地-rev 通過PCR驗證獲得的3963bp DM片段；和
[0031] C為去掉kan基因后，用引物化地-For和化地-rev通過PCR驗證獲得的 2583bpDNA 片段。
【具體實施方式】
[0032] W下結(jié)合附圖通過具體實施例來進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理 解，W下具體實施例僅用于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限制。
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] W下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實施例中所用的技術(shù) 手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可參見《分子克隆實驗指南（第3版）》（科學(xué) 出版社）、《微生物學(xué)實驗（第4版）》（高等教育出版社）W及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明 書等。實施例中所用儀器設(shè)備和試劑為市售的常用儀器、試劑。W下實施例中的定量試驗， 均設(shè)置=次重復(fù)實驗，每次重復(fù)實驗中含有10個重復(fù)處理，結(jié)果取平均值。
[0036] 載體祀T-30a(+);購自Novagen公司。大腸桿菌化21值E3);購自Novagen 公司。心天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號 AB0091CAS(56-84-8)。e -丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品 編號 A6168CAS (107-95-9)。
[0037] LB液體培養(yǎng)基組成；酵母膏（0. 5% )，蛋白腺（1 % )，氯化鋼（1 % )
[003引 LB固體培養(yǎng)基組成；酵母膏（0.5%)，蛋白腺（1%)，氯化鋼瓊脂。
[0039] 本文提及的"同源性化omology)"是指DNA的核巧酸序列或蛋白質(zhì)的氨基酸序列 之間的相似程度，同時本文所說的具有（一定程度）同源性的DNA其所編碼的蛋白至少在 用于本發(fā)明的功能方面具有相同的活性，同樣的具有（一定程度）同源性的蛋白質(zhì)至少在 用于本發(fā)明的功能方面具有相同的活性。
[0040] 本文提及的方法中各步驟的執(zhí)行順序并不限于本文的文字所體現(xiàn)出來的順序，也 就是說，各個步驟的執(zhí)行順序是可W改變的，而且兩個步驟之間根據(jù)需要可W插入其他步 驟。
[0041] 本發(fā)明的工程菌是在大腸桿菌基因組上的一個或多個位點整合有DNA序列的重 組菌，所述DNA序列包含選自編碼心天冬氨酸a駿化酶的基因和編碼與所述酶具有至少 60 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選90 %、進(jìn)一步優(yōu)選95 %和最優(yōu)選98 %、甚至99 %同源性且具有所述 酶活性的多膚的基因中的一個。
[0042] 經(jīng)W下實施例篩選得到的高活性k天冬氨酸a駿化酶是枯草芽抱桿菌k天冬 氨酸a駿化酶（序列6)。當(dāng)然，活性越高的心天冬氨酸a駿化酶是越有利的。
[0043] 本發(fā)明通過同源重組的方法將高活性心天冬氨酸a駿化酶的基因整合到大腸桿 菌的基因組中，從而獲得能夠穩(wěn)定增殖且過表達(dá)該酶的工程菌。
[0044] 對于整合基因的拷貝數(shù)沒有特別限制，但是優(yōu)選為2~4拷貝，更優(yōu)選為2拷貝。
[0045] 整合位點應(yīng)當(dāng)是不會對菌的增殖和生長造成不良影響的那些位點。優(yōu)選大腸桿菌 基因組中的化地基因和/或tlrtB基因中的位點。
[0046] 對大腸桿菌也沒有特別的限制，優(yōu)選為化21 0E3)。
[0047] 實施例1、構(gòu)建質(zhì)粒上表達(dá)心天冬氨酸a駿化酶的工程菌
[0048] 我們分別選擇來源于大腸桿菌、谷氨酸椿狀桿菌（Corynebacterium glutami州m)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)和枯草芽抱桿菌炬acillus subtilis)該4種宿主的心天冬氨酸a-駿化酶的編碼基因，進(jìn)行4種工程菌的構(gòu)建。其 中，序列表的序列1所示的DNA序列是大腸桿菌化2U呢)3中k天冬氨酸a -駿化酶的編 碼基因panDc。序列表的序列2所示的DNA序列是谷氨酸椿狀桿菌ATCC13032中k天冬氨 酸a-駿化酶的編碼基因panD。。序列表的序列3所示的DNA序列是結(jié)核分枝桿菌H37RV 中k天冬氨酸a -駿化酶的編碼基因panDM。序列表的序列4所示的DNA序列是枯草芽抱 桿菌168中k天冬氨酸a -駿化酶的編碼基因panDe。
[0049] 一、質(zhì)粒上表達(dá)大腸桿菌心天冬氨酸a-駿化酶的工程菌甲的構(gòu)建
