鈣離子形狀記憶水凝膠及其在人類間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種具備形狀記憶功能并可用于控制干細(xì)胞異向分化的高強度水凝 膠的制備，具體為一種丙締膳-丙締酸共聚物（PAN-CO-PAA)水凝膠的制備方法和應(yīng)用，該 水凝膠具有多重形狀記憶效應(yīng)，并可W獨特地用來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化行為。
【背景技術(shù)】
[0002] 形狀記憶水凝膠是形狀記憶高分子中的一類，然而到目前為止，除了早期報道的 含有長烷基側(cè)鏈的聚己締醇和丙締酸醋共聚物水凝膠的研究，其他具有形狀記憶效應(yīng)的水 凝膠卻鮮有報導(dǎo)。近期有文獻(xiàn)報道，一種含有膠原末端的生物高分子水凝膠能夠通過鏈端 的纏結(jié)形成=重螺旋節(jié)點，進(jìn)而使臨時形狀得W固定。然而，由于該一凝膠極差的力學(xué)性 能（彈性模量為102-104Pa)在很大程度上限制了它的實際應(yīng)用（Inomata K. ,Ter址ama T. , Sekoguchi R. , et al. , Shape memory properties of polypeptide hydrogels having hy化ophobic a化side chains, Polymer, 2012, 53:3281-3286)。文獻(xiàn)報道典型水凝膠的 斷裂能在10-1-100J/m2。由于其高含水量導(dǎo)致的較差的機(jī)械性能，W及缺乏較強的分子間 的相互作用，是限制形狀記憶水凝膠發(fā)展的兩個重要瓶頸。
[0003] 相比于形狀記憶高分子材料，由于水凝膠結(jié)構(gòu)中含有大量水分子而造成的增塑作 用和水合作用，使得水凝膠的Tg失去了原本的意義。典型的形狀記憶水凝膠多為通過引入 烷基側(cè)鏈，經(jīng)由溫度誘導(dǎo)烷基側(cè)鏈排列的有序一無序轉(zhuǎn)變來實現(xiàn)形狀記憶，但長烷基鏈的 引入不可避免的會降低水凝膠的親水性。因此，采用另一種簡單有效的方法來實現(xiàn)水凝膠 的形狀記憶功能有重要的意義。近期，本課題組已經(jīng)利用膳基對鋒離子的響應(yīng)性成功實現(xiàn) 了水凝膠的形狀記憶效應(yīng)（Han Y.,Bai T., Liu Y.,et al., Zinc ion uniquely induced triple shape memory effect of dipole-dipole reinforced ultra-high strength hy化ogels. Macromolecular Rapid Communications, 2012, 33:225-231)，此水凝膠是由丙 締膳和親水性單體用一步法光引發(fā)聚合而成。該工作中利用膳基和鋒離子的絡(luò)合-解絡(luò)合 作用實現(xiàn)水凝膠的形狀記憶功能。雖然該項工作為形狀記憶水凝膠體系提供了新的機(jī)制， 但是高濃度的鋒離子卻限制了該水凝膠的應(yīng)用。
[0004] 在研究組織重建和細(xì)胞的健康自我平衡過程中，干細(xì)胞扮演者重要的角色。因此， 它們對自身的組織工程和再生醫(yī)學(xué)發(fā)揮著重要的驅(qū)動力作用。通常來說，所有干細(xì)胞都具 有自我再生和分化成不同類別細(xì)胞的功能。近期的研究結(jié)果表明影響干細(xì)胞分化行為的因 素可W分為化學(xué)因素和物理因素兩大類?；瘜W(xué)因素包括荷爾蒙，生長因子W及一些可W調(diào) 控干細(xì)胞生物活性的小分子物質(zhì)。物理因素包括細(xì)胞外基質(zhì)的硬度，孔隙大小W及表面的 幾何結(jié)構(gòu)等。進(jìn)一步的研究表明，干細(xì)胞可W通過感知周圍環(huán)境的機(jī)械性能來調(diào)整自身的 分化行為。