新的rig-i配體及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及可W作為RIG-I配體起作用的新的=磯酸-修飾的寡核巧酸W及能夠 W高收率和純度合成和純化的適合于藥物應(yīng)用的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Schlee等人，Immunity, 2009, 31, 25-34 描述了在一條鏈上攜帶 5'-〇-S磯酸醋部 分的純端雙鏈RNA，通過(guò)結(jié)合RIG-I解螺旋酶，作為有效的免疫系統(tǒng)的刺激劑。因此，對(duì)提供 簡(jiǎn)單且有效的用于制備適用于藥物應(yīng)用的高純度=磯酸修飾的寡核巧酸的方法存在需求。
[0003] S磯酸基團(tuán)或其類似物與核巧化合物的5' -OH基團(tuán)的偶聯(lián)是本領(lǐng)域公知 的。LudwigJ.等人，J.Org.Qiem. , 1989, 54, 631-635 公開 了使用 2-氯-4H-1, 3, 2-苯 并二氧磯雜環(huán)己燒化enzodioxaphosphorin)-4-酬作為亞磯酸化劑的用于制備核巧和 類似物的5 ' -0-S磯酸醋的溶液S磯酸化方法。GaurR.K.等人，1992,Tetr址e化on Letters, 33, 3301-3304描述了在固相上使用所述方法，用于合成2' -0-甲基核糖核巧 5'-0-S磯酸醋及其P。-硫代類似物。美國(guó)專利6, 900, 308B2公開了作為潛在抗病毒化合 物的修飾核巧5'-0-S磯酸醋的固相合成，而美國(guó)專利7, 285, 658、7, 598, 230和7, 807, 653 公開了在糖、核酸堿基和=磯酸實(shí)體上具有修飾的核巧=磯酸醋類似物。
[0004] W096/40159描述了用于生產(chǎn)加帽的RNA或RNA類似物分子的方法，其中將RNA或 RNA類似物寡核巧酸與亞磯酸化劑（如，2-氯-4H-1，3, 2-苯并二氧磯雜環(huán)己燒-4-酬或其 環(huán)取代的衍生物）反應(yīng)。將所得到的中間體與磯酸醋或焦磯酸醋或其氧化的或水解的鹽反 應(yīng)。通過(guò)與激活的m7G=-、二-或單磯酸醋或類似物反應(yīng)，將二-或=磯酸化RNA或RNA 類似物加帽。
[0005] W0 2009/060281描述了含有修飾的寡磯酸醋部分的免疫刺激寡核糖核巧酸類 似物和用于制備該些化合物的方法。該方法包括在固體支持物上合成寡核巧酸，在適 合的溶劑中，并且在堿的存在下，在寡核巧酸的5' -端，將核巧酸與亞磯酸化劑（如， 2-氯-4H-1，3, 2-苯并二氧磯雜環(huán)己燒-4-酬）反應(yīng)，將亞磯酸化的寡核巧酸與焦磯酸醋 或焦磯酸醋類似物反應(yīng)，用氧化劑氧化寡核巧酸，并且將寡核巧酸去保護(hù)，W產(chǎn)生=磯酸 醋-或=磯酸醋類似物-修飾的寡核巧酸。
[0006] W0 96/40159中使用的聚丙締酷胺凝膠電泳只可用于小規(guī)模分離。用于較長(zhǎng)寡核 糖核巧的5' -單-、二-、S磯酸化產(chǎn)品的離子交換色譜的分辨力受到限制。所需的變性條 件使得分離是個(gè)冗長(zhǎng)乏味的任務(wù)（Sproat，1999 ;Zlatev，2010 ;W0 2009/060281)，此外，產(chǎn) 品通常受到正-1、正-2序列及其單-和二磯酸醋的污染，導(dǎo)致純度不足。已知對(duì)RIG-I配 體的精確末端結(jié)構(gòu)的敏感性，該些純化方法對(duì)藥物應(yīng)用是次最佳的。
[0007] 因此，對(duì)于新的=磯酸化寡核巧酸及其類似物、特別是具有RIG-I選擇性的新的 =磯酸化寡核巧酸及其類似物W及該樣的化合物的制備方法存在高度需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明由此設(shè)及新的可W用于大規(guī)模生產(chǎn)的可能用于臨床應(yīng)用的5'-S磯酸化 寡核巧酸及其類似物W及該樣的寡核巧酸的便利制備方法。此外，描述了寡核巧酸修飾，其 建立、維持和/或改善寡核巧酸的RIG-I選擇性或增強(qiáng)其化學(xué)穩(wěn)定性。
[0009] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面設(shè)及式（I)的修飾的寡核巧酸，
[0010]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式（I)的修飾的寡核苷酸，
