRDC)的一個最重要的病 原，對養(yǎng)豬業(yè)的危害非常大，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失。
[0004] 對豬肺炎支原體的準確、快速檢測，不僅有利于養(yǎng)殖場對豬喘氣病做出正確的處 理措施，而且有利于其他豬呼吸道疾病的防治。現有對豬肺炎支原體的病原檢測方法中， 病原分離是豬支原體肺炎確診的最準確的方法，但目前豬肺炎支原體的體外分離培養(yǎng)和鑒 定，難度大、靈敏度低、耗時、需要復雜的設備及培養(yǎng)條件，所以在發(fā)展中國家及我國臨床條 件有限的地區(qū)，建立一種簡單、快速的診斷方法就顯得尤為重要。聚合酶鏈式反應（PCR)法 等雖然特導性和敏感性都較高，但卻需要昂貴的PCR儀、電泳槽等精密儀器，不適用于基層 開展。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測豬肺炎支原體的方法，公 開一種快速、實時定量的檢測豬肺炎支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒。為實現本發(fā)明目的所 使用的技術方案為：一種豬肺炎支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、 2X反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和豬肺炎支原體DNA模板，所 述的LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)、內引物FIP(SEQID NO:3)與BIP(SEQIDNO:4)和環(huán)引物LF(SEQIDNO:5)與LB(SEQIDNO:6);其中引 物的序列分別為： F3 AGGCAGCAACTTCAACAA B3 ATCAGATCCAGTAATTAGTCGA FIPGGCGCTGGACTTAAATTAGCTCAAAAAACCAGGATGCACAA BIPATTGCCCCTGAAAATGGAAGTTCATAGGCAACAATCGGAAT LFGCTTGCTGAGTGAGTCAGTTAT LBAGTTGGAACTGCTGTTAATACA 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 所述的豬肺炎支原體DNA模板，是使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取的豬肺炎 支原體培養(yǎng)物或疑似感染豬肺炎支原體的臨床病變肺組織的基因組DNA。
[0007] 所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0008] 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL25-60mM、KCL15-40mM、MgS04 10-20mM、 (NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0.3-0.8%、Betaine1.5-4M和dNTPs2.5-5mM，其配制方 法在pH為8. 5左右條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0009] -種豬肺炎支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒的應用，用于檢測疑似豬支原體肺炎或 檢測疑似感染豬肺炎支原體的臨床病變肺組織是否存在豬肺炎支原體，具體檢測步驟包 括： (1) LAMP引物的設計與合成 (2) 豬肺炎支原體DNA模板的提取 (3) LAMP反應體系建立 (4) LAMP檢測方法。
[0010] 所述的LAMP反應體系建立以25μL計， 2X反應緩沖液 12. 5yL Bst DNA聚合酶 1μL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol LF 20 pmol LB 20 pmol 豬肺炎支原體DNA 2 μL 超純水 補足25μL。
[0011] 所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。
[0012] 所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監(jiān)控。
[0013] 本發(fā)明的實質性特點和顯著的進步是： 1)特異性強 本發(fā)明的LAMP方法特異性檢測出豬肺炎支原體，所檢測的陰性對照支原體、細菌和水 對照均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。
[0014] 2)靈敏度高 普通PCR檢測方法的靈敏度為1. 50X10-5ng/μL，而使用本發(fā)明的LAMP檢測方法，檢 測限約為1.50X10-7ng/μL，是普通PCR的100倍。
[0015] 3)迅速獲得結果 普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數建立的LAMP反應方法在 反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線顯像分析來判讀結果，從基因組DNA提取到獲 取試驗結果，需要4-5小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應在13分鐘左右出現擴 增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判讀方式簡便，在可見光下將陽、陰性管進行比較，通過 肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性反應管透明；短暫離心后，陽性反應管底部有明 顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽性反應管在紫 外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實驗結果。不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像 或者開蓋加入熒光染料進行來判讀結果，從基因組DNA提取到獲得最終結果可在2-3小時 內完成。
[0016] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在反 應前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋，有效的避免污染試 驗環(huán)境。此外，本發(fā)明的LAMP檢測方法在結果判讀上，直接通過濁度儀檢測反應管的濁度 值來判定結果，可不進行熒光染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，不需要 開蓋，能有效避免污染。
[0017] 5)可實時定量 本發(fā)明利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來實時分析LAMP反應的結果，不 同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求 出各時間的豬肺炎支原體拷貝數，達到定量檢測產物的目的。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明豬肺炎支原體LAMP檢測方法的特異性結果；其中1 :豬肺炎支原體； 2 :綿羊肺炎支原體；3 :中度無膽留原體；4 :絲狀支原體；5 :大腸桿菌；6 :2型鏈球菌；7 :沙 門氏菌；8 :波氏桿菌；9 :空白對照(水)。結果顯示豬肺炎支原體反應管出現濁度的上升曲 線，為陽性結果，3株對照支原體反應管、4株對照細菌反應管和水對照反應管均無擴增，為 陰性結果。
[0019] 圖2和圖3是分別使用本發(fā)明LAMP方法和普通PCR方法進行的豬肺炎支原體敏感 性檢測的結果，其中M:Mark;1 :1· 50X10ng/yL;2 :1· 50ng/yL;3 :1. 50X10-lng/yL; 4 ：1. 50X10-2ng/yL； 5 : 1· 50X10_3ng/μL;6 : 1· 50X10_4ng/μL;7 : 1· 50X10_5ng/ μL;8 : 1· 50X10-6ng/μL;9 : 1· 50X10-7ng/μL; 10:water。豬肺炎支原體原始DNA的起始濃度為1. 50X10ng/μL，經10倍倍比連續(xù) 稀釋后，進行LAMP和PCR擴增，結果顯示本發(fā)明的LAMP法檢測限約為1. 50X10-7ng/μL， 而普通PCR方法檢測限約為1. 50Χ10-5ng/μL。
[0020] 圖4是本發(fā)明豬肺炎支原體LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結果：左管為以豬肺 炎支原體基因組DNA為模板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性 結果。
[0021 ]圖5是本發(fā)明豬肺炎支原體LAMP檢測方法定量標準曲線；利用不同的標準樣品的 濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的豬肺 炎支原體拷貝數。
【具體實施方式】
[0022] 1、材料的準備 豬肺炎支原體、綿羊肺炎支原體、中度無膽留原體、絲狀支原體、大腸桿菌、鏈球菌2 型、沙門氏菌和波氏桿菌，為廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。LAMPDNA擴增試劑盒購自北 京藍譜生物科技有限公司，貨號LMP204 ;細菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀生物科 技有限公司，貨號CW0552。
[0023] 2、LAMP引物的設計與合成 根據GenBank中的豬肺炎支原體P46基因序列，利用LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorerV4軟件設計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，FIP、BIP為內引物， 其中F3、B3為豬肺炎支原體PCR檢測引物，其中 F3 AGGCAGCAACTTCAACAA B3 ATCAGATCCAGTAATTAGTCGA FIPGGCGCTGGACTTAAATTAGCTCAAAAAACCAGGATGCACAA BIPATTGCCCCTGAAAATGGAAGTTCATAGGCAACAA