RL B-50173)的所有鑒定特征的菌株。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，其中所述菌株可以是屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或 具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢桿菌菌株8G_134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株。
[0039]還提供了制備直接飼喂微生物的方法。在該方法中，使選自由下列組成的組的菌 株生長在液體營養(yǎng)肉湯中：屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)和短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。將所述菌株從液體營養(yǎng)肉湯分離 以制備直接飼喂微生物。在該方法的至少一些實(shí)施方案中，所述菌株被冷凍干燥。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，其中所述菌株可以是屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)或具 有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，其中所述菌株可以是屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或 具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢桿菌菌株8G_134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株。
[0043] 另外提供了制備直接飼喂微生物的方法。在該方法中，使選自由下列組成的 組的菌株生長在液體營養(yǎng)肉湯中：屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株 8G-73(NRRL B-50172)和短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。將所述菌株從液體營 養(yǎng)肉湯分離以制備直接飼喂微生物。添加莫能菌素至所述直接飼喂微生物。
[0044] 附圖簡沐
[0045] 在所附的附圖中圖示了本文所述的優(yōu)選的示例性實(shí)施方案，其中整個(gè)附圖中同樣 的指示數(shù)字代表同樣的部分，并且其中：
[0046] 圖1是顯示測(cè)試群體（非酸中毒的，集群2)和驅(qū)動(dòng)群體（酸中毒的，集群1)之間 的pH差異的圖。
[0047] 圖2是顯示測(cè)試群體（非酸中毒的，集群2)和驅(qū)動(dòng)群體（酸中毒的，集群1)之間 的乳酸積累差異的圖。
[0048] 圖3是顯示體外葡萄糖隨處理時(shí)間變化的圖。
[0049] 圖4是顯示體外乳酸積累隨處理時(shí)間變化的圖。
[0050] 圖5是顯示總VFA (乙酸+丙酸+ 丁酸）積累隨時(shí)間變化的圖。
[0051] 圖6是顯示對(duì)照和候選DFM牛中平均瘤胃pH隨時(shí)間變化的圖。
[0052] 圖7是顯示對(duì)照和候選DFM牛中平均瘤胃乳酸隨時(shí)間變化的圖。
[0053] 圖8是顯示瘤胃VFA濃度隨處理時(shí)間變化的圖。（總VFA =乙酸+丙酸+ 丁酸）。
[0054] 在詳細(xì)解釋本文所述的實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于應(yīng)用于在下面的說 明書中所述的或在附圖中所圖示的組分的構(gòu)造和排列的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方 案或能夠以多種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。并且，?yīng)理解本文所采用的措辭和術(shù)語是為了說明的目 的并且不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的。
[0055] 詳沭
[0056] 本文提供了菌株。還提供了制備和使用所述菌株的方法。
[0057] 在至少一些實(shí)施方案中，用一種或多種本文所提供的菌株制備的直接飼喂微生物 (DFM)容許牛肉和牛奶生產(chǎn)者繼續(xù)管理飼喂方案以優(yōu)化生長和性能，而不會(huì)由于伴隨瘤胃 酸中毒的消化失常而犧牲健康。DFM的至少一些實(shí)施方案是基于經(jīng)由乳酸利用或促使瘤胃 維持乳酸利用微生物群來管理瘤胃乳酸濃度而選擇的。DFM的至少一些實(shí)施方案被開發(fā)用 于管理瘤胃能量濃度。與目前售給牛生產(chǎn)者的減輕酸中毒的DFM不同，本發(fā)明的至少一些 實(shí)施方案并非被開發(fā)用于在問題出現(xiàn)之后管理問題，而是在其發(fā)生之前減輕問題。
[0058]菌株:
[0059] 本文提供的菌株包括：屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌 菌株8G-134,它們?cè)诒疚闹羞€分別被稱為8G-l、8G-73和8G-134。
[0060]菌株屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134 于2008年8月29日被保藏在美國北方農(nóng)業(yè)研宄培養(yǎng)物保藏中心（Agricultural Research Service Culture Collection, NRRL),1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604,并分別被給予登錄號(hào) B-50173、B-50172 和 B-50174。該 保藏是根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序目的的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定進(jìn)行的。本文所 提供的一種或多種菌株可以用作直接飼喂微生物（DFM)。
