一種重組慢病毒載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組慢病毒載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前常用的基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄報(bào)告載體由于其染色體外游離的特性，會(huì)干擾研究的 報(bào)告網(wǎng)絡(luò)。而基于慢病毒的報(bào)告載體可以整合到細(xì)胞染色體中，從而為研究轉(zhuǎn)錄激活以及 表觀遺傳學(xué)效應(yīng)提供較為精確的模型。
[0003] Clontech公司的pLVX-DD-ZsGreenl慢病毒報(bào)告載體是一種無(wú)啟動(dòng)子報(bào)告載體， 其報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白DD-ZsGreenl，可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)正在分裂和非分裂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 用于檢測(cè)不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。然而該載體用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的標(biāo)記為嘌呤霉素 (puromycin)，它對(duì)細(xì)胞的毒性較大，容易造成細(xì)胞死亡。
[0004] Clontech公司的pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體（CatalogNo. 632187)含有組 成型活性人類(lèi)巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子（PCMVIE)，在該啟動(dòng)子上游多克隆位點(diǎn)可以插 入感興趣的蛋白編碼序列，這樣利用同一啟動(dòng)子表達(dá)一個(gè)雙順?lè)醋觤RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而同 時(shí)產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì)。因此，該表達(dá)載體不能用于研究調(diào)控元件如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn) 錄活性等功能。
[0005] 因此，有必要提供一種對(duì)細(xì)胞毒性小、能用于分析啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的功能或 調(diào)控作用的慢病毒報(bào)告載體，尤其有必要提供一種對(duì)細(xì)胞毒性小、能用于分析啟動(dòng)子和/ 或增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性的慢病毒報(bào)告載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種重組慢病毒載體，所述重組慢病毒 載體是在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處內(nèi)插入了螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基 因序列。該重組慢病毒載體含有ZsGreen綠色熒光蛋白編碼基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基 因雙熒光標(biāo)記，該重組慢病毒載體在分析啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的功能或調(diào)控作用的應(yīng)用中 對(duì)細(xì)胞的毒性較小。本發(fā)明提供的重組慢病毒載體尤其適用于分析啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的 轉(zhuǎn)錄活性。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如第一方面所述的重組 慢病毒載體。本發(fā)明第三方面提供了一種重組載體的制備方法。本發(fā)明第五方面提供了一 種重組慢病毒載體的應(yīng)用。
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種重組慢病毒載體，所述重組慢病毒載體是在 pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處內(nèi)插入了螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因序列。
[0009] 螢火蟲(chóng)熒光素酶能夠催化不同底物氧化發(fā)光，熒光素酶濃度在l(T16m〇l/L到 l(T8m〇l/L的范圍內(nèi)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與酶濃度成正比，其檢測(cè)靈敏度高，半衰期短，所以，調(diào)控 螢火蟲(chóng)熒光素酶的啟動(dòng)子的活性改變會(huì)即時(shí)導(dǎo)致熒光素酶活性的改變，而熒光素酶不會(huì)積 累，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化即可反映啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的活性的變化。
[0010] 本發(fā)明在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處內(nèi)插入了螢火蟲(chóng)熒光素 酶編碼基因序列，構(gòu)建了專(zhuān)門(mén)用于分析啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的功能或調(diào)控作用的重組慢病 毒載體，該載體具有ZsGreenl和螢火蟲(chóng)熒光素酶雙熒光標(biāo)記，適用于分析啟動(dòng)子和/或增 強(qiáng)子的功能或調(diào)控作用，尤其適用于分析啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
[0011] 本發(fā)明采用的pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體含有ZsGreen綠色熒光蛋白的突 變體，該ZsGreen綠色熒光蛋白的突變體可作為用于細(xì)胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選標(biāo)記，對(duì)細(xì)胞 毒性小。克服了pLVX-DD-ZsGreenl采用嘌呤霉素（puromycin)作為篩選標(biāo)記導(dǎo)致的對(duì)細(xì) 胞的毒性較大，容易造成細(xì)胞死亡的缺點(diǎn)。
