一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（StemCells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì) 胞，是原始且未特化的細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。干細(xì)胞存在所有多細(xì)胞組織里，能經(jīng)由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細(xì)胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細(xì)胞。干細(xì)胞的來源有很多，包括 骨髓、臍帶、臍帶血、牙齒與脂肪。
[0003] 2000年首次發(fā)現(xiàn)了牙髓干細(xì)胞，Gronthos等發(fā)現(xiàn)在離體的乳牙和智齒中都存在 牙髓干細(xì)胞。這是一類具有高增殖能力、高度自我更新能力、多項(xiàng)分化能力的細(xì)胞。已有 研宄利用該細(xì)胞成功地構(gòu)建牙髓、牙本質(zhì)以及牙齒組織。牙髓干細(xì)胞（dentalpulpstem cell，DPSC)與其他組織來源的干細(xì)胞在生物學(xué)特性上有很多相似之處。Gronthos等對(duì) 牙髓干細(xì)胞的克隆形成率進(jìn)行了研宄，與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowstromalcell， BMSC)比較后發(fā)現(xiàn)：牙齒來源的DPSC的克隆形成率明顯高于骨髓來源的BMSC，這就表明 DPSC具有較BMSC更高的增生能力和自我更新能力。且牙髓干細(xì)胞在成脂、成軟骨和成神經(jīng) 誘導(dǎo)方面均有研宄證實(shí)牙髓干細(xì)胞具有多向分化的潛能，為其在體內(nèi)植入牙髓干細(xì)胞使受 損或衰退的組織、器官改善或恢復(fù)功能提供了理論依據(jù)。
[0004] 臨床使用牙髓干細(xì)胞的前提是對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行大量的擴(kuò)增，現(xiàn)有的擴(kuò)增方法最 常規(guī)的是使用添加10%胎牛血清的培養(yǎng)基。臨床使用含動(dòng)物源的培養(yǎng)基不僅會(huì)引起免疫排 斥反應(yīng)，異源病毒感染，而且采用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞，生長(zhǎng)比較緩慢，在傳代超 過5次之后其分化功能細(xì)胞的潛能會(huì)大大降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，這種培養(yǎng) 基可以解決牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)方法落后造成的牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)困難，分化潛能降低，及含異 源動(dòng)物蛋白的問題。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM，1L培 養(yǎng)基中含有SITE100*(sigma)10-10ml，抗壞血酸200-400mM，SITE為細(xì)胞生長(zhǎng)必需的組 份，抗壞血酸和纖連蛋白有助于牙髓干細(xì)胞形成細(xì)胞外基質(zhì)，利于牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)。含 有PDGFl-10ug，氫化可的松l-10ug，EGFl-5ng，b-FGFl-5ng，PTH50-200ng，地塞米松 l-20mM，這些生長(zhǎng)因子的組合可以有效的增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞的增殖能力，且保持細(xì)胞的未分 化狀態(tài)。
[0007] 所述的牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，1L培養(yǎng)基中含有人血白蛋白l-10g，人血白蛋白可以 顯著增強(qiáng)細(xì)胞利用脂質(zhì)，利用微量元素的能力，促進(jìn)牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基及其 用途，該培養(yǎng)基能夠快速擴(kuò)增牙髓干細(xì)胞同時(shí)不影響牙髓干細(xì)胞的多向分化能力，牙髓干 細(xì)胞的擴(kuò)增速度較常規(guī)培養(yǎng)基提高2-3倍，所培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞在10代內(nèi)依然具有多向分 化能力，同時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)不含有動(dòng)物源物質(zhì)，細(xì)胞用于臨床時(shí)不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥及病毒感染 的風(fēng)險(xiǎn)，具有很高的科研和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 實(shí)施例1 :
[0010] 對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的加速作用的實(shí)驗(yàn)
[0011] 1.受試培養(yǎng)基：常規(guī)培養(yǎng)基組份：DMEM基本培養(yǎng)基，10 %胎牛血清（FBS);本發(fā)明 的培養(yǎng)基，包括：SITE100*(sigma) 10ml、抗壞血酸300mM、PDGF5ug、氫化可的松5ug、EGF 3ng、b-FGF、3ng、PTH100ng、地塞米松 10mM、MDM余量。
[0012] 2.培養(yǎng)干細(xì)胞來源：來源于牙髓的牙髓干細(xì)胞
[0013] 3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種密度為4000個(gè)/ml，接種于12孔板中放入培養(yǎng)箱 培養(yǎng)（37度，5%C02)。每隔24小時(shí)里利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)一次細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)本發(fā) 明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞比經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞便顯出更快的擴(kuò)增速度（數(shù)據(jù) 為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，每IL牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基中有以下重量配比成 分組成：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基中 還可以在每IL培養(yǎng)基加入人血白蛋白l-10g。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM，1L培養(yǎng)基中含有SITE100*，抗壞血酸200-400mM，SITE為細(xì)胞生長(zhǎng)必需的組份，抗壞血酸和纖連蛋白有助于牙髓干細(xì)胞形成細(xì)胞外基質(zhì)，利于牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)。含有PDGF1-10ug，氫化可的松1-10ug，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM，這些生長(zhǎng)因子的組合可以有效的增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞的增殖能力，且保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠快速擴(kuò)增牙髓干細(xì)胞同時(shí)保持牙髓干細(xì)胞的多向分化能力，擴(kuò)增速度較常規(guī)培養(yǎng)基調(diào)高2-3倍，具有很高的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N5-074
【公開號(hào)】CN104711219
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510095430
【發(fā)明人】楊茜, 董成友, 張路軍
【申請(qǐng)人】安徽新生命干細(xì)胞科技有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月1日