轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，利用 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率，觀察到miR_26amimics與inhibitor使miR_26a的表達(dá)發(fā)生了明 顯的上升及下降；
[0035] 3)利用qRT-PCR觀察到隨著miR_26a的表達(dá)的上升及下降，成血管相關(guān)的關(guān)鍵性 的基因的表達(dá)也呈現(xiàn)出上升及下降的趨勢；
[0036] 4)將miR-26amimics轉(zhuǎn)染入血管內(nèi)皮細(xì)胞致細(xì)胞內(nèi)miR-26a表達(dá)升高后，利用管 腔形成實(shí)驗體外觀察miR-26a促血管化能力；
[0037] 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與羥基磷灰石按4X106與40mg的比例混合后，植入裸鼠皮下，組 織學(xué)體內(nèi)觀察到miR-26a明顯促進(jìn)血管化。
[0038] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明：
[0039] 1、目標(biāo)microRNA的篩選
[0040] 1)小鼠下肢缺血再灌注模型的建立
[0041] 小鼠腹腔注射lmg/ml戊巴比妥鈉（小鼠每10g體重0. 03ml)麻醉成功后，將小鼠 仰臥位，并將四肢及門牙固定。右側(cè)腹股溝區(qū)局部酒精消毒后用眼科剪剪開右側(cè)腹股溝區(qū) 皮膚，在體視顯微鏡下（放大倍數(shù)3~5倍）小心分離皮下脂肪層和筋膜，暴露髂外動脈遠(yuǎn) 端及股動脈起始處、股靜脈及股神經(jīng)，用直型眼科鑷小心分離髂外動脈起始部和股動脈，并 小心將靜脈和神經(jīng)分開；用彎型眼科鑷挑起髂外動脈，于髂外動脈遠(yuǎn)端股動脈起始處用高 頻電刀（功率為25W)電凝中斷血流，依次分離股動脈和胭動脈并電凝，術(shù)中操作需要非常 小心保護(hù)靜脈和神經(jīng)，避免靜脈血管破裂出血或電凝中斷，一旦靜脈及神經(jīng)受損則該模型 淘汰?？p皮后結(jié)束手術(shù)，注意保暖直至蘇醒。
[0042] 2)小鼠下肢缺血再灌注模型的驗證
[0043]a:大體觀察模型制作完成后觀察雙側(cè)下肢皮膚的顏色及運(yùn)動功能。
[0044] b:X線成像小鼠下肢缺血模型制作后24h內(nèi)，2mg/ml戊巴比妥鈉過量麻醉小鼠。 醫(yī)用硫酸鋇混懸液配制成鋇水濃度為100%。剪開胸腔暴露心臟，眼科鑷于右心房剪一小 口，從左心室注射濃度為100%的硫酸鋇溶液0. 5~1. 0ml，觀察右心房流出白色硫酸鋇后 立即停止注射，置于X線機(jī)下投照，投照體位為盆腔及雙側(cè)下肢正位、左右斜位。掃描參數(shù)： 35kV，100yA，曝光時間 60s。
[0045]c:Micr〇-CT成像X線成像結(jié)束后立即進(jìn)行Micro-CT掃描。掃描參數(shù)：60kV， 70yA，層厚 0? 05mm〇
[0046]d:組織病理切片HE染色斷頸處死裸鼠后，生理鹽水及4%多聚甲醛前后心臟灌流 后取出缺血側(cè)及正常側(cè)下肢肌肉。組織常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5ym，進(jìn)行蘇木素-伊紅 (Hematoxylin&Eosin，HE)染色和Masson染色，HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變，Masson染色主要 觀察存活肌纖維。
[0047] 3)新生組織總RNA提取
[0048] 將新生組織進(jìn)行取材并進(jìn)一步提取總RNA。用高速均質(zhì)儀進(jìn)行所取得的骨組織粉 碎處理，使用Trizol試劑盒新生骨組織中提取總RNA，利用RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳與紫 外分光光度計驗證獲得RNA的純度、濃度和完整性，電泳結(jié)果得出，總RNA的28S和18S條 帶均很清晰、完整。經(jīng)紫外分光光度計測定，總RNA的純度（A260/A280)在1. 90~2. 00之 間，其質(zhì)量能夠保證進(jìn)行下面的利用qRT-PCR對成骨相關(guān)的microRNA表達(dá)量的比較分析。
[0049] 4)利用qRT-PCR對多個血管相關(guān)的microRNA表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示miR_26a 在新生骨組織的表達(dá)中明顯高于其他幾個血管相關(guān)的microRNA，因此初步將其確定為目標(biāo) microRNA進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗證。
[0050] 2、MiR-26a促血管作用的功能驗證
[0051] 1)microRNA轉(zhuǎn)染
[0052]細(xì)胞匯合達(dá)到 60-70%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR_26amimics，miR_26ainhibitor， miR-negativecontrol和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別加入無血清無雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)基 中，柔和混勻，室溫放置5分鐘，后將兩者混勻，室溫放置20分鐘，以便形成siRNA/SiMi TransfectionReagents(或DNA/SiMiTransfectionReagents)復(fù)合物，并將其加到含有 細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，培養(yǎng)箱中溫育24h-48h后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。通過 qRT-PCR檢測到miR_26a的表達(dá)隨著miR_26amimics與miR_26ainhibitor轉(zhuǎn)入，分別上 調(diào)與下降10倍與1. 5倍，因此確定轉(zhuǎn)染成功。
[0053] 2)MiR_26a促血管作用的基因與蛋白水平的檢測
[0054] a:miR_26a表達(dá)上調(diào)對Vegf與Ang-1基因水平表達(dá)的影響。Vegf與Ang-1的是 最有效的促血管生長因子，他們分別在血管發(fā)生與成熟兩個過程中起著重要的作用。這兩 個生長因子的表達(dá)上調(diào)會有效并且穩(wěn)定的促進(jìn)血管化，將轉(zhuǎn)染miR-26amimics與negative control的細(xì)胞驗證轉(zhuǎn)染成功后，利用qRT-PCR對其進(jìn)行Vegf與Ang-lmRNA表達(dá)差異分析， 發(fā)現(xiàn)miR_26amimics細(xì)胞中Vegf與Ang-1的表達(dá)水平相對于negativecontrol分別上 調(diào)了 6倍與2倍（如圖2、圖3)，因此確定，miR-26a同時有效地促進(jìn)以上兩個促血管生長 因子的基因水平的表達(dá)。
