一種源于象草的巨大芽孢桿菌及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種源于象草的巨大芽孢桿菌及其用途，屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的興起，象草schum.)及雜 交狼尾草因其生物量大，再生能力強，纖維素、半纖維素含量高，生態(tài)適應(yīng)性強等特性，發(fā)展 為一種新型的能源植物。我國具有沿海灘涂、鹽堿地、荒地、貧瘠地等大面積的宜能邊際性 土地，目前生物質(zhì)生產(chǎn)潛力超過2億噸標(biāo)準(zhǔn)煤。在宜能邊際性土地種植象草、雜交狼尾草等 能源草，開發(fā)生物質(zhì)能源，符合我國"不與糧爭地，不與人爭糧"的能源發(fā)展目標(biāo)。但是這些 區(qū)域生產(chǎn)條件較差，缺乏灌溉保障，鹽堿危害嚴(yán)重，嚴(yán)重影響象草、雜交狼尾草等能源草的 生物質(zhì)產(chǎn)量。
[0003]植物促生內(nèi)生菌（Plant Growth-Promoting bacteria endophyte, PGPE)是指 一類能夠定殖在植物體內(nèi)，并與植物體形成特異的共生關(guān)系，并因此對雙方都有益處的細 菌。植物促生內(nèi)生菌可以通過固氮作用、分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、合成鐵載體及抑制一些 疾病的發(fā)生等方式促進植物的生長，此外，它們還具有促進土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)、調(diào)節(jié)土 壤結(jié)構(gòu)、對污染的土壤進行生物修復(fù)等作用。研宄與開發(fā)優(yōu)良高效的植物促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR)生物肥料，對提高土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率、 減少農(nóng)藥和化肥的施用、促進植物的生長發(fā)育、增強植物對逆境的適應(yīng)性及耐受性受有重 要作用。
[0004] 所以，研宄與開發(fā)優(yōu)良高效的象草促生菌生物肥料，對增強象草、雜交狼尾草的 抗性，促進植株生長發(fā)育，提高其在沿海灘涂、鹽堿地等邊際性土地產(chǎn)量有重要意義。但 目前促生長植物內(nèi)生細菌主要是來自水稻、玉米、小麥、甘庶、蘋果、柑橘、高叢藍莓、桑葚、 杏，還沒有來源于象草的促生長內(nèi)生菌的報道（（1) Kloepper, J.W. 1994. Plant growth promoting bacteria (other systems). In: Okon, J. (Ed.), Azospirillum/Plant Association. CRC Press, Boca Raton, pp. 137 - 154. ； (2) De Silva, A. , Petterson, K. , Rothrock, C. , Moore, J. Growth promotion of high bush blue berry by fungal and bacterial inoculants. 2000.HortScience35, 1228 - 1230. ； (3) Sudhakar, P., Chattopadhyay, G. N. , Gangwar, S. K. , Ghosh, J. K. Effect of foliar application of Azotobacter, Azospirillum and Beijerinckia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba), 2000,J.Agric.Sci.134, 227 - 234. ； (4) Esitken, A., Karlidag, H. , Ercisli, S. , Sahin, F. Effects of foliar application ofBacillus substilis0su-142 on the yield, growth and control of shot-hole disease (Coryneum blight) of apricot, 2002,Gartenbauwissenschaft67, 139 - 142 ； (5) Esitken, A. , Karlidag, H. , Ercisli, S. , Turan, M. , Sahin, F. The effect of spraying a growth promoting bacterium on the yield, growth and nutrient element composition of leaves of apricot (Prunus armeniaca L. cv. Hacihaliloglu), 2003, Tfes. 54，377 - 380.)。本發(fā)明提供的巨大芽孢桿菌pp02,是從象草中篩 選的優(yōu)良促生內(nèi)生菌菌株，能更有效地增強雜交狼尾草的耐鹽能力，顯著提高雜交狼尾草 苗期的產(chǎn)量，對其在邊際性土地的種植有重要應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種象草巨大芽孢桿菌，該菌株具有產(chǎn)鐵載體、固氮、產(chǎn) IAA的特性，IAA產(chǎn)量達10. 57 y g/mL，且在植物根部定殖能力強，耐鹽能力強，在5% NaCl (50g/L)培養(yǎng)基中能生長，是一種優(yōu)良的植物促生內(nèi)生菌菌株。能促進鹽脅迫下的雜交狼尾 草苗的生長，對雜交狼尾草作為能源草在鹽堿性邊際土地上的推廣種植有重要意義。