其中VI、V3和V5在每種情況中獨(dú)立地選自0、S和Se; V2、V4 和V6 在每種情況中獨(dú)立地選自 0H、0R1、SH、SR1、F、NH2、NHR1、N(R1) 2 和BH3-M+ ;W1是0或S; W2 是 0、S、NH或NR2 ; [是0、5、順、順2、012、01他1或〇〇^1)2; R1、R2和R3選自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C2-6?；颦h(huán)狀基團(tuán)，其各自任選 地被取代； 或其中兩個(gè)R1可以與所結(jié)合的N-原子一起形成環(huán)； M+是陽(yáng)離子； X是NH、NR3、0或S; Z表示捕獲標(biāo)記物或H; Y表示價(jià)鍵或使捕獲標(biāo)記物連接至X的連接基；且 0N表示包含至少4個(gè)核苷酸或核苷酸類似物結(jié)構(gòu)單元的寡核苷酸。
2. 權(quán)利要求1的修飾的寡核苷酸，其中￥1、￥2、￥3、￥4、￥5、￥6、11、12和13是0。
3. 權(quán)利要求1或2的修飾的寡核苷酸， 其中Y是價(jià)鍵。
4. 權(quán)利要求1或2的修飾的寡核苷酸， 其中Y是連接基，其優(yōu)選地選自任選地包含雜原子或含雜原子的基團(tuán)的亞烷基或亞芳 烷基，以及聚環(huán)氧烷。
5. 權(quán)利要求1 一 4任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中Z是長(zhǎng)鏈脂族殘基、非共價(jià)高親和力結(jié)合對(duì)的配偶體、反應(yīng)性化學(xué)實(shí)體、Q或NHC2-C24烷基，且Q選自H、氨基酸、氨基酸類似物、C「C24烷基，優(yōu)選C12-C24烷基、肽類和脂 質(zhì)。
6. 權(quán)利要求1 一 5任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中該寡核苷酸選自單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和寡核苷酸類似物，它 們可以任選地在脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或寡核苷酸類似物的核苷和/或核糖上被化 學(xué)修飾。
7. 權(quán)利要求1 一 6任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中該寡核苷酸是雙鏈的且所述雙鏈的每條鏈具有至少19個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
8. 權(quán)利要求1 一 7任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中所述化學(xué)修飾維持、建立或增強(qiáng)所述寡核苷酸的選擇性，特別是寡核苷酸的RIG-I選擇性。
9. 權(quán)利要求1 一 8任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中所述化學(xué)修飾維持或增強(qiáng)所述寡核苷酸的化學(xué)穩(wěn)定性。
10. 權(quán)利要求1 一 9任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸， 其中所述化學(xué)修飾獨(dú)立地選自鹵化，特別是F鹵化；2' -0-烷基化，特別是2' -0-甲基 化；和/或核苷酸間連接鍵之間的至少一種硫代磷酸酯修飾。
11. 權(quán)利要求1 一 10任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸，其中 X是NH或0 ; Y是-K-((CHRDm-CH2-〇)n-R;或 -(0- (CHR丄3-CH2) nl- (0- (CHR2)m2-CH2) n2- (0- (CHR丄「CH2) n3-;且K是0或NH; m、mp1112和m3獨(dú)立地是1 - 12 ; n、rip112和n3獨(dú)立地是0 - 20 ;且 札、馬和R3獨(dú)立地是H、C^烷基、C2_6烯基、C2_6炔基、C2_C6-?；颦h(huán)狀基團(tuán)，其各自任 選地被取代；且 R是k烷基、C2_6烯基、C2_6炔基、C2_C6-?；颦h(huán)狀基團(tuán)，其各自任選地被取代。
