肽導(dǎo)向的蛋白敲低的制作方法
【專利說明】肽導(dǎo)向的蛋白敲低 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及可被用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白表達(dá)的重組核酸 和蛋白構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明的方面涉及采用將靶向蛋白引導(dǎo)至溶酶體進行降解的構(gòu)建 體的肽介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞蛋白的敲低（knockdown)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 用于改變內(nèi)源性蛋白的表達(dá)水平的快速和可逆的方法，不僅對于研宄復(fù)雜的生物 系統(tǒng)是不可或缺的工具，而且可以潛在地推動許多疾病治療的新療法的研發(fā)。通過靶向DNA 或mRNA來操作蛋白表達(dá)和功能的技術(shù)已經(jīng)被證明是強大的工具，但通常被如缺乏特異性、 速度、可逆性和可調(diào)性的問題困擾另外，它們的在治療人類疾病中的治療用途可能被缺 乏有效的全身遞送系統(tǒng)所阻礙 2。
[0004] 為了克服基于DNA和mRNA的蛋白操作的缺點2,已經(jīng)嘗試?yán)茫╤arness)細(xì)胞蛋 白降解系統(tǒng)來降低感興趣的蛋白的水平3_6。這些建議的系統(tǒng)中許多要求蛋白的遺傳操作以 便于它們靶向和經(jīng)特異性細(xì)胞蛋白降解系統(tǒng)進行降解、
[0005] 細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域（CMPDs)(也稱作細(xì)胞穿透肽（CPPs)或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (PTDs))是介導(dǎo)穿過細(xì)胞膜的易位的蛋白結(jié)構(gòu)域，如來自HIV-1病毒的Tat蛋白和黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster)觸足（Antennapedia)同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain)38'39'40。 [0006] 發(fā)明概述
[0007]在一個方面，本發(fā)明涉及基于肽的系統(tǒng)，其能夠通過采用內(nèi)源性溶酶體依賴的 自噬系統(tǒng)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA)產(chǎn)生非遺傳修飾的天然蛋白的快速和可逆的敲 低（圖la)。CMA是一類導(dǎo)致底物蛋白以一個分子接著一個分子為基礎(chǔ)的選擇性攝取 的自噬作用。這種特異性是通過CMA-靶向信號（CTS)實現(xiàn)的，其在一些實例中可以涉 及五肽基序KFERQ。CTS對于誘導(dǎo)CMA是必須的，并被發(fā)現(xiàn)于迄今為止CMA的所有底物 蛋白中。為了將CMA用于靶蛋白降解，本發(fā)明的肽包含能夠特異性識別并結(jié)合至靶蛋 白的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域被融合至能夠?qū)㈦?蛋白復(fù)合體遞送進入溶酶體進 行降解的CTS。本發(fā)明的肽可以進一步包含能夠?qū)㈦倪f送穿過質(zhì)膜的細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu) 域（CMPD)(如圖1中所示的實施例）。CMPD可以是HIV-lTat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域， GRKKRRQRRRPPQ;黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸），RQIKWFQNRRMKWKK;抗 菌肽BuforinII，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸）（人Clock 蛋白DNA結(jié)合肽），KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA;K-FGF， AAVALLPAVLLALLAP;Ku70 衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或PMLK;朊 病毒（Prion)，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC， LLIILRRRIRKQAHAHSK;P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運 素（Transportan)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運素-10,AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺（cysteamide) ;P印-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1， TSPLNIHNGQKL;VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它 已知的CMTO。
[0008] 因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了敲低靶向肽組合物，其包含融合至蛋白結(jié) 合結(jié)構(gòu)域（PBD)的CMA-靶向信號（CTS)，其中所述蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠選擇性結(jié) 合至內(nèi)源性蛋白的多肽序列，從而在細(xì)胞環(huán)境中將所述敲低靶向肽與所述內(nèi)源性蛋白 的接觸會引起內(nèi)源性蛋白的溶酶體降解。所述靶向肽組合物可以進一步包含細(xì)胞膜 穿透結(jié)構(gòu)域（CPMD)。CMPD可以是HIV-lTat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，GRKKRRQRRRPPQ; 黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸），RQIKWFQNRRMKWKK;BuforinII， TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸）（人Clock蛋白DNA結(jié)合肽）， KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA;K-FGF，AAVALLPAVLLALLAP; Ku70衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或PMLK;骯病毒，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC，LLIILRRRIRKQAHAHSK; P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運素（Transportan)， GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運素-10，AGYLLGKINLKALAALAKKIL;CADY， Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺（cysteamide) ;Pep-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1， TSPLNIHNGQKL;VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它 已知的CMTO。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了肽，其包含CMA-靶向信號結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的蛋 白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個方面，所述靶蛋白是內(nèi)源性靶蛋 白。在另一個方面，所述肽是被全身施用至動物，以降低內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞表達(dá)水平。