然而，在一個具有復(fù)雜空間幾何結(jié)構(gòu)的組織工程支架中，分布在不同位置的干細(xì) 胞所能感知的環(huán)境的力是不同的，因此干細(xì)胞的分化行為還會隨生長位置的不同而各異， 而該一點在組織工程中常常是被忽略的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種W丙締膳為主體的水凝膠，具體為丙締膳和丙締酸共 聚物（PAN-CO-PAM-CO-PAMPS)，該共聚物除表現(xiàn)出水凝膠的固有特性，還具有很強的抗拉伸 和抗壓縮能力，巧離子刺激形狀記憶功能。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予W實現(xiàn)。
[0007] 巧離子形狀記憶水凝膠，由丙締膳、丙締酸和交聯(lián)劑通過自由基聚合共聚而成，所 述交聯(lián)劑采用分子鏈兩端帶有碳碳雙鍵的結(jié)構(gòu)。
[000引所述交聯(lián)劑為N，N'-雙（丙締酷）脫胺。
[0009] 制備上述巧離子形狀記憶水凝膠的方法，按照下述步驟進(jìn)行：
[0010] 將丙締膳、丙締酸、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在溶劑中，通過引發(fā)劑引發(fā)丙締膳、丙締 酸和交聯(lián)劑分子上的不飽和鍵，在絕氧的條件下通過自由基聚合反應(yīng)制備出具有巧離子形 狀記憶水凝膠，所述交聯(lián)劑采用分子鏈兩端帶有碳碳雙鍵、分子鏈中間為聚己二醇分子的 主鏈結(jié)構(gòu)。
[00川所述交聯(lián)劑為N，N' -雙（丙締酷）脫胺炬AC)。
[0012] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，W丙締膳和丙締酸作為共聚單體，W交聯(lián)劑交聯(lián)共聚單 體，交聯(lián)劑分子的分子鏈兩端帶有雙鍵、分子鏈中間為可生物降解的二硫鍵相連，采用熱源 或者光源使引發(fā)劑提供自由基，再由自由基引發(fā)丙締膳、丙締酸和交聯(lián)劑中的雙鍵，使=者 幾乎同時引發(fā)，發(fā)生聚合反應(yīng)，最終制備的水凝膠材料中，具有聚丙締膳、丙締酸和交聯(lián)劑 =種物質(zhì)的鏈段，其中丙締膳提供骨架中的剛性性能，丙締酸提供強吸水性和巧離子響應(yīng) 性，交聯(lián)劑中的二硫鍵提供生物可降解性，上述=部分協(xié)同作用，使整個水凝膠材料體現(xiàn)出 高強度和巧離子響應(yīng)的形狀記憶功能。
[0013] 利用引發(fā)劑提供的自由基引發(fā)丙締膳、丙締酸和交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)。其中引發(fā) 劑可W選擇高分子聚合領(lǐng)域中常用的熱引發(fā)劑，如偶氮二異了膳（ABIN)、過氧化苯甲酯 炬PO)，或者光引發(fā)劑，如1-[4-(2-哲己氧基）-亞苯基]-2-哲基-2'，2'-二甲基己 酬（Irgacure 2959)、甲基己締基酬、安息香，優(yōu)選1-[4-(2-哲己氧基）-亞苯基]-2-哲 基-2'，2'-二甲基己酬（Irgacure2959)。如果選擇熱引發(fā)劑，則需要首先利用惰性氣體 (如氮氣、氣氣或者氮氣）排除反應(yīng)體系中的氧，W避免其的阻聚作用，然后根據(jù)引發(fā)劑的 活性和用量，將反應(yīng)體系加熱到所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度之上并保持相當(dāng)長的時間，如1-化， W促使引發(fā)劑能夠長時間產(chǎn)生足夠多的自由基，引發(fā)反應(yīng)體系持續(xù)發(fā)生自由基聚合反應(yīng)， 最終制備本發(fā)明的水凝膠。如果選擇光引發(fā)劑，則可W選用透明密閉的反應(yīng)容器，在紫外光 照射的條件下引發(fā)自由基聚合，由于光引發(fā)效率高于熱引發(fā)，因根據(jù)所選引發(fā)劑的活性和 用量調(diào)整照射時間時，照射時間可短于熱引發(fā)的加熱時間，如20分鐘或者30min-lh。
