過表達BnNRT1-3基因提高油菜氮素利用率的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)領域，具體設及過表達化NRT1-3基因提高油菜氮素 利用率。
【背景技術(shù)】
[0002] 氮素（腳對植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成起著至關重要的作用。我國是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大 國，廣泛種植有水稻、玉米、小麥、油菜、棉花等農(nóng)作物。雖然我國的耕地面積只有全球耕地 面積的8%左右，但化肥（氮肥）使用量卻占到了全球的1/3,接近35%。究其原因，主要 有W下兩個方面；一是我國農(nóng)作物的氮肥利用效率低，如水稻、玉米和小麥氮肥平均利用率 為28. 7% (目湘等，2008)，油菜氮肥平均表觀利用率為34.6% (鄒娟等，2011)，遠遠低于 發(fā)達國家的50%W上；二是我國在氮肥使用上存在不合理之處，往往發(fā)達地區(qū)用量過剩而 貧困地區(qū)用量不足，該進一步導致了氮肥的有效利用率下降。氮肥的使用量過多W及氮素 利用率下降導致了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的急劇惡化，同時也帶來了諸多環(huán)境問題，如±壤酸化、水 體富營養(yǎng)化W及臭氧層破壞等。因此，提高氮素利用效率，減少氮肥使用量，不僅有利于農(nóng) 作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，提高農(nóng)作物品質(zhì)，更能促進農(nóng)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 關于提高植物氮素利用效率，目前的研究往往集中在如何通過優(yōu)化氮肥管理、合 理施用氮肥W及改革種植制度等措施來實現(xiàn)，但實際操作存在一定的障礙，因為不同的作 物對氮肥的需求在量上和時間上均存在差異，無法形成統(tǒng)一的標準。雖然在氮營養(yǎng)高效種 植資源的收集、鑒定與篩選方面有一些報道，如水稻（童漢華等，2007)、玉米（周聯(lián)東等， 2003)、棉花（韓踰和張薇，2011)中，W期解析氮高效的遺傳基礎，但進展緩慢。植物主要是 從±壤中獲取氮營養(yǎng)元素的，該其中設及到一系列的N吸收與轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。硝態(tài)氮是植物利 用氮素的主要形態(tài)，硝酸鹽轉(zhuǎn)運子在植物的N吸收與轉(zhuǎn)運方面起著重要的作用。
[0004] 植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運子包含兩個基因家族，其中NRT1/PTR基因家族主要為低親和轉(zhuǎn) 運子，稱為低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（LATS) ;NRT2基因家族為高親和轉(zhuǎn)運子，稱為高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng) (HATS)，在外界硝酸根離子濃度很低時發(fā)揮作用。正常情況下，植物對硝態(tài)氮的吸收主要 依賴于LATS。目前在擬南芥中研究得比較清楚的LATS成員主要有AtNRTl. 1、AtNRTl. 2、 AtNRTl. 3、AtNRTl. 4、AtNRTl. 5、AtNRTl.6、AtNRTl. 7、AtNRTl.8和AtNRTl. 9(Wanget al.，2012)。其中AtNRTl. 1 和AtNRTl. 2 負責N的吸收（Liuetal.，1999;Okamotoet al.，2003) ;AtNRT1.4對維持葉片的硝酸根離子穩(wěn)態(tài)有重要作用（化iuetal.，2004); AtNRTl. 5、AtNRTl.6、AtNRTl.8和AtNRTl. 9 與N的轉(zhuǎn)運相關（Linetal.，2008;Almagro etal.，2008;Lietal.，2010;Wangetal.，2011) ;AtNRT1.7 負責N的再利用（Fanet al.，2009)。AtNRTl. 3是誘導型的N轉(zhuǎn)運子，其功能研究還不清楚。有研究表明，在豆科模 式植物裝襲首猜（Medicagotruncatula)中，化NRT1.3為雙親和型轉(zhuǎn)運子，在植物缺氮時 上調(diào)表達，促進植物對N的吸收（Mor紅e-Leetal.，2011)。另外在小麥中，與AtNRT1.3同 源的基因TaNPF6.6的表達模式和對N的反應亦不同于擬南芥，其在根中表達且對缺氮表現(xiàn) 為上調(diào)表達化uchnerandHawkesford，2014)。由此可見，NRTL3基因的功能在不同的物 種中有所差異，總體來看其對植物N的吸收與利用具有正向效應。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是確定甘藍型油菜中化NRT1-3基因在N吸收與利用方面的功能，設 及化NRT1-3在提高植物氮素利用效率方面的應用，W培育氮高效的農(nóng)作物。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明首先克隆了甘藍型油菜中NRT1. 3的同源基因，申請人將該基因命名為 化NRT1-3基因，在CaMV35S啟動子控制下在甘藍型油菜中過量表達化NRT1-3基因，能提高 油菜的氮素利用效率。
[000引所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運子化NRT1-3基因的核巧酸序列如序列表SEQIDNO;l中第 1-1914位堿基所示的序列所示，其對應的氨基酸序列如SEQIDNO;1中第1-1914位堿基 所不的序列所不，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQIDNO;1所不。