[0050] 1、重組質(zhì)粒祀T30-panDE的構(gòu)建
[0化^ (1)合成序列表的序列1所示的DNA片段。
[005引 似W步驟（1)合成的DNA片段為模板，用Ec-pand-for和Ec-pand-rev組成的引 物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[005引 Ec-pand-for ;5, -GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3'(序列 9);
[0化4] Ec-pand-rev ;5, -TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3' (序列 10)。
[005引 做用限制性內(nèi)切酶Nde I和化n I雙酶切步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收 酶切產(chǎn)物。
[0056] (4)用限制性內(nèi)切酶Nde I和Kpn I雙酶切載體祀T-30a(+)，回收約5300bp的 載體骨架。
[0057] 妨將步驟做的酶切產(chǎn)物和步驟（4)的載體骨架用T4連接酶，16°C過夜連接，得 到重組質(zhì)粒祀T30-panDE。
[0化引根據(jù)測序結(jié)果對重組質(zhì)粒祀T30-panDE進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下；在載體祀T-30a(+)的 Nde I和化n I酶切位點之間插入了序列表的序列1自5'末端第4至381所示的雙鏈DNA 分子。
[0化9] 2、工程菌甲的構(gòu)建
[0060] 將重組質(zhì)粒祀T30-panDE導(dǎo)入大腸桿菌化21 0E3)，得到的重組菌即為工程菌甲， 又稱工程菌 E. coli BL21 〇)E3)/pET30-panDE。
[0061] 二、質(zhì)粒上表達(dá)谷氨酸椿狀桿菌心天冬氨酸a-駿化酶的工程菌己的構(gòu)建
[0062] 1、重組質(zhì)粒祀T30-panDc的構(gòu)建
[006引 （1)合成序列表的序列2所示的DNA片段。
[0064] 似W步驟（1)合成的DNA片段為模板，用cg-pand-for和cg-pand-rev組成的引 物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[00化]cg-pand-for ;5, -GGCTTCCATATGCTGCGTACCATCCTG-3' (序列 11);
[0066] cg-pand-rev ;5, -TTACGGCTCGAGTCAAATACTACGGCTCGTCAGC-3'(序列 12)。
[0067] 做用限制性內(nèi)切酶Nde I和化0 I雙酶切步驟似的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切 產(chǎn)物。
[0068] (4)用限制性內(nèi)切酶Nde I和化0 I雙酶切載體祀T-30a(+)，回收約5300bp的 載體骨架。
[00例 妨將步驟做的酶切產(chǎn)物和步驟（4)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pET30-panDc。
[0070] 根據(jù)測序結(jié)果對重組質(zhì)粒祀T30-panDe進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下；在載體祀T-30a (+)的 Nde I和化0 I酶切位點之間插入了序列表的序列2自5'末端第4至411所示的DNA片 段。
[0071] 2、工程菌己的構(gòu)建
[007引將重組質(zhì)粒祀T30-pan町導(dǎo)入大腸桿菌化21 0E3)，得到的重組菌即為工程菌己， 又稱工程菌 E. coli BL21 0)E3)/pET30-panDc。
[0073] S、質(zhì)粒上表達(dá)結(jié)核分枝桿菌k天冬氨酸a -駿化酶的工程菌丙的構(gòu)建
[0074] 1、重組質(zhì)粒祀T3〇-panDii的構(gòu)建
[007引 （1)合成序列表的序列3所示的DNA片段。
[0076] 似W步驟（1)合成的DNA片段為模板，用mt-pand-for和mt-pand-rev組成的引 物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0077] mt-pand-for ;5, -GGCTTCCATATGTTACGGACGATGCTG-3' (序列 13);
[007引 mt-pand-rev ;5, -TTACGGGGTACCCTATCCCACACCGAGCCG-3' (序列 14)。
[0079] 做用限制性內(nèi)切酶Nde I和化n I雙酶切步驟似的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切 產(chǎn)物。
[0080] (4)用限制性內(nèi)切酶Nde I和Kpn I雙酶切載體祀T-30a(+)，回收約5300bp