[0014] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)丙締膳、丙締酸、選擇使用的引發(fā)劑、交聯(lián)劑的 溶解性，選擇能夠完全溶解上述四種物質(zhì)或者能夠與上述四種物質(zhì)完全互溶的溶劑，W混 合均勻反應(yīng)體系。由于丙締膳、丙締酸有極性，引發(fā)劑和交聯(lián)劑也要能夠溶解在極性溶劑 中，因此可選擇有機(jī)溶劑中的極性溶劑，如二甲基甲酯胺、二甲基己酷胺、四氨快喃、二甲基 亞諷，優(yōu)選二甲基亞諷。
[0015] 在制備方案中，單體丙締膳、丙締酸的質(zhì)量比為巧-9) : 1，優(yōu)選為7 : 1。交聯(lián)劑 質(zhì)量與兩種單體（丙締膳、丙締酸）的質(zhì)量和的比為1 ; (1-3)，優(yōu)選為1:2。引發(fā)劑的質(zhì)量 為單體與交聯(lián)劑總質(zhì)量的2-5%，優(yōu)選為3%。在反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)容器中取出共聚物，去 除未參加反應(yīng)的單體、引發(fā)劑、交聯(lián)劑和溶劑后，浸泡在水中直至達(dá)到溶脹平衡，優(yōu)選浸泡7 天，每隔1化更換一次水。
[0016] 上述巧離子形狀記憶水凝膠在人類間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的應(yīng)用，為觀察人類間充 質(zhì)干細(xì)胞分化在不同的生長位置表現(xiàn)出異質(zhì)性的分化行為提供了載體。
[0017] 本發(fā)明提供的一種高強度PAN-co-PAAc水凝膠是W丙締膳和丙締酸為原料，在交 聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，實現(xiàn)將丙締膳的偶極增強和丙締酸的駿基絡(luò)合巧離子的特 性，具有很強的抗拉伸和抗壓縮能力的同時能夠響應(yīng)巧離子刺激實現(xiàn)形狀記憶。制備方法 簡單，產(chǎn)品易于長期保存和長途運輸。
[001引本發(fā)明提供了高強度形狀記憶PAN-C0-PAA水凝膠。該水凝膠形狀記憶過程可W 被兩種二價離子所控制，多重形狀記憶效應(yīng)可W通過引入和解離偶極作用和離子絡(luò)合來實 現(xiàn)。并且該形狀記憶效應(yīng)可W獨特地用來調(diào)控干細(xì)胞的分化行為。本發(fā)明制備方法簡單， 合成條件溫和。在該水凝膠體系中，丙締膳的膳基之間強烈的偶極作用使得凝膠本體的力 學(xué)性能得到很大的改善，并且膳基與鋒離子之間完全可逆的絡(luò)合-解絡(luò)合作用是水凝膠實 現(xiàn)形狀記憶的重要機(jī)制之一。丙締酸的存在不僅能夠在很大程度上提高水凝膠的含水量， 并且駿基與巧離子之間的絡(luò)合與解絡(luò)合作用是該水凝膠實現(xiàn)多重形狀記憶效應(yīng)的另一重 要機(jī)制。交聯(lián)劑BAC中的雙硫鍵可W被1,4-二硫蘇糖醇值TT)還原，從而使該水凝膠具備 降解功能。上述=部分協(xié)同作用，使整個水凝膠材料體現(xiàn)出高力學(xué)強度，可降解，良好的生 物相容性，W及多重形狀記憶功能。
[0019] 丙締膳基水凝膠與微量金屬離子的絡(luò)合-解絡(luò)合策略提供了一種實現(xiàn)形狀記憶 凝膠的簡單且普遍的方法，水凝膠是作為細(xì)胞支架的首選材料。通過控制形狀記憶過程，干 細(xì)胞可W被接種到立方盒的六個表面上。干細(xì)胞在不同的生長位