一種用于防治葡萄霜霉病的巨大芽孢桿菌及其懸浮劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌 及其懸浮劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄霜霉病是一種世界性病害，是葡萄最主要的病害之一，一般在5~6月開始發(fā) 生，8~9月進(jìn)入發(fā)病盛期，主要為害葉片，嚴(yán)重影響葉片的光合作用，嚴(yán)重時常造成葉片焦 枯早落，影響果實品質(zhì)及產(chǎn)量，致減產(chǎn)30 %~50 %，重者達(dá)80 % W上。該病菌屬鞭毛菌亞 n，菌絲體在寄主細(xì)胞間蔓延，W球狀吸器伸入寄主細(xì)胞吸收養(yǎng)料。葡萄霜霉病主要危害植 物的葉片、新梢、卷須等組織；發(fā)病嚴(yán)重時，果實產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣。防治葡萄霜霉病的方 法有抗病育種，化學(xué)防治和生態(tài)防治（控制溫濕）等。由于抗病育種周期長且抗性易喪失； 化學(xué)防治存在易產(chǎn)生抗藥性和對人、環(huán)境污染的問題；而生態(tài)防治的控制溫濕需要葡萄秩 苗苗齡、長勢和天氣情況都合適的情況下才能進(jìn)行，應(yīng)用受條件限制。近年來，生物防治技 術(shù)由于具有防止對象針對性強(qiáng)，防效高；對人、畜安全，沒有環(huán)境污染等優(yōu)點而日益受到重 視。
[0003] 生物防治葡萄霜霉病的方法主要包括植物提取物防治、植物抗病性誘導(dǎo)和利用生 防菌。目前，已有十余種植物提取物能夠有效防治葡萄霜霉病。但是，植物提取物的提取過 程繁瑣、生產(chǎn)成本高和人工合成單一物質(zhì)的使用后病原菌易產(chǎn)生抗藥性等缺點，使得該方 法難于應(yīng)用。因此，利用生防菌防治葡萄霜霉病可彌補(bǔ)W上不足。
[0004] 目前，利用生防菌防治葡萄霜霉病研究中，已有利用細(xì)菌中的蒼白桿菌、枯草芽抱 桿菌、短小芽抱桿菌、W及放線菌中的利迪鏈霉菌等括抗微生物的報道（臧超群，趙奎華， 等。生防細(xì)菌SY286的篩選及其對葡萄霜霉病的防治效果研究[J]。中國生物防治學(xué)報， 2014,30(3) ;402-407)。未見利用巨大芽抱桿菌防治該病的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種用于防治葡萄霜霉病的巨大 芽抱桿菌，用于葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌炬acillus megaterium)的菌株BMJBN02,已 于2015年1月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為 CGMCC NO. 10478。本發(fā)明還公開了利用上述菌株生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法。本發(fā)明 菌株BMJBN02對葡萄霜霉病特異性強(qiáng)，且防效高，平均防效在70% W上。
[0006] 本發(fā)明的一種用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌及其懸浮劑技術(shù)方案為，一種 用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌，于山東省壽光韭菜田±壤中分離所得，巨大芽抱桿 菌Bacillus megaterium BMJBN02,于2015年1月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編；100101，保藏編號 為CGMCC NO. 10478,菌種的拉了文名稱是Bacillus megaterium。具有使霜霉病抱子囊變 形的作用。
[0007] 該菌為革蘭氏陽性菌，桿狀，末端圓，呈長鏈狀排列。。能運動。芽抱楠圓形，中生 或次生?？梢夯髂z、腺化牛奶、水解淀粉、使霜霉病抱子囊變形。
[000引所述的一種用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌的懸浮劑，將巨大芽抱桿菌 Bacillus megaterium BMJBN02發(fā)酵得到的發(fā)酵液與表面活性劑、防腐劑、懸浮助劑和增稠 劑混合制備懸浮劑。
[0009] 所述的一種用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱桿菌的懸浮劑，由W下步驟制得：