12. 權(quán)利要求11的修飾的寡核苷酸，其中 RjPR#H;且 %= 0,n2= 1，且n3= 1〇
13. 權(quán)利要求11的修飾的寡核苷酸，其中 rij、n2和n3是 1 〇
14. 權(quán)利要求1 一 13任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸，其中 X是NH或0 ; Y是價(jià)鍵；且 Z是C「C12烷基，優(yōu)選C1(|;和Q或NHC2-C24烷基，其中Q選自H、氨基酸、氨基酸類似物、C「C24烷基、優(yōu)選C12-C24烷基、肽類和脂質(zhì)；且 W3是 0。
15. 權(quán)利要求1 一 14任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸，其中 X是0或NH，優(yōu)選0 ; Y是價(jià)鍵； Z是H;且 Vi、V2、V3、V4、V5、V6、V12和W3優(yōu)選是 0〇
16. 藥物組合物，包含權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的修飾的寡核苷酸。
17. 權(quán)利要求16的藥物組合物，通過(guò)皮內(nèi)、特別是通過(guò)紋身術(shù)、顯微操作針?lè)ê?或顯 微操作針斑貼施用。
18. 制備權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的寡核苷酸的方法，包含下列步驟： (a)使式（Ila)的化合物與氧化劑反應(yīng)
其中VI、V3、V5、V4、V6、Wl、W2、W3和ON如上述所定義，其中ON被至少一個(gè)保護(hù)基保 護(hù)，得到式（lib)的化合物
其中V1、V3、V5、V2、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上述所定義，其中ON被至少一個(gè)保護(hù)基 保護(hù)； (b) 使式（lib)的化合物與式（III)的捕獲標(biāo)記物試劑反應(yīng)， Z-Y-XH(III)， 其中X，Z，和Y如上述所定義，其中X優(yōu)選是0,得到包含式（I)的寡核苷酸的反應(yīng)產(chǎn) 物；和 (c) 使所述至少一個(gè)0N保護(hù)基脫保護(hù)；和 (d) 使步驟（b)的反應(yīng)產(chǎn)物接觸能夠與捕獲標(biāo)記物發(fā)生相互作用的捕獲試劑，其中該 接觸在能夠使寡核苷酸（I)與所述反應(yīng)產(chǎn)物中包含的其它種類分離的條件下進(jìn)行。
19.權(quán)利要求18的方法，還包含下列步驟： (e) 除去捕獲標(biāo)記物，得到寡核苷酸，其中對(duì)于X= 0,得到式（IVa)或（Ivb)的化合 物；
且對(duì)于X=NH，得到式（IVa)的化合物
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中 捕獲標(biāo)記物和能夠與其發(fā)生相互作用的捕獲試劑選自： (i) 疏水性或氟化基團(tuán)和對(duì)于疏水性或氟化基團(tuán)具有親和力的色譜材料，例如反相材 料或氟親和支持物； (ii) 非共價(jià)結(jié)合對(duì)的第一配偶體和非共價(jià)結(jié)合對(duì)的第二配偶體；和 (iii) 共價(jià)結(jié)合對(duì)的第一配偶體和共價(jià)結(jié)合對(duì)的第二配偶體，其中第一和第二配偶體 形成共價(jià)鍵。
【專利摘要】本發(fā)明涉及可以作為RIG-I配體起作用的新的三磷酸-修飾的寡核苷酸以及能夠以高收率和純度合成和純化的適合于藥物應(yīng)用的新方法。
【IPC分類】C07H21-02, A61K31-713
【公開號(hào)】CN104703996
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380050517
【發(fā)明人】M·戈?duì)柕驴? J·范登伯恩, J·路德維希, C·舒伯特-瓦格納
【申請(qǐng)人】波恩萊茵弗里德里?！ね髮W(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年9月26日
【公告號(hào)】CA2885564A1, EP2712870A1, EP2903997A1, US20150275217, WO2014049079A1