Nk細(xì)胞的體外制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種NK細(xì)胞的體外制備方法，具體的說(shuō)，涉及一 種從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化制備成NK細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] NK細(xì)胞（naturalkillercells)又稱(chēng)自然殺傷細(xì)胞，是一類(lèi)CD56+，CD3-的淋巴 細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞，它無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可識(shí)別腫瘤及病毒感染 的細(xì)胞。它位于機(jī)體防御體系的第一道防線(xiàn)，同時(shí)它又能通過(guò)早期分泌多種細(xì)胞因子和趨 化因子來(lái)調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在腫瘤免疫、清 除非己細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用。
[0003] 現(xiàn)階段臨床上獲得NK細(xì)胞療法是采用體外培養(yǎng)的方法，把患者自身外周血中的 NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，使細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大數(shù)千倍且細(xì)胞毒活性極大增強(qiáng)，再回輸患者的體內(nèi)。取自 患者自身的細(xì)胞首先限制了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可能性；另外由于外周血中NK細(xì)胞的含量低， 僅占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%-10%，細(xì)胞數(shù)量有限，且目前尚缺乏有效的高純度的體外擴(kuò) 增體系，所以在很大程度上限制了NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用，這種傳統(tǒng)的NK細(xì)胞制備方法并不 是理想的選擇。首先，它主要用于一對(duì)一的個(gè)體化治療方法，只能在醫(yī)院床邊開(kāi)展；第二，這 種治療方法自然殺傷性細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間太長(zhǎng)，至少需要6周，對(duì)于晚期腫瘤病人，尤其是手 術(shù)后放療、化療的病人，在細(xì)胞制備完成或細(xì)胞回輸之前可能就已經(jīng)去世；第三，一對(duì)一的 治療，即每一個(gè)人要做一全套細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)的過(guò)程，在實(shí)驗(yàn)室管理方面，室內(nèi)質(zhì)量控制 很難，室間質(zhì)量控制更難；第四，很多病人本身的NK細(xì)胞就是缺陷的，回輸治療效果有限。
[0004] 目前雖然有大量的研宄集中在尋找不同來(lái)源的CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化的 最佳體系，但是尚未有一種方法能夠簡(jiǎn)便、高效地得到高純度、高數(shù)量、殺傷能力強(qiáng)的NK細(xì) 胞。
[0005] 隨著科研的發(fā)展和進(jìn)步，利用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為NK細(xì)胞成為可能，是一個(gè)極具吸 引力的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。胚胎干細(xì)胞就是其中的佼佼者，胚胎干細(xì)胞具有高度的 未分化性以及很強(qiáng)的增殖能力，能夠分化為人體組織的各種細(xì)胞。目前，人胚胎干細(xì)胞已被 成功地分化為成熟和功能的子集的每一個(gè)胚層，包括細(xì)胞的造血系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題和不足，提供一種由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo) 培養(yǎng)NK細(xì)胞的體外制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中NK細(xì)胞來(lái)源不足、療效限制和難以產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)的問(wèn)題，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供了NK細(xì)胞的體外制備的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，簡(jiǎn)化純化和鑒定細(xì)胞產(chǎn) 物的程序，避免病毒污染造成的危害。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種NK細(xì)胞的體外制備方法，具體 包括以下步驟： (1)胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 采用無(wú)飼養(yǎng)層的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系，胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇后在明膠預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)皿中 貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d后，消化液消化傳代。
[0009] (2)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分化 采用基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)與細(xì)胞因子誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，胚胎干細(xì)胞用2mL分化培養(yǎng)液重 懸后，接種于已經(jīng)預(yù)先鋪有OP9細(xì)胞的6孔板中，放入37°C、5%C02、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，并添加細(xì)胞因子Flt3配體（FL)，白細(xì)胞介素-15 (IL-15)，白細(xì)胞介素-6 (IL-6)，白 細(xì)胞介素-7 (IL-7)，Kit配體（KL)。培養(yǎng)1天，胚胎干細(xì)胞形成懸浮的細(xì)胞集落，把這些細(xì) 胞集落轉(zhuǎn)移到超低吸附培養(yǎng)皿中，并添加上述細(xì)胞因子，2-3天后收集細(xì)胞。
[0010] (3)免疫磁珠分離純化⑶34+細(xì)胞 由于造血干細(xì)胞主要分布于⑶34+細(xì)胞中，因此采用免疫磁珠法純化⑶34 +造血干細(xì) 胞，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)所分離得到的CD34+細(xì)胞純度。
[0011] (4)CD34+細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng) 將純化后的⑶34+細(xì)胞以1.0X104cells/mL密度接種無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37°C、 5%C02、95%飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng)，每7天半量換液。培養(yǎng)液中均含細(xì)胞因子：干細(xì)胞 因子（SCF)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、血小板生成素（TPO)、紅細(xì)胞生成素（EPO)和白細(xì)胞介 素-6 (IL-6)。培養(yǎng)2-3周收集細(xì)胞。