[0012] IRES序列為核糖體提供不依賴(lài)帽子結(jié)構(gòu)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯時(shí)，不經(jīng)過(guò)mRNA 的5'端掃描，也不需要宿主細(xì)胞的某些關(guān)鍵因子的參與，具有IRES序列的病毒可逃脫宿主 通過(guò)這些關(guān)鍵因子的下調(diào)或失活來(lái)抑制病毒基因的表達(dá)。因此，pLVX-IRES-ZsGreenl含有 腦心肌炎病毒（EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)，該IRES位于MCS與ZsGreenl之間，幫 助不依賴(lài)于帽子的ZsGreenl從IRES/ZsGreenl結(jié)合處的一個(gè)內(nèi)部起始位點(diǎn)進(jìn)行翻譯，能進(jìn) 一步提高ZsGreenl報(bào)告蛋白的表達(dá)效率。
[0013] 優(yōu)選地，所述螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因序列是luc或Renilla熒光素酶的編碼基 因序列。
[0014] 優(yōu)選地，所述螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因序列是核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示的 DNA分子。
[0015] 優(yōu)選地，所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處內(nèi)還插入有待分析 的啟動(dòng)子和/或調(diào)控目標(biāo)蛋白的調(diào)控序列，所述待分析的啟動(dòng)子和/或調(diào)控目標(biāo)蛋白的調(diào) 控序列插入在所述螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因序列的上游。
[0016] 優(yōu)選地，所述螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因序列插入在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒 載體的Clal酶切位點(diǎn)。
[0017] 本發(fā)明采用pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體為基礎(chǔ)載體構(gòu)建含螢火蟲(chóng)熒光素酶 編碼基因的重組慢病毒載體，該重組慢病毒載體含有pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體和 含螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因的雙重優(yōu)勢(shì)。除上述含螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因帶來(lái)的優(yōu)勢(shì) 外，pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)如下：
[0018] 1、含有產(chǎn)生非復(fù)制性慢病毒的所有的病毒加工元件，也含有改善病毒滴度、轉(zhuǎn)基 因表達(dá)和整個(gè)載體功能的元件。如：土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（WPRE)啟動(dòng)RNA的加 工并增強(qiáng)病毒RNA的出核運(yùn)輸，使得從細(xì)胞中包裝的病毒滴度增加；而且，載體含有Rev應(yīng) 答元件（RRE)，通過(guò)增強(qiáng)非剪接病毒RNA的出核運(yùn)輸來(lái)進(jìn)一步增加病毒滴度；另外，載體還 含有一個(gè)關(guān)鍵多嘌呤片段/關(guān)鍵終止序列元件（cPPT/CTS)，在靶細(xì)胞感染過(guò)程中，這個(gè)元 件可以產(chǎn)生一種關(guān)鍵DNA震動(dòng)結(jié)構(gòu)，增加病毒基因組的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，使得載體整合以及轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率增加。
[0019] 2、載體含有pUC復(fù)制起始位點(diǎn)和E.coli氨芐青霉素抗性基因（Ampr)可用于細(xì)菌 篩選標(biāo)記。
[0020] 第二方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，包含如第一方面所述的重組慢病毒載體。
[0021] 優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0022] 優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為Jurkat細(xì)胞。
[0023] 第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的重組慢病毒載體的制備方法，包 括如下步驟：
[0024] (1)、提供或制備螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因的上游引物和下游引物,及螢火蟲(chóng)熒光 素酶編碼基因的模板，然后采用PCR擴(kuò)增螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因；
[0025] (2)、取pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體，將步驟（1)擴(kuò)增得到的螢火蟲(chóng)熒光素酶 編碼基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處，得到所述重組慢病 毒載體。
[0026] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述上游引物和下游引物的堿基序列分別如SEQID NO:2 和SEQIDNO:3 所示。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因的模板為含有螢火蟲(chóng)熒光 素酶編碼基因序列的重組載體PGL4. 10。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，為采用In-fusion重組的方法將步驟（1)擴(kuò)增得到的螢 火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的第2180bp處。
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，將步驟（1)擴(kuò)增得到的螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因克隆到 所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒載體的Clal酶切位點(diǎn)。
[0030] 具體地，所述如SEQIDN0:2所示的上游引物具體為：
[0031] 5' -CTCCCAAGCTTATCGATGGCCTAACTGGCCGGTA