[0006]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是： 本發(fā)明提供一種象草內(nèi)生菌，該菌是從象草植株中分離到的一株內(nèi)生菌，經(jīng)傳統(tǒng)方法 及分子鑒定表明它屬于巨大芽孢桿菌，命名為巨大芽孢桿菌PP〇2 PP〇2 )， 已于2014年7月4號在中國微生物保藏中心保藏，保藏號CGMCC 9415,保藏地址：中國北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所。
[0007] 本發(fā)明的象草內(nèi)生菌巨大芽孢桿菌pp02,具有如下生物學(xué)特征： 1. 菌落形態(tài)特征：在LB固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落較大而且厚，呈圓形，白色不透 明，表面較干燥有褶皺，邊緣不整齊； 2. 菌體形態(tài)特征：桿狀，末端圓，單個或成對排列，0. 75~1 ymX2. 75~5 ym，革蘭氏陽 性； 3. 部分生理生化特征：可在LB培養(yǎng)基上良好生長，最適生長溫度28 °C，最適生長pH 7. 0 ； 4. 遺傳學(xué)特征：根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠，蔡妙英，科學(xué)出版社，2001)， 本發(fā)明的巨大芽孢桿菌CGMCC 9415形態(tài)特征與芽孢桿菌屬最接近，經(jīng)16S rRNA通 用引物27F和534R進行PCR擴增部分基因序列（496bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中 心（NCBI)的Genbank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登錄號為KM886123。該巨大芽孢桿菌CGMCC 9415 16S rDNA序列分析表明，與Genbank國際數(shù)據(jù)庫中記錄的最相似的菌株 艦DSM319 (NC014103. 1)的相似性為99%。因此，該該巨大芽孢桿菌CGMCC 9415 應(yīng)屬于巨大芽孢桿菌屬（ifeciBys
[0008]本發(fā)明的象草內(nèi)生菌巨大芽孢桿菌pp02,是按如下方法從象草中分離培養(yǎng)得到 的： (1) 取自江蘇省農(nóng)科院試驗田的象草蘇牧2號，取根部經(jīng)表面消毒殺滅供試材料表 面微生物，加適量石英砂研磨，加無菌水混勻，100 y L涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28°C，培養(yǎng) 48h； (2) 挑取單菌落在LB固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，直到得到純系菌株為止； (3) 將純系菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)18h，取菌液700 y L加入質(zhì)量濃度 為50%的甘油300 y L，混合后置于-70°C冰柜中冷凍保存； (4) 將所得的純系菌株，通過雜交狼尾草苗接種試驗驗證其促生長活性后，鑒定，并保 存菌種，其中一株分離純化所得的內(nèi)生細菌命名為PP〇2。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供該象草內(nèi)生菌巨大芽孢桿菌pp02的應(yīng)用。
[0010] 所述的內(nèi)生菌用于促進植物的生長，可以通過以下方法驗證： 將雜交狼尾草種子消毒，置于1/2 MS培養(yǎng)基，25°C，暗培養(yǎng)48小時催芽，將催芽后的 種子播種于裝滿蛭石的盆缽中，苗長至10天左右，用PP〇2發(fā)酵原液灌根，侵染3天后，開始 并每隔四天澆6mg/mL鹽水，20天后測量苗高并稱鮮重。
[0011] 所述的內(nèi)生菌能在植物體內(nèi)定殖，是按如下方法進行驗證： 取上述灌根侵染巨大芽孢桿菌PP〇2 3天的雜交狼尾草苗的根，經(jīng)表面消毒，石英砂研 磨，加無菌水混勻，100 y L涂布于LB固體培養(yǎng)基上，30°C，培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，并 隨機挑取3個單克隆，搖菌，經(jīng)16SrDNA測序?qū)赀M行分子鑒定，以未侵染的雜交狼尾草 苗根作為對照。結(jié)果表明，巨大芽孢桿菌PP〇2成功侵染到雜交狼尾草根內(nèi)，LB固體培養(yǎng)基 上觀察到菌落長出，測序結(jié)果也證明了其是巨大芽孢桿菌PP02。
[0012] 本發(fā)明對所述象草內(nèi)生巨大芽孢桿菌PP02,具有固氮、產(chǎn)鐵載體、分泌植吲哚乙酸 (IAA)等促生特性，其產(chǎn)IAA的量達10. 57 y g/mL ;侵染定殖能力強，接種試驗證明灌根處理 三天，該巨大芽孢桿菌pp〇2就能夠在植物體內(nèi)定殖，侵染效率為4. 9cfu/g植物根鮮重；耐 鹽能力強，在5%NaCl (50g/L)培