[0061] 為了本公開內(nèi)容的目的，"生物上純的菌株"意指不含有足以干擾所述菌株的復(fù)制 或可被正常細(xì)菌學(xué)技術(shù)檢測(cè)的量的其他細(xì)菌菌株。"分離的"在與本文所述的生物體和培養(yǎng) 物一起使用時(shí)，不僅包括生物上純的菌株，還包括不像它們天然存在的那樣生長或維持的 任何生物體培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，菌株是也提供與8G-l、8G-73和8G-134所提供的益 處相當(dāng)?shù)囊嫣幍木?G-l、8G-73或8G-134的突變體、變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中， 菌株是具有菌株8G-l、8G-73或8G-134的所有鑒定特征的菌株。此外，各單獨(dú)菌株（8G-1、 8G-73或8G-134)或這些菌株的任何組合也可提供一種或多種本文所述的益處。還應(yīng)清楚 的是，添加其他微生物菌株、載體、添加劑、酶、酵母或類似物也將提供酸中毒的控制并且不 會(huì)構(gòu)成實(shí)質(zhì)上不同的DFM。
[0062] 桿菌（Bacillus)菌株具有使得它們可用作DFM的許多品質(zhì)。例如，幾種桿菌物種 還具有GRAS狀態(tài)，即，它們一般被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可為安全的，并且還被美國 飼料管理官員協(xié)會(huì)（AAFC0)批準(zhǔn)用于動(dòng)物飼料。本文所述的桿菌菌株是需氧的和兼性的產(chǎn) 孢菌類并且因此是穩(wěn)定的。桿菌物種是被認(rèn)為GRAS的僅有的產(chǎn)孢菌類。發(fā)現(xiàn)的一種預(yù)防 或治療酸中毒的桿菌菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134。
[0063] 腸球菌菌株也具有使得它們可用作DFM的許多品質(zhì)。
[0064] 已知腸球菌菌株定殖在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物的胃腸道，并且適于在這種環(huán)境下存 活。已顯示腸球菌是兼性厭氧的生物體，這使得它們?cè)谛柩鹾腿毖鯒l件下都是穩(wěn)定的和有 活性的。發(fā)明人將屎腸球菌菌株8G-1和屎腸球菌菌株8G-73鑒定為可用于這些目的。
[0065] 菌株的制各
[0066] 在至少一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)的液體或固體發(fā)酵技術(shù)分別培養(yǎng)每一種本文所 述的菌株。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，桿菌菌株和腸球菌菌株在液體營養(yǎng)肉湯中生長，在桿菌 的情況下，生長至形成最高孢子數(shù)目的水平。桿菌菌株是通過發(fā)酵細(xì)菌菌株制備的，這可以 通過成比例增加種菌培養(yǎng)來開始。這包括重復(fù)且無菌地將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至大得多的體積中以 充當(dāng)發(fā)酵的接種物，這可以在大的不銹鋼發(fā)酵罐中在含有最佳生長所必需的蛋白、碳水化 合物和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行。非限制性的示例性培養(yǎng)基是MRS或TSB。然而，也可以使用 其他培養(yǎng)基。在將接種物添加至發(fā)酵器皿中之后，控制溫度和攪拌以容許最大的生長。在一 個(gè)實(shí)施方案中，菌株在攪拌條件下在32°至37°生長。在培養(yǎng)物達(dá)到最大群體密度之后， 通過從發(fā)酵培養(yǎng)基分離細(xì)胞來收獲培養(yǎng)物。這通常通過離心來進(jìn)行。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，為制備桿菌菌株，將桿菌菌株發(fā)酵至5X108CFU/ml至約 4X109CFU/ml的水平。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，使用2X109CFU/ml的水平。通過離心收獲 細(xì)菌，并且移除上清液。然后可以使用沉淀的細(xì)菌來制備DFM。在至少一些實(shí)施方案中，將 沉淀的細(xì)菌冷凍干燥，然后用于形成DFM。然而，在使用桿菌之前并不必需將桿菌冷凍干燥。 還可以在具有或不具有防腐劑，并且以濃縮的、非濃縮的或稀釋的形式使用菌株。
[0068] 然后可以確定培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)。CFU或菌落形成單位是由標(biāo)準(zhǔn)微生物鋪板方法所得 的樣品的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。該術(shù)語是由在單個(gè)細(xì)胞被鋪板在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中將在瓊脂培養(yǎng)基中 生長并變?yōu)榛畹木涞氖聦?shí)衍生而來。由于多個(gè)細(xì)胞可能產(chǎn)生一個(gè)可見的菌落，因此術(shù)語 菌落形成單位是比細(xì)胞數(shù)目更有用的單位量度。
[0069] 伸用菌株:
[0070] 在至少一些實(shí)施方案中，使用一種或多種菌株來形成DFM。可以將一種或多種載體 添加到菌株中，所述一種或多種載體包括但不限于：蔗糖、麥芽糖糊精、石灰石和稻殼。
[0071] 為了混合菌株和載體（使用時(shí)），可以將他們添加至螺帶式混合器或葉片式混合 器中并優(yōu)選地混合約15分鐘，盡管可以增加或降低時(shí)間。將組分共混以便得到培養(yǎng)物和載 體的均一混合物。最終產(chǎn)物優(yōu)選是干燥的、可流動(dòng)的粉末，并且可以基于終產(chǎn)物中期望的 DFM終濃度來配制。
[0072] 在制備DFM的方法的至少一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的菌株生長在培養(yǎng)基中，例 如液體營養(yǎng)肉湯。將所述菌株從液體營養(yǎng)肉湯分離以制備直接飼喂微生物。在將菌株從肉 湯分離之后可以將其冷凍干燥。
[0073] 可以將屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134的一 種或多種飼喂給動(dòng)物以降低或甚至消除酸中毒的出現(xiàn)。對(duì)于此，將有效量的一種或多種的 這些菌株施用給動(dòng)物。在施用給動(dòng)物之后，所述菌株在動(dòng)物中或?yàn)閯?dòng)物提供下列益處的至 少一種：(a)降低動(dòng)物中的酸中毒；(b)如延遲的乳酸積累和延長的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生所表 明的，穩(wěn)定瘤胃代謝；(c)如pH恢復(fù)和乳酸降低所度量的，更迅速地從酸中毒攻擊中恢復(fù)； 以及（d)不表現(xiàn)與酸中毒相關(guān)的臨床體征。
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