一種人肺炎支原體培養(yǎng)基及其診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種支原體培養(yǎng)基及其診斷試劑盒，尤其是涉及一種人肺炎支原體培 養(yǎng)基及其診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 被發(fā)現(xiàn)近百年的支原體是一類無細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，介于病毒與細(xì) 菌之間。目前已分離到150多種。與人類疾病有關(guān)的主要是肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, Mp)、解脈脈原體（Ureaplasma urealyticum,簡稱 Uu)及人型支原體 (Mycoplasma hominis,簡稱Mh)等。Mp早就證明是非典型性肺炎的重要病原菌，診斷難度 大，易引起并發(fā)感染，死亡率較高。2003年非典流行后，社區(qū)性呼吸道感染流行時(shí)，更加引起 醫(yī)療界的關(guān)注。
[0003] Mp可進(jìn)入血液，并可在呼吸系統(tǒng)W外的部位增殖，引起肺外并發(fā)癥。并發(fā)癥多出現(xiàn) 于呼吸道癥狀后3~30山常累及也血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚及肝腎器官。 隨著對(duì)病原的不斷認(rèn)識(shí)和臨床資料的不斷積累，肺外感染的表現(xiàn)也越來越引起臨床醫(yī)生的 關(guān)注和重視。
[0004] Mp的基因組小，僅是大腸桿菌的1/5~1/4,細(xì)胞?。ㄐ∮趌OOnm)且多形，有液體 運(yùn)動(dòng)性；菌體集落小于l-2mm，肉眼難見，通常借助40-100倍顯微鏡檢查計(jì)數(shù)。Mp生長繁殖 的生理生化條件相對(duì)簡單而自然地依附宿主組織細(xì)胞并有胞內(nèi)生存的特點(diǎn)，難于人工培養(yǎng) 且生長緩慢；與其他支原體的種間差異大，各有特點(diǎn)可用于分離、鑒別。此等造成臨床診斷、 治療的困難，同時(shí)是研發(fā)技術(shù)的訣菌伏點(diǎn)。
[0005] 國外Mp的培養(yǎng)分離有商品化的Difco、化oid等公司干燥基礎(chǔ)基，法國生物梅里埃 的成品培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)常用試管、青霉素安培瓶，固體培養(yǎng)慣用圓形培養(yǎng)皿等，還有雙相 培養(yǎng)的，但是，均對(duì)習(xí)濕需0)2的支原體的培養(yǎng)都不如人意。
[0006] 商品液體培養(yǎng)基培養(yǎng)于37C -38C，4-7天，有的要10天后觀察出報(bào)告。都W變色 判斷結(jié)果，有的陽性率低，有的出現(xiàn)假陽性。
[0007] 我國對(duì)支原體基礎(chǔ)及醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷的研究起步晚，多模仿國外方法，存在著臨床 培養(yǎng)陽性率低、易污染雜菌、出現(xiàn)假陽性等諸多問題，不能滿足臨床診斷治療的需求；而且 國內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室用于支原體的分離培養(yǎng)基，多數(shù)進(jìn)口，價(jià)格昂貴；有的自制，質(zhì)量不穩(wěn)定，衛(wèi)生 管理部口已立法管理，促進(jìn)研發(fā)創(chuàng)新產(chǎn)品。
[0008] Mp常用培養(yǎng)基為PPL0培養(yǎng)基，很多公司都有出售，但血清（常用馬血清或豬血 清）和抗生素自己添加，在液體培養(yǎng)基中通常要加入酷紅做指示劑，當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)?黃色時(shí)，即可判定Mp的生長。實(shí)際上，支原體的分離生長難，盲傳幾次，液體培養(yǎng)基變黃后， 在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型菌落，才獲得純分離的菌株。
[0009] 微生物學(xué)發(fā)展中，Mp曾稱為"難養(yǎng)菌"，不但對(duì)營養(yǎng)要求嚴(yán)格，而且對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中的 濕度、溫度、氧分壓及基質(zhì)抑等條件也很特殊。Mp生長繁殖的最適抑是7. 4-7. 6,60%~ 80 %濕度環(huán)境。
[0010] 傳統(tǒng)的難養(yǎng)菌的分離培養(yǎng)及鑒定的方法，復(fù)雜、繁瑣、易于污染、成本昂貴。本發(fā)明 是從大量實(shí)踐中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)而設(shè)計(jì)的，試制品能夠滿足臨床診斷的特異性、可靠性要求，同時(shí) 達(dá)到快速、安全、環(huán)保、資源節(jié)約。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種人肺炎支原體 培養(yǎng)基及其診斷試劑盒。
[0012] 本發(fā)明創(chuàng)新設(shè)計(jì)新的Mp培養(yǎng)基配方，適用于Mp感染引起非典型性肺炎病原體的 分離培養(yǎng)及鑒別，而獲取病原菌的臨床診斷信息。
[0013] 本發(fā)明的目的可W通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0014] 一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，包括TSB培養(yǎng)基與添加劑，所述的添加劑包括牛血 清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙麗酸軸W及谷氨醜胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體培養(yǎng)基 總含量的5-15% (體積分?jǐn)?shù)），W人肺炎支原體培養(yǎng)基總體積計(jì)，所述的牛血清的含量為 lOOml/L，所述的禽蛋黃提取物含量為lO-lOOml/L，所述的丙麗酸軸含量為0. 2-1. Og/L，所 述的谷氨醜胺含量為0. 3-1. Og/L。