[0012] (5)CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞 CD34+細(xì)胞擴(kuò)增至足夠數(shù)量時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，并添加細(xì)胞因子組合①：干細(xì)胞 因子（SCF)，人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和Flt3配體（FL)，37°C、5%CO# 95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，添加細(xì)胞因子 組合②：白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-12 (IL-12)、白細(xì)胞介素-15 (IL-15)、單克隆 抗體anti-CD3(anti-CD3)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-7(IL-7)，放置于37°C， 5%C02、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)誘導(dǎo)NK細(xì)胞，每三天換液一次，并補(bǔ)充細(xì)胞因子組合②， 誘導(dǎo)4周后流式檢測(cè)CD3TD56+NK細(xì)胞。
[0013] (6)NK細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的步驟（1)胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中采用無(wú)飼養(yǎng)層的DMEM培 養(yǎng)體系，所述的胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液組成是：DMEM培養(yǎng)基，加入20%Knock0ut血清替代物、 0.ImM2-巰基乙醇、100yg/mLL-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白細(xì)胞因子 LIF，0.ImMMEM〇
[0015] 進(jìn)一步的，所述的步驟（2)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分化中采用基質(zhì)細(xì)胞共培 養(yǎng)與細(xì)胞因子誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，所用的胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)液組成是：a-MEM培養(yǎng)基， 體積分?jǐn)?shù)10%Knock0ut血清替代品，100ymol/L硫代甘油（MTG);所用的誘導(dǎo)因子組合為： 5ng/mLFL+ 20ng/mLIL-15 + 20ng/mLIL-6 + 10ng/mLIL-7 +lOng/mLKL。本發(fā)明 采用無(wú)血清造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，避免異源基因的污染。
[0016] 進(jìn)一步的，所述的步驟（4)為獲得足夠多的純凈的⑶34+細(xì)胞，采用先免疫磁珠分 離純化⑶34+細(xì)胞，后擴(kuò)大培養(yǎng)⑶34+細(xì)胞的方法，并且培養(yǎng)過(guò)程中采用無(wú)血清培養(yǎng)基：MDM 培養(yǎng)基，5X1O_5M0 -巰基乙醇、1%BSA、0. 01mg/mL胰島素、0? 7mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2X10_6M膽 固醇、20mmol/100mLL-谷氨酰胺；擴(kuò)增培養(yǎng)中所用的因子組合為50ng/mLSCF+ 20ng/mL IL-3 + 4U/mLTPO+ 3U/mLEPO+ 20ng/mLIL-6。
[0017] 進(jìn)一步的，所述的步驟（5) CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞中采用細(xì)胞因子多次誘導(dǎo) 的方法來(lái)獲取足夠的NK細(xì)胞，所用的細(xì)胞因子組合①為：30ng/mL SCF+30ng/mL GM-CSF +5ng/mL FL;所用的細(xì)胞因子組合②為：10ng/mL IL-2+20ng/mL IL-12+20ng/mL IL-15 + lOng/mL anti_CD3 + 20ng IL-4 + lOng/mL IL_7〇
[0018] 本發(fā)明的制備方法具備以下優(yōu)點(diǎn)： (1)解決NK細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題，為NK細(xì)胞治療提供了新的思路。
[0019] (2)采用無(wú)血清培養(yǎng)簡(jiǎn)化了純化和鑒定細(xì)胞產(chǎn)物的程序，避免了病毒污染造成的 危害。
[0020] (3)在胚胎干細(xì)胞定向造血細(xì)胞分化階段，首創(chuàng)添加了誘導(dǎo)因子5ng/mLFL、20ng/ mLIL_15、20ng/mLIL_6、10ng/mLIL_7、10ng/mLKL，顯著縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間，提高了造 血細(xì)胞的活率。
[0021] (4)在造血細(xì)胞定向分化為NK細(xì)胞階段創(chuàng)造性地進(jìn)行了二次誘導(dǎo)，在接種階段 添加了誘導(dǎo)因子組合①：30ng/mLSCF、30ng/mLGM-CSF、5ng/mLFL，培養(yǎng)兩天以后，添加誘 導(dǎo)因子組合②：10ng/mLIL-2、20ng/mLIL-12、20ng/mLIL-15、10ng/mLanti-CD3、20ng IL-4、lOng/mLIL-7。經(jīng)過(guò)該方法所獲得的NK細(xì)胞活性高，能達(dá)到97%以上，且NK細(xì)胞的 腫瘤殺傷效果顯著。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中： 圖1是NK細(xì)胞的體外制備方法的技術(shù)方案實(shí)施流程圖。
[0023] 具體實(shí)施方法 下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。參照?qǐng)D1 :NK細(xì)胞的體外制備方法 的技術(shù)方案實(shí)施流程圖所示，本發(fā)明【具體實(shí)施方式】如下： 實(shí)施例1胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)： 1.將液氮中保存的胚胎干細(xì)胞與37 °C水浴，快速溶化，細(xì)胞懸液由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。
[0024]2.將上述細(xì)胞懸液接種于明膠預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)皿中，放置于37°C，5%C02、95%飽和 濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d，細(xì)胞融合度達(dá)到85%-90%后，用消化液消化傳代。
[0025] 3.按照1:3-1:5傳代到新的培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0026] 4.每2-3d用消化液消化傳代。
[0027] 實(shí)施例2誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化 1.使用前1天將凍存的0P9細(xì)胞，以1. 5X105cells/mL細(xì)胞濃度接種到預(yù)鋪有明膠 的6孔培養(yǎng)板中。
[0028] 2.第2天將胚胎干細(xì)胞離心，