[0010] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降低有需要的動物中靶蛋白的 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的方法。當(dāng)被體外使用時，所述方法包括靶蛋白和包含CTS結(jié)構(gòu)域和選擇 性結(jié)合至靶蛋白的PBD的肽的共表達(dá)。所述體內(nèi)方法包括給有需要的動物施用本文所述的 肽，其包括CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的PBD，以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域。
[0011] 還提供了包含CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的PBD以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域的 肽用于體外或體內(nèi)降低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的用途。還提供了本文所述的肽用于制備 降低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的藥物的用途。在另一個方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降 低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的本文所述的肽。
[0012] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了期望敲低特定內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞表達(dá)的治療疾病 的方法，所述方法包括給患有或被懷疑患有這樣的疾病的對象施用治療有效量的敲低靶向 肽，其中所述敲低靶向肽包含融合至蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PBD)的CMA-靶向信號（CTS)，其中 所述蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠選擇性結(jié)合至內(nèi)源性蛋白的多肽序列。所述敲低靶向肽可以進 一步包含能夠?qū)⑺鲭倪f送穿過質(zhì)膜的細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域（CPMD)。CMPD可以是HIV-lTat 蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，GRKKRRQRRRPPQ;黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸）， RQIKWFQNRRMKWKK;BuforinII，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸） (人Clock蛋白DNA結(jié)合肽），KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA; K-FGF，AAVALLPAVLLALLAP;Ku70 衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或 PMLK;朊病毒，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC， LLIILRRRIRKQAHAHSK;P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運 素（Transportan)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運素-10,AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺；P印-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1，TSPLNIHNGQKL; VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它已知的CMPD。 [0013] 在另一個方面，提供了包含CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至內(nèi)源性靶蛋白的PBD以及細(xì) 胞膜穿透結(jié)構(gòu)域的肽用于降低動物中內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療所述動物的 疾病的用途。還提供了本文所述的肽用于制備降低內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療 所述動物的疾病的藥物的用途。在另一個方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降低內(nèi)源性靶蛋 白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療所述動物的疾病的本文所述的肽。
[0014] 本文所述的化合物可以被用于體內(nèi)或體外研宄用途（即非臨床的）以研宄期望 敲低內(nèi)源性蛋白的疾病的備選治療。另外，這些分離的多肽可以被單獨地或作為試劑盒的 一部分用于體內(nèi)或體外研宄以研宄溶酶體降解、編碼所分離的多肽的核苷酸、培養(yǎng)物中和/ 或動物模型中所維持的細(xì)胞的機制。
[0015] 內(nèi)源性革巴蛋白可以是任意內(nèi)源性天然蛋白，其具有結(jié)合伴侶（partner)或其結(jié)合 結(jié)構(gòu)域序列是已知的或能夠獲得的。例如，所述靶蛋白可以是a-突觸核蛋白、突觸后密度 蛋白（PSD95)、死亡相關(guān)蛋白激酶l(DAPKl)或其肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)或者能夠被鑒定的任 何胞漿蛋白激酶。
[0016] 因此，本發(fā)明還涉及能夠靶向并敲低a_突觸核蛋白（涉及神經(jīng)退行性突觸核蛋 白病如帕金森氏病的蛋白）的新的敲低靶向肽組合物。在一個方面，提供了與SEQIDNO: 1 具有實質(zhì)性相似性的分離的多肽。在另一個方面，提供了與SEQIDNO: 1任一具有至少90% 同一性的分離的多肽，其中所述同一性可以針對序列的整個長度進行計算，并且其中所述 分離的多肽引起突觸核蛋白的降解。在另一個方面，提供了與SEQIDN0:1任一具有 至少95%同一性的分離的多肽，其中所述同一性可以針對序列的整個長度進行計算，并且 其中所述分離的多肽引起突觸核蛋白的降解。在另一個方面，提供了包含SEQIDN0:1 任一的分離的多肽。
[0017] 所述分離的多肽可以引起a-突觸核蛋白的降解或敲低。所述分離的多肽可以進 一步包括綴合至所述分離的多肽的遞送和革G向部分（moiety)。所述遞送和祀向部分可以選 自以下一種或多種：配體；蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)