[0010] (1)種子液的獲得：將生防菌BMJBN02接種到液體LB培養(yǎng)基，30°C，20化pm振蕩培 養(yǎng)12~18小時，取樣測定600nm處的OD值，測定過程中W未接種的液體LB培養(yǎng)基調(diào)零；
[0011] (2)發(fā)酵液的獲得；當(dāng)步驟（1)中OD值為0. 5~0. 8時，將種子液按1:150體積 比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐培養(yǎng)得到發(fā)酵液；
[0012] (3)巨大芽抱桿菌BMJBN02懸浮劑的制備：將制備的BMJBN02菌的發(fā)酵液與表面 活性劑、防腐劑、懸浮助劑和增稠劑混合制備懸浮劑。
[001引 步驟（1)中液體LB培養(yǎng)基配方；1%化Cl，l%蛋白腺，0.5%酵母粉，抑7.0~7. 5。 [0014] 步驟（2)中培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速22化/min,發(fā)酵時間為36~4她， 發(fā)酵液PH維持在7. 0,溶氧量30%，通氣量7~9mV小時，罐壓0. 05~0.化Pa，產(chǎn)抱率為 88 %，活菌計數(shù)5. 33 X 10化即? m。。
[00巧]步驟似中發(fā)酵培養(yǎng)基配方；玉米粉2%，豆稍粉1%，酵母粉0.3%，CaCl2〇. 1%， M拆〇4 " 7H 2〇 0. 05 %，K2HPO4 " 3H 2〇 0. 3 %，KH2PO4O. 2 %，pH7. 0 ~7. 5。
[0016] 步驟做中懸浮助劑是硫酸錠，防腐劑是甘氨酸，表面活性劑是有機(jī)娃抓-3077， 增稠劑是黃原膠。
[0017] 步驟做中，在BMJBN02菌的發(fā)酵液中，按質(zhì)量百分比加入硫酸錠6%~8%，甘氨 酸2%~5%，BD-30770. 05%~0. 1%，黃原膠0. 2%~0. 3%制得，所得懸浮劑中BMJBN02 活菌計數(shù)5X 109c化? ml/i，W上各組份的用量均W BMJBN02菌的發(fā)酵液的質(zhì)量為基數(shù)。
[001引步驟（3)中，先將硫酸錠攬拌下加入BMJBN02菌的發(fā)酵液中，待硫酸錠全部溶解 后，在攬拌下依次加入防腐劑甘氨酸、表面活性劑BD-3077、增稠劑黃原膠，攬拌均勻即可。。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明是專口針對危害葡萄葉部和果實的霜霉病的生防制 劑。由于是生物制劑，完全不存在因化學(xué)制劑使用帶來的一系列問題，因此有利于溫室大 棚蔬菜的無公害生產(chǎn)，不但為農(nóng)民節(jié)省了開支，并且提高了蔬菜生產(chǎn)的質(zhì)量，有利于出口創(chuàng) 收。
[0020] 溫室實驗表明；該菌制劑能夠顯著降低葡萄霜霉病的發(fā)生。該菌劑可W稀釋500 倍在葡萄旺長期對其噴霧，對葡萄霜霉病的抑制率可達(dá)到70% W上。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)選表面活性劑抓-3077。在實際應(yīng)用中抓-3077的主鏈?zhǔn)秩犴?，其分?間的作用力比碳氨化合物要弱得多，即與同分子量的碳氨化合物相比，其粘度低，表面張力 弱，表面能小，成膜能力強(qiáng)。因此，BD-3077的低表面張力和低表面能為其帶來疏水、消泡、 泡沫穩(wěn)定、防粘、潤滑、上光等各項優(yōu)異性能；同時，BD-3077還兼具了表面活性劑和增效劑 的作用。
【附圖說明】：
[0022] 圖1所示為實施例3中抑制病原抱子囊萌發(fā)試驗水對照實驗；
[0023] 圖2所示為實施例3中抑制病原抱子囊萌發(fā)試驗波爾多液處理實驗；
[0024] 圖3所示為實施例3中抑制病原抱子囊萌發(fā)試驗本發(fā)明的巨大芽抱桿菌BMJBN02 處理實驗。
【具體實施方式】：
[0025] 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本 發(fā)明并不局限于此。
[0026] 實施例1 [0027] 菌株分離及鑒定
[002引 1、本發(fā)明設(shè)及一種防治葡萄霜霉病的生防菌株BMJBN02,該菌株分離于山東省壽 光市韭菜田±壤。菌種保藏號為CGMCCNO. 10478
[0029] 2、菌株鑒定
[0030] 采用采用生理生化特征測定和leSrDNA序列比對分析結(jié)合的方法將該菌株鑒定 為巨大芽抱桿菌炬acillus thuringiensis)，命名為BMJBN02。同時，將分離純化的單菌 落同時進(jìn)行V. P試驗、菌膜形成試驗、卵