利用α-L-鼠李糖苷酶催化柚皮苷合成普魯寧的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種利用a -L-鼠李糖苷酶催化柚皮苷合成普魯寧的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柚皮苷，學(xué)名為柚皮素-7-β-D-葡萄糖(2 — I)-a-L-鼠李糖，在a-L-鼠李糖苷酶的作用下脫去一個(gè)L-鼠李糖基生成普魯寧(柚皮素-7-0-葡萄糖苷)。普魯寧的苦味為柚皮苷的三分之一，而且具有多種功能。普魯寧對(duì)DNA/RNA病毒具有不同的抗過(guò)濾性病毒活性和抗炎活性，還可以作為糖尿病患者的甜味劑，也可作為藥物原材料，用來(lái)合成各種化學(xué)醫(yī)用藥物，如用于合成毛細(xì)管擴(kuò)展的藥物等，可以被人體良好的吸收。
[0003]普魯寧是一種二氫黃酮類化合物，最初由南朝鮮民間藥物山桃中提取得到的，其在自然界中主要分布于蘇木科、薔薇科、大戟科等植物中。其水溶性、脂溶性差，較難獲得，價(jià)格昂貴。目前普魯寧的制備方法主要有一下兩種，化學(xué)提取法和酶法水解柚皮苷法。利用酶法水解柚皮苷制備普魯寧的條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、安全環(huán)保，因此研究酶法制備普魯寧具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]在酶的生物轉(zhuǎn)化研究中，許多底物在水中溶解性較差，因此需要通過(guò)某些方法或途徑來(lái)增大酶與底物的接觸機(jī)會(huì)，從而提高底物的轉(zhuǎn)化率或增加產(chǎn)物的生成量。目前常用的方法是改變酶催化反應(yīng)的介質(zhì)，其中研究最多、應(yīng)用最廣的是有機(jī)溶劑，但有機(jī)溶劑酶催化反應(yīng)缺點(diǎn)多，能直接或間接地與底物或產(chǎn)物發(fā)生作用并改變酶蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，破壞酶的催化活性，降低酶的穩(wěn)定性；有機(jī)溶劑使后期的分離純化比較困難。
[0005]有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種利用a -L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普魯寧的方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種a-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普魯寧的方法。該方法可以高效地實(shí)現(xiàn)定向水解柚皮苷分子中的a-L-鼠李糖苷鍵，為酶法制備高純度普魯寧的工業(yè)化應(yīng)用提供了新工藝。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是:
一種利用a -L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普魯寧的方法，包括以下步驟: 步驟一、制備固定化柚皮苷:
將柚皮苷溶解于PH 4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，得到濃度為2.0 g/L的柚皮苷底物溶液，向所述柚皮苷底物溶液中加入大孔吸附樹(shù)脂，置于50°C水浴中恒溫振蕩充分固定，使柚皮苷吸附并固定于大孔吸附樹(shù)脂中，制得固定化柚皮苷溶液；
步驟二、a -L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普魯寧:
向所述固定化柚皮苷溶液中加入濃度12U/mL的a -L-鼠李糖苷酶酶液，置于60°C恒溫振蕩水浴中進(jìn)行酶解反應(yīng)，振蕩速率80 r/min，反應(yīng)時(shí)間300 min, a-L-鼠李糖苷酶酶液催化固定化柚皮苷合成普魯寧，獲得含水解產(chǎn)物普魯寧的轉(zhuǎn)化液，普魯寧被吸附至大孔吸附樹(shù)脂中；
步驟三、普魯寧的分離純化:
所述酶解反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾收集大孔吸附樹(shù)脂并裝柱，采用體積比為80:20:4.8的丙酮-氯仿-水作為洗脫劑對(duì)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，同時(shí)采用薄層色譜法對(duì)洗脫液進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，將只含有普魯寧的洗脫液進(jìn)行合并，而后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60° C下減壓蒸發(fā)濃縮，甲醇反復(fù)重結(jié)晶2次，得普魯寧樣品。
[0008]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，固定化所用的大孔吸附樹(shù)脂的材料為聚苯乙烯，極性為非極性或弱極性，比表面積為480~800 m2/g，平均孔徑為90~450A。
[0009]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括采用TLC薄層色譜法對(duì)步驟二所述轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，其中，展開(kāi)劑:丙酮-氯仿-水(體積比為80:20:4.8);顯色劑:3g香蘭素,50mL無(wú)水乙醇,0.5mL濃硫酸。