[0055]b:Western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)。將miR_26amimics，miR_26ainhibitor 與negativecontrol轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取蛋白樣本后，對樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至 PVDF膜上之后，用5 %的脫脂奶室溫封閉lh，用鼠源性抗Vegf與Ang-1標(biāo)簽單抗作為一抗， 4°C孵育過夜。次日，再以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育lh，充分漂洗后，DAB顯 色；結(jié)果顯示：miR-26a有效的促進(jìn)了Vegf與Ang-1蛋白水平的表達(dá)（如圖4、圖5)。
[0056]c:Elisa檢測miR-26a對VEGF分泌性生長因子的蛋白分泌的影響將miR-26。a mimics，miR_26ainhibitor與negativecontrol轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 采用elisa方法分別于8小時、16小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時以及84 小時檢測培養(yǎng)基中VEGF的含量，結(jié)果如圖2所示，VEGF生長因子的分泌隨著miR-26a的促 進(jìn)與抑制作用而上升和下降，在轉(zhuǎn)染16h后達(dá)到高峰，作用一直持續(xù)至2天左右。
[0057] 3、miR-26a促血管化的體外檢測
[0058] 管腔形成實(shí)驗：將槍頭和96孔板于_20°C預(yù)冷，將Matrigel膠放冰上，使之融化， 取Matrigel膠（60yL/孔）加入到預(yù)冷的96孔板中，避免形成氣泡；冰上放置5min，使 Matrigel液面水平，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱30min使之凝固；將轉(zhuǎn)染miR-26a的HUVECs(細(xì) 胞數(shù)5X104/孔）加入到含Matrigel膠的孔中，然后加同濃度的催化因子；37°C培養(yǎng)8h; 在顯微鏡下觀察，參見圖6,隨機(jī)選擇5個視野拍照（X200)，按下列公式計算管腔系數(shù) (vascularindex):管腔系數(shù)（％ )=管腔面積/總面積X100。結(jié)果顯示，miR_26a有效 的促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成功能（如圖6)。
[0059] 4、MiR_26a促血管化的體內(nèi)檢測
[0060] 1)體內(nèi)異位成血管模型的建立
[0061] 將4X106轉(zhuǎn)染miR-26amimics的細(xì)胞與40mg羥基磷灰石/磷酸三媽混合后，置 于小鼠股部肌袋內(nèi)。
[0062] 2)組織學(xué)分析
[0063]a:蘇木精-伊紅染色將樣本取材，固定，脫鈣2周后，分別用石蠟與冰凍包埋樣本。 將石蠟切片采用梯度酒精脫蠟至水，蘇木精液染色5min，流水稍洗去蘇木精液l-3s，1 %鹽 酸乙醇l-3s，稍水洗10-30s，蒸餾水過洗l-2s，0. 5%伊紅液染色l-3min，蒸餾水稍洗l-2s， 酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參見圖7,結(jié)果顯示，microRNA轉(zhuǎn)染組骨量明顯高于 對照組。
[0064] b:免疫熒光染色將冰凍切片丙酮固定30min，PBS沖洗后，鼠來源的抗⑶31單抗 作為一抗4°孵育過夜。次日，再以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育lh，激光共聚 焦觀察，參見圖7,可以看出，microRNA轉(zhuǎn)染組血管化程度要明顯高于對照組。
【主權(quán)項】
1. 一種促進(jìn)組織工程骨血管化的microRNA，其特征在于，所述microRNA為miR-26a，序 列如SEQ.ID.NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的miR-26a在制備促進(jìn)組織工程骨血管化的藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為誘導(dǎo)促血管生長因子VEGF表 達(dá)的藥物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為誘導(dǎo)促血管生長因子ANG-I表 達(dá)的藥物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為誘導(dǎo)VEGF和ANG-I同時表達(dá) 的藥物。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為增加血管官腔面積的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)組織工程骨血管化的microRNA及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的microRNA為miR-26a，序列如SEQ.ID.NO.1所示。本發(fā)明利用小鼠顱骨缺損再生模型，在新生骨中發(fā)現(xiàn)了miR-26a的優(yōu)勢表達(dá)，經(jīng)過體外將miR-26a mimics及inhibitor轉(zhuǎn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)miR-26a的表達(dá)上升及下降之后，在三個成骨相關(guān)的細(xì)胞模型中進(jìn)行miR-26a對血管生成相關(guān)的生長因子調(diào)節(jié)作用的體外觀察，利用體內(nèi)原位骨缺損與異位骨再生模型進(jìn)行了miR-26a促血管化作用的進(jìn)一步體內(nèi)驗證。
【IPC分類】A61K31-7105, A61K48-00, C12N15-113, A61P9-00
【公開號】CN104694542
【申請?zhí)枴緾N201510122196
【發(fā)明人】陳吉華, 李巖
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月19日