[0009] 該基因調(diào)控甘藍型油菜對氮素利用效率的提高主要表現(xiàn)為增加了植株干物質(zhì)的 量。
[0010] 利用引物對F46和R46-U見序列表SEQIDN0;3,4)，通過RT-PCR技術(shù)從甘藍型 油菜中克隆硝酸鹽轉(zhuǎn)運子化NRT1-3基因，然后利用該基因構(gòu)建植物過表達載體，進行植物 轉(zhuǎn)基因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植株。研究結(jié)果表明化NRT1-3過表達植株的氮素利用效率明顯高 于野生型（WT)。
[0011] 本發(fā)明確定了化NRT1-3基因在提局植物氮素利用效率方面的作用，為利用轉(zhuǎn)基 因的手段培育氮高效的植物奠定了基礎。
【附圖說明】
[001引 1、序列表SEQIDN0;1是本發(fā)明克隆的化NRT1-3基因的核巧酸序列，序列長度為 1914bp，其中178-1914位堿基對應的序列是該基因的CDS區(qū)，編碼578個氨基酸序列。
[001引 2、序列表SEQIDNO;2是本發(fā)明克隆的化NRT1-3基因編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0014] 3、SEQIDNO;3和SEQIDNO;4是擴增化NRT1-3基因的特異引物對，我們將其命 名為引物F46和引物R46-1 ;其中；BnACT2-F/BnACT2-R為BnActin2內(nèi)參基因的擴增引物。
[0015] 圖1 ;本發(fā)明的其中一個實施例的過表達植物表達載體地nNRTl-3的構(gòu)建。圖1中 的A圖為PCAMBIA1300載體圖；圖1中的B圖為pCAMBIA1300s載體示意圖；圖1中的C圖 為本發(fā)明構(gòu)建的地nNRTl-3載體的示意圖。
[0016] 圖2 ;BnNRTl-3過表達轉(zhuǎn)基因株系的表達分析。圖中；WT為野生型（非轉(zhuǎn)基因） 對照，其余編號對應不同的轉(zhuǎn)基因株系。編號1表示轉(zhuǎn)基因株系D-1，編號2表示轉(zhuǎn)基因株 系D-2，W此類推。圖中化NRT1-3的擴增引物對為F46/R46-U引物序列見表1) ;BnActin2 內(nèi)參基因的擴增引物對為BnACT2-F/BnACT2-R(引物序列見表1)。
[0017] 圖3 ;野生型與化NRT1-3過表達株系在不同濃度硝酸鹽生長條件下的干重比較。 過表達植株和野生型植株均在1/4化agland營養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周，之后移入不同硝酸鹽濃度 的1/2化agland營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)生長S周，取地上部分稱取干重，實驗進行兩次重復。其 中WT為野生型對照，D-2、D-19和D-25為S個過表達株系。誤差線為標準偏差，*和**分 別表示轉(zhuǎn)基因植株同野生型植株t測驗在P<0. 05和P<0. 01水平下差異顯著。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1甘藍型油菜化NRT1-3基因的克隆
[0019] 1.克隆甘藍型油菜化NRT1-3基因的cDNA序列
[0020] 根據(jù)甘藍型油菜基因組參考序列（ht1:p://www.genoscope.cns.fr/ brassicanapus/)獲得化NRTl-3的基因組序列信息炬naA05gl9580D)。根據(jù)基因組序列信 息設計引物對F46和R46-U該引物序列見說明書表1和序列表SEQIDN0:3和4)。其中 F46為正向引物，含有甜aI酶切接頭；R46-1為反向引物，含有PstI酶切接頭。由于甘 藍型油菜角果皮和種子的巧片結(jié)果顯示化NRT1-3在角果發(fā)育后期的角果皮中有較強的表 達，于是利用TransZolPlant試劑盒（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取甘藍型油 菜角果發(fā)育42d后的角果皮的RNA(具體操作步驟見試劑盒說明書）。利用RT-PCR的方法， 使用高保真的TransStartFas巧化DNAPolymerase(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司） 擴增化NRT1-3 的cDNA序列。PCR反應條件為 95°Clmin;95°C20s，54°C20s，72°C50s，40 個循環(huán)；72°C5min。將克隆得到的產(chǎn)物連入祀ASY-Blunt載體（購自北京全式金生物技術(shù) 有限公司）中，構(gòu)建測序中間載體，命名為祀ASY-NRT1.3,進行序列測定，驗證克隆序列的 正確性。
[0021] 2.甘藍型油菜的化NRT1-3基因的序列信息和特性分析
[002引甘藍型油菜化NRT1-3基因編碼區(qū)cDNA為1737bp，編碼578個氨基酸?？寺〉玫?的SEQ ID NO ;1序列包含了化NRT1-3基因5' UTR區(qū)段的177個堿基?；疦RT1-3蛋白與 AtNRTl. 3和MtNRTl. 3的同源性分別為89%和70%。通過ProtComp 9. 0軟件預測化NRT1-3 蛋白定位于細胞膜，該與其功能相一致。
[0023] 實施例2化NRT1-3轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0024] 1.含有化NRT1-3編碼區(qū)cDNA表達載體的構(gòu)建
[0025] 將實施例1中包含化NRT1-3基因的pEASY-NRTl. 3載體質(zhì)粒用甜aI和PstI雙 酶切后，將酶切下的片段與用相應酶酶切后的PCAMBIA1300S載體質(zhì)粒的載體部分相連，得 到WCaMV35S啟動子驅(qū)動化NRT1-3過表達的植物表達載體，我們將其命名為地nNRTl-3 載體（如圖1中C圖所示）。其中pCAMBIA1300s載體是通過PCAMBIA1300載體（購自YRGene 公司，貨號；VAC0323)改造而來。首先將pCAMBIA1300載體（如圖l中A圖所示）用Handm 和EcoRI進行雙酶切，切下多克隆位點部分；然后將含