[0015] 作為優(yōu)選，每1000ml人肺炎支原體培養(yǎng)基還含有W下抑菌劑；氨予青霉素1百萬 單位，納他霉素50mg。
[0016] 每lOOOmlTSB培養(yǎng)基含有W下成分：
[0017]
[0018]
[0019] 所述的禽蛋黃提取物中含有維生素A及有機(jī)砸，所述的維生素A含量為2~lOu/ ml,所述的有機(jī)砸含量為0. 2~2.化pm。
[0020] 作為優(yōu)選，所述的禽蛋黃提取物還含有微量的不飽和脂肪酸類與磯脂類物質(zhì)，W 及10-25v/v%的己醇。
[0021] 所述的禽蛋黃提取物制備方法如下：
[0022] (1)取新鮮富砸雞蛋置入7〇v/v%己醇溶液中浸泡30分鐘；
[0023] (2)在超凈工作臺(tái)上無菌操作取蛋黃，將蛋黃置于無菌燒瓶中；
[0024] 做向含有蛋黃的無菌燒瓶中W 1 ;2重量比例，加入90v/v%己醇，充分?jǐn)埌?、?勻，封閉瓶口后置于4C~8C下，保存20-2化；
[0025] (4)用1N化細(xì)調(diào)節(jié)步驟（3)處理后溶液的抑至7. 0~8. 0,并6000RPM離也，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，包括TSB培養(yǎng)基與添加劑，所述的添加劑包 括牛血清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙酮酸鈉以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體 培養(yǎng)基總含量的5-15% (體積分?jǐn)?shù)），以人肺炎支原體培養(yǎng)基總體積計(jì)，所述的牛血清的含 量為100ml/L，所述的禽蛋黃提取物含量為10-100ml/L，所述的丙酮酸鈉含量為0. 2-1. Og/ L，所述的谷氨酰胺含量為0. 3-1. Og/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，每1000ml人肺炎支 原體培養(yǎng)基還含有以下抑菌劑：氨芐青霉素1百萬單位，納他霉素50mg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，每1000 mlTSB培養(yǎng)基 含有以下成分： 胰蛋白胨 17g; 大豆蛋白胨 3g; 氯化鈉 5g； 磷酸二氫鉀 2.5g; 葡萄糖 2.5g; 0.4% 酚紅 10ml; 純水加入定容至1000ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，所述的禽蛋黃提 取物中含有維生素 A及有機(jī)硒，所述的維生素 A含量為2~10u/ml，所述的有機(jī)硒含量為 0· 2 ~2. Oppm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，所述的禽蛋黃提取 物還含有微量的不飽和脂肪酸類與磷脂類物質(zhì)，以及l(fā)〇-25v/ v%的乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，所述的禽 蛋黃提取物制備方法如下： (1) 取新鮮富硒雞蛋置入70v/v%乙醇溶液中浸泡30分鐘； (2) 在超凈工作臺(tái)上無菌操作取蛋黃，將蛋黃置于無菌燒瓶中； (3) 向含有蛋黃的無菌燒瓶中以1 :2重量比例，加入90v/v%乙醇，充分?jǐn)嚢琛⒒靹?，?閉瓶口后置于4°C~8°C下，保存20-24h ; (4) 用IN NaoH調(diào)節(jié)步驟（3)處理后溶液的pH至7. 0~8. 0,并6000RPM離心，取上清 液，將上清液以0. 45 μ m濾膜無菌過濾后，濾液即為禽蛋黃提取物，將濾液無菌分裝后，備 用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于，所述的人肺炎支原 體培養(yǎng)基通過稀酸稀堿調(diào)節(jié)酸堿度，使培養(yǎng)基滅菌后pH為7. 4-7. 6。
8. -種包括權(quán)利要求1所述的人肺炎支原體培養(yǎng)基的診斷試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人肺炎支原體培養(yǎng)基及其診斷試劑盒，人肺炎支原體培養(yǎng)基包括TSB培養(yǎng)基與添加劑，所述的添加劑包括牛血清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙酮酸鈉以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體培養(yǎng)基總含量的5-15％(體積分?jǐn)?shù))，以人肺炎支原體培養(yǎng)基總體積計(jì)，所述的禽蛋黃提取物含量為10-100ml/L，所述的丙酮酸鈉含量為0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量為0.3-1.0g/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基在大量實(shí)踐基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)用創(chuàng)新設(shè)計(jì)，符合需要，確保臨床Mp感染診斷的特異性、可靠性，同時(shí)體現(xiàn)使用方便、快速安全、環(huán)保及資源節(jié)約的要求。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-35, C12N1-20
【公開號(hào)】CN104673718
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510075107
【發(fā)明人】文鳳岐, 武濟(jì)民, 孫亞洲, 肖家祁
【申請(qǐng)人】眾愛生河北生物科技有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日