[0010]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括采用HPLC法對(duì)步驟二所述轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為:反相柱的柱溫35° C，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣體積20 yL，流速0.4 mL/min,走樣時(shí)間20 min,流動(dòng)相為水、甲醇及乙腈,梯度洗脫。
[0011]本發(fā)明首次應(yīng)用a-L-鼠李糖苷酶催化水解固定化柚皮苷，實(shí)現(xiàn)普魯寧的定向生物合成。該方法條件溫和，反應(yīng)產(chǎn)物較單一，產(chǎn)物得率高，環(huán)境友好；此外，可以克服以往酶促水解產(chǎn)物多樣性問(wèn)題，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度普魯寧，為今后大規(guī)模工業(yè)化生物合成普魯寧的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為推動(dòng)醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具有十分重要的意義?，F(xiàn)有的固定化技術(shù)，一般用于將酶固定在載體上，本發(fā)明人反其道行之，將底物固定在載體上，以改變酶催化反應(yīng)的微環(huán)境，將底物固定在固相介質(zhì)中與酶進(jìn)行反應(yīng)可大大提高底物濃度及酶的活性和穩(wěn)定性，為柚皮苷和其他物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化提供了一條新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1 20mL反應(yīng)體系酶解工藝；
圖2 IL放大反應(yīng)體系酶解工藝；
圖3酶解產(chǎn)物分離純化TLC圖；其中，I為柚皮素、普魯寧、柚皮苷混標(biāo)；2為鼠李糖標(biāo)品；3為加酶前反應(yīng)液；4為反應(yīng)3h反應(yīng)液；5為反應(yīng)6h反應(yīng)液；
圖4 HPLC法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)果分析圖；其中，a)加酶前反應(yīng)液；b)反應(yīng)2h反應(yīng)液；c)反應(yīng)4h反應(yīng)液；d)反應(yīng)完全后反應(yīng)液；
圖5為對(duì)只含普魯寧的洗脫液做的TLC檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下列實(shí)施例中采用的檢測(cè)方法:
a-L-鼠李糖苷酶酶活力的測(cè)定:在10 mL的離心管中加入1.0 mL濃度為300 μ g/mL的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為底物，再加入950 μ L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0),漩渦混勻，置于50° C水浴鍋中保溫10 min，使離心管中的底物和緩沖液混合物的溫度達(dá)到50° C后，迅速加入50 yL酶溶液，混勻，在50° C恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min后立即于100° C沸水浴中熱處理30 min，使酶液徹底失活，迅速冷卻，12000 rpm室溫離心10 min后于0.22 μ m濾膜過(guò)濾，利用HPLC測(cè)定柚皮苷和普魯寧的含量?？瞻讓?duì)照組以滅活的酶液代替原酶溶液，其余步驟同上。
[0014]TLC薄層色譜法:展開(kāi)劑:丙酮-氯仿-水(體積比為80:20:4.8)；
顯色劑:3g香蘭素,50mL無(wú)水乙醇,0.5mL濃硫酸。
[0015]HPLC 米用 Waters e2695 (Waters e2695 Separat1ns Module、Waters2489 UV/Visible Detector),測(cè)定反應(yīng)液中柚皮苷和普魯寧的含量。Symmetry C18反相柱的柱溫35° C，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣體積20 yL，流速0.4 mL/min，走樣時(shí)間20min,流動(dòng)相為水、甲醇、乙腈，梯度洗脫。
[0016]a-L-鼠李糖苷酶酶活力單位定義(U):在50° C、pH 5.0的條件下反應(yīng)I min，消耗I μ g柚皮苷所需的a-L-鼠李糖苷酶的量定義為一個(gè)a-L-鼠李糖苷酶活力單位。
[0017]還原糖生成量的測(cè)定:采用2，4-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶解過(guò)程的還原糖生成量:取0.2 mL反應(yīng)液與0.6 mL DNS溶液混合，搖勻，100° C水浴15 min,隨即取出用自來(lái)水冷卻，再用蒸餾水定容至5 mL，于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算反應(yīng)液中還原糖的生成量。
[0018]其中柚皮苷轉(zhuǎn)化率(%)=酶解反應(yīng)中還原糖的生成量(mg) X 100/柚皮苷完全水解時(shí)還原糖的生成量(mg)。
[0019]實(shí)施例1:固定化柚皮苷的酶解轉(zhuǎn)化生產(chǎn)普魯寧工藝
固定化所用的大孔吸附樹(shù)脂的材料為聚苯乙烯，極性為非極性或弱極性，比表面積為480-800 m2/g，平均孔徑為90~450A。所使用大孔吸附樹(shù)脂要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，處理方法大致為:樹(shù)脂先經(jīng)漂浮法進(jìn)行篩選，再用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，浸泡過(guò)程中保持樹(shù)脂完全被浸沒(méi)。然后濕法上柱，用95%乙